梅春霞,王嘉良,唐楠,余強(qiáng)慶,王順合,王琳琳,王剛,張灝

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

便秘是一種常見(jiàn)的胃腸動(dòng)力障礙疾病,飲食結(jié)構(gòu)、藥物使用、生活方式、結(jié)腸推進(jìn)或直腸排空障礙、菌群失調(diào)、代謝紊亂等因素均與便秘密切相關(guān)。便秘不僅造成人們生理不適,還易引起情緒障礙,已嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。其治療的主要手段是飲食、生活方式干預(yù)、藥物治療(如滲透性瀉藥聚乙二醇、乳果糖、刺激性瀉藥番瀉葉、促分泌藥、促動(dòng)力藥物普蘆卡必利)及手術(shù)治療等。在全球,便秘的發(fā)生率高達(dá)11%～20%[1],而女性便秘的患病率幾乎是男性的2倍[2]。值得注意的是,便秘在兒童和老人中患病率無(wú)差異,猜測(cè)性激素在便秘患病率中可能發(fā)揮著重要的影響作用。

女性比男性更易受到便秘的困擾,這種患病性別差異可能與性激素水平、心理承受能力以及活動(dòng)量等因素有關(guān)。女性在懷孕期、月經(jīng)期經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)便秘加重的癥狀,這就提示我們性激素可能是影響胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素。雌激素作為最主要的性激素之一,可以穿過(guò)細(xì)胞膜,與細(xì)胞質(zhì)中的專一性受體結(jié)合,形成復(fù)合體。雌激素受體(estrogen receptor, ER)包括ERα和ERβ 2種亞型,而ERβ則是結(jié)腸中主要表達(dá)的ER[3]。研究表明,ERβ通過(guò)參與電解質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[4]增加鈉吸收,上調(diào)鈉/氫交換因子3(sodium/hydrogen exchanger 3, NHE3)影響孕期小鼠便秘。ERβ在便秘患者結(jié)腸黏膜層、肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢中的表達(dá)顯著下調(diào)[5]。便秘大鼠結(jié)腸中ERβ蛋白也明顯低于正常對(duì)照組[6]。這些研究均表明ERβ受體下調(diào)可能會(huì)影響便秘。有研究表明,敲除ERβ基因后雌性小鼠通過(guò)ERβ/PI3K/Akt通路下調(diào)大腦中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)蛋白水平[7],BDNF繼而通過(guò)BDNF-PLC-γ/DAG-IP3信號(hào)通路影響了腸神經(jīng)與平滑肌重構(gòu)。這又進(jìn)一步說(shuō)明ERβ受體下調(diào)會(huì)影響宿主的腸神經(jīng)系統(tǒng)。

基于此,本文擬應(yīng)用ERβ受體抑制劑(枸櫞酸他莫昔芬)處理大鼠,以洛哌丁胺處理組作為陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)檢測(cè)糞便含水量、小腸推進(jìn)率及排首粒黑便時(shí)間,判定ERβ受體抑制劑處理組是否可成功構(gòu)建靶向女性便秘的動(dòng)物模型。由于便秘同時(shí)伴有腸屏障的損傷,結(jié)合ERβ受體下調(diào)對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響,本文擬通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)ERβ受體抑制劑(枸櫞酸他莫昔芬)處理對(duì)大鼠腸屏障及腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響,最終探究ERβ在腸蠕動(dòng)中發(fā)揮的重要作用,為構(gòu)建靶向篩選緩解女性便秘的益生菌動(dòng)物模型提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸洛哌丁胺膠囊,西安楊森制藥有限公司;枸櫞酸他莫昔芬片,四川海匯藥業(yè)有限公司;阿拉伯樹(shù)膠粉、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、活性炭粉,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司;大鼠5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)ELISA試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司;大鼠S100β抗體,Abcam公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

24只6周齡雌性SPF級(jí)Sprague Dawley大鼠,南京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)文號(hào):JN.No20211115 s1200201[440],研究遵循的程序符合負(fù)責(zé)動(dòng)物試驗(yàn)委員會(huì)(單位性的、地區(qū)性的或國(guó)家性的)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,噪聲控制在≤60 dB,動(dòng)物照度應(yīng)為15～20 LX。大鼠隨機(jī)均分為4組:正常組(normal control, NC組)、鹽酸洛哌丁胺組(LOP組)、枸櫞酸他莫昔芬組(TAM組)、鹽酸洛哌丁胺+枸櫞酸他莫昔芬處理組(TAM+LOP組)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入干預(yù)期,干預(yù)期持續(xù)7 d,NC組每天灌胃1 mL生理鹽水,LOP組每天灌胃1 mL鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg BW),TAM組每天灌胃1 mL枸櫞酸他莫昔芬懸液(40 mg/kg BW),TAM+LOP組每天灌胃0.5 mL鹽酸洛哌丁胺懸液(10 mg/kg BW)和0.5 mL枸櫞酸他莫昔芬懸液(40 mg/kg BW)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按圖1所示進(jìn)行。試驗(yàn)期間各組大鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料,每周收集大鼠糞便,并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室,保存于-80 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠腹腔注射100 mg/kg BW的氯胺酮麻醉后,腹部主動(dòng)脈取血至死。血液在4 ℃、3 000×g下離心10 min,取血清,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Animal experiment schedule

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糞便含水量

將每只大鼠單獨(dú)放入透氣籠盒中每周收集糞便,稱重后使用凍干機(jī)冷凍干燥,糞便含水量的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.2 首粒黑便時(shí)間

將阿拉伯樹(shù)膠與水以料液比1∶10(g∶mL)混合均勻后加熱至透明,再加入100 g/L的活性炭粉,煮沸3次保證混合均勻。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d測(cè)大鼠排首粒黑便時(shí)間,并在前1 d禁食不禁水12 h。測(cè)定時(shí),每只大鼠灌胃1 mL活性炭溶液,記錄每只大鼠從灌入活性炭溶液開(kāi)始到排出第1粒黑便的時(shí)長(zhǎng),將此時(shí)長(zhǎng)定義為排首粒黑便時(shí)間。比較各個(gè)處理組排首粒黑便時(shí)間與正常組之間的差異,用于說(shuō)明各個(gè)藥物處理組構(gòu)建便秘模型的情況。

1.3.3 小腸推進(jìn)率

大鼠處死前一天禁食不禁水12 h,在處死前1 h,每只大鼠灌胃1 mL上述活性炭溶液。處死后,小心剪取胃至回腸末端,小心展開(kāi)全段小腸,避免拉扯,測(cè)量無(wú)拉伸的小腸總長(zhǎng)度,以及活性炭墨汁自胃在小腸中推進(jìn)的距離,大鼠小腸推進(jìn)率的計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)

采用RT-qPCR測(cè)定大鼠結(jié)腸組織中水通道蛋白AQP3基因、AQP8基因、c-kit基因、Klf4基因、Atoh1基因、Claudin-5蛋白基因。

在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找大鼠AQP3基因、AQP8基因、c-kit基因、Klf4基因、Atoh1基因、claudin-5蛋白基因引物序列,并委托上海生工生物科技有限公司進(jìn)行合成,具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 幾種基因的引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Length of primers and products

取-80 ℃保藏的大鼠結(jié)腸(同一部位)20 mg左右,使用Trizol法提取結(jié)腸總RNA,通過(guò)測(cè)定RNA在OD260/280吸光度比值,檢驗(yàn)其純度及完整性。然后按照試劑盒中說(shuō)明,以提取的總RNA為模板合成cDNA,進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),根據(jù)HiScript III RTSuperMix for qPCR的說(shuō)明配制體系并進(jìn)行RT-qPCR程序運(yùn)行。

1.3.5 蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin)病理染色

將固定后的結(jié)腸組織經(jīng)流水過(guò)夜沖洗,樣品脫水浸蠟后包埋。使用手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切出5 μm的薄片,放入40 ℃的去離子水中進(jìn)行展片,用載玻片將其撈出。之后進(jìn)行脫蠟、H&E染色、脫水與透明。染色完成后使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封藏。待中性樹(shù)膠完全凝固后,放入數(shù)字組織切片掃描機(jī)中進(jìn)行觀察。結(jié)腸組織的病變分析主要測(cè)定上皮細(xì)胞、隱窩和杯狀細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及黏膜厚度。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)

分別從-80 ℃冰箱中取出約100 mg結(jié)腸組織,按料液比1∶9(g∶mL)加入PBS,加入鋯珠并使用高通量組織破碎儀將結(jié)腸組織研磨破碎,5 000×g離心取上清液為組織勻漿。按照5-HT,P物質(zhì)ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作,采用外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)吸光度計(jì)算出樣品中所含待測(cè)物質(zhì)的濃度。

1.3.7 免疫熒光檢測(cè)

結(jié)腸石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后加S100β一抗(1∶100)孵育過(guò)夜,滴加(Cy3) Rabbit Anti-Goat標(biāo)記的熒光IgG二抗(1∶500),用數(shù)字切片掃描儀觀察并拍照,Image J圖像分析系統(tǒng)分析單位面積內(nèi)陽(yáng)性染色的平均光密度值,以陽(yáng)性染色的平均光密度變化評(píng)估腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì),組間多重比較,分別用單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn),兩組間單獨(dú)比較用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1;ns表示無(wú)顯著性,以上顯著性均是與正常組(NC)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用ERβ受體抑制劑可構(gòu)建便秘動(dòng)物模型

通常,在構(gòu)建便秘動(dòng)物模型時(shí),常用的藥物為洛哌丁胺。如圖2所示,洛哌丁胺(10 mg/kg BW)灌胃后,大鼠會(huì)呈現(xiàn)便秘的癥狀(小腸推進(jìn)率和糞便含水量降低,排首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng))。單獨(dú)使用ERβ受體抑制劑(他莫昔芬,40 mg/kg BW)后,大鼠的糞便含水量顯著降低,排首粒黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng),根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(2022版)》中有關(guān)通便功能檢驗(yàn)方法陽(yáng)性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)可知:單獨(dú)使用ERβ受體抑制劑他莫昔芬可成功構(gòu)建便秘動(dòng)物模型。灌胃(ERβ受體抑制劑40 mg/kg BW+洛哌丁胺10 mg/kg BW)后,大鼠同樣呈現(xiàn)便秘的癥狀,上述2種結(jié)果均表明應(yīng)用ERβ受體抑制劑處理大鼠可成功構(gòu)建便秘模型。

a-小腸推進(jìn)率;b-排首粒黑便時(shí)間;c-糞便含水量

2.2 ERβ受體抑制劑造成腸屏障損傷

2.2.1 他莫昔芬對(duì)大鼠腸道生物屏障的影響

LOP組Chao1指數(shù)與observed-OTUs指數(shù)與空白組相比無(wú)顯著性差異。而TAM組和TAM+LOP組則顯著改變了大鼠腸道菌群α-多樣性(Chao1指數(shù)、observed-OTUs)(P<0.05),這些結(jié)果表明他莫昔芬處理后,大鼠腸道內(nèi)物種豐富度提高。根據(jù)主坐標(biāo)分析圖所反映的β多樣性結(jié)果可知,不同藥物處理后對(duì)大鼠腸道菌群的影響非常顯著,且不同藥物影響作用也不同(圖3-c)。其中他莫昔芬上調(diào)了unculturedBacteroidalesbacterium,Bifidobacterium,Clostridiumsensustricto1,Turicibacter和Faecalibaculum的相對(duì)豐度(P<0.05)。相較于洛哌丁胺所引起的菌群改變,他莫昔芬顯著增加了大鼠腸道中促炎菌Turicibacter的豐度,這與H&E病理染色結(jié)果中的炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象一致。同時(shí),他莫昔芬與洛哌丁胺處理組均降低了Blautia、Marvinbryantia、Fournierella、Lactococcus的相對(duì)豐度(P<0.05)。

a-Chao 1指數(shù);b-Observed-OTUs指數(shù);c-主坐標(biāo)分析;d-TAM組與NC組的差異菌株比較;e-LOP組與NC組的差異菌株比較

2.2.2 他莫昔芬對(duì)機(jī)械屏障影響

在H&E病理染色結(jié)果中,他莫昔芬導(dǎo)致結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)受損(深度變淺),杯狀細(xì)胞明顯減少,黏膜下層出現(xiàn)水腫浸潤(rùn),黏膜層皺縮(圖4)。

a-NC組;b-LOP組;c-TAM組;d-TAM+LOP組

但檢測(cè)杯狀細(xì)胞關(guān)鍵分化因子Klf4、Atoh1基因轉(zhuǎn)錄(圖5)有下調(diào)趨勢(shì)卻無(wú)顯著差異,故推測(cè)他莫昔芬處理可能是通過(guò)誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞的凋亡引起了杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少,從而破壞了大鼠腸道機(jī)械屏障。腸上皮細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間緊密排列有效阻擋細(xì)菌、病毒及內(nèi)毒素的進(jìn)入,形成機(jī)械屏障。qPCR結(jié)果顯示洛哌丁胺與他莫昔芬均下調(diào)了緊密連接蛋白Claudin5的轉(zhuǎn)錄(圖5),說(shuō)明2種造模藥物均對(duì)于腸道機(jī)械屏障造成了一定程度的損傷。這些結(jié)果均表明他莫昔芬處理后,大鼠不僅呈現(xiàn)出便秘的狀態(tài),同時(shí)腸道的機(jī)械屏障也出現(xiàn)了不同程度的損傷。

a-Claudin5;b-Klf4;c-Atoh1

2.2.3 他莫昔芬對(duì)化學(xué)屏障影響

在TAM和LOP組,2種水通道蛋白AQP3和AQP8的轉(zhuǎn)錄水平都未出現(xiàn)顯著改變,他莫昔芬也僅表現(xiàn)出上調(diào)AQP8轉(zhuǎn)錄的趨勢(shì)(圖6-a、圖6-b),因此他莫昔芬下調(diào)大鼠糞便含水量可能并不由通過(guò)AQP3與AQP8主要介導(dǎo)。5-HT作為一種腸神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)在調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)中起著重要作用,5-HT能刺激腸道的局部收縮,而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示洛哌丁胺減少5-HT的釋放,他莫昔芬并不會(huì)引起結(jié)腸中5-HT的變化,甚至存在上調(diào)5-HT的趨勢(shì)(圖6-c)。說(shuō)明,應(yīng)用洛哌丁胺構(gòu)建便秘模型和應(yīng)用他莫昔芬構(gòu)建的便秘模型對(duì)于5-HT相關(guān)信號(hào)通路的影響是不同的。此外,結(jié)腸中興奮性胃腸活性肽P物質(zhì)在TAM組、LOP組、TAM+LOP組均顯著降低(圖6-d,P<0.05),P物質(zhì)或是他莫昔芬與洛哌丁胺導(dǎo)致便秘癥狀所涉及到的共同途徑,可能都減少了該類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,對(duì)腸道平滑肌舒張收縮產(chǎn)生影響,抑制了腸道蠕動(dòng)。

a-AQP3相對(duì)表達(dá)量;b-AQP8相對(duì)表達(dá)量;c-5-HT含量;d-P物質(zhì)含量

2.2.4 抑制ERβ引起免疫屏障損傷

腸道黏膜炎癥也與運(yùn)動(dòng)功能有著密切的關(guān)系,在TAM組和TAM+LOP組中大鼠的結(jié)腸都出現(xiàn)了淋巴細(xì)胞的聚集,表現(xiàn)出免疫炎癥,而在LOP組未見(jiàn)明顯的病理?yè)p傷(圖4)。與此同時(shí),如圖7所示,血清中炎癥性指標(biāo)C反應(yīng)蛋白在他莫昔芬處理后大幅上升,說(shuō)明他莫昔芬激活了腸道炎癥反應(yīng),對(duì)腸道黏膜免疫屏障造成了一定程度的破壞。

圖7 血清中C反應(yīng)蛋白含量Fig.7 C-reactive protein content in serum

2.3 他莫昔芬損傷了結(jié)腸黏膜肌層與外肌層腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

在腸神經(jīng)系統(tǒng)中,腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、腸神經(jīng)元中都有著較高水平的ERβ表達(dá)[8]。S100β是一種鈣結(jié)合蛋白,主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,使用S100β標(biāo)記腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖8中紅色熒光)。免疫熒光結(jié)果顯示,他莫昔芬處理后腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞密度下降(圖8),而洛哌丁胺在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無(wú)影響,故推測(cè)ERβ在引起便秘的同時(shí)也會(huì)對(duì)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞正常的神經(jīng)發(fā)育及信號(hào)傳遞具有一定程度的影響。

a-NC組;b-LOP組;c-TAM組;d-TAM+LOP組

3 結(jié)論與討論

便秘患者常表現(xiàn)為排便次數(shù)減少,糞便干硬,排便不充分等癥狀。應(yīng)用藥物構(gòu)建便秘模型時(shí),常用的藥物為鹽酸洛哌丁胺,作為一種阿片受體抑制劑,其會(huì)干擾神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,抑制腸蠕動(dòng)與收縮。本文旨在構(gòu)建靶向女性便秘的動(dòng)物模型,用于靶向篩選適合女性便秘的藥物或益生菌。

前期研究發(fā)現(xiàn)激素尤其是雌二醇和/或其受體在女性便秘中發(fā)揮著重要的作用[9]?；诖?本文主要探討激素受體特別是雌二醇受體對(duì)便秘的影響。研究發(fā)現(xiàn),宿主腸道內(nèi)主要為ERβ受體[3],因此我們假設(shè)應(yīng)用雌激素β受體的特異性抑制劑他莫昔芬可構(gòu)建靶向女性便秘的動(dòng)物模型,并以洛哌丁胺作為陽(yáng)性造模藥物對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)小腸推進(jìn)率、排首例黑便時(shí)間和糞便含水量3個(gè)指標(biāo)來(lái)反映他莫昔芬對(duì)大鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響。結(jié)果表明應(yīng)用他莫昔芬可成功構(gòu)建便秘模型。

目前,影響腸蠕動(dòng)的因素主要有神經(jīng)系統(tǒng)(腸神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng))、免疫系統(tǒng)、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物。這些方面的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂或功能障礙都會(huì)引起腸道能動(dòng)性失調(diào)(便秘或腹瀉)。因此,我們進(jìn)一步解析了他莫昔芬在構(gòu)建便秘模型后對(duì)大鼠上述系統(tǒng),即腸道屏障功能及腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響。結(jié)腸黏液層厚度的減少會(huì)阻礙糞便的推進(jìn),黏液主要由杯狀細(xì)胞分泌,覆蓋腸上皮表面,杯狀細(xì)胞的減少導(dǎo)致黏蛋白分泌不足,這主要是隱窩干細(xì)胞分化不足或杯狀細(xì)胞凋亡增加的結(jié)果[10]。ERβ在結(jié)腸隱窩中有著較多表達(dá),ERβ表達(dá)量的下降可能抑制了隱窩干細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá),使隱窩干細(xì)胞分化不足[11]。同時(shí)他莫昔芬作為乳腺癌的臨床用藥抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的同時(shí)或許誘導(dǎo)了杯狀細(xì)胞的凋亡,從而導(dǎo)致結(jié)腸黏液分泌不足,糞便推進(jìn)受阻,糞便含水量的下降。

葡聚糖硫酸鈉處理后,ERβ敲除小鼠在糞便微生物群組成的α和β多樣性方面表現(xiàn)出顯著變化,并出現(xiàn)結(jié)腸炎和焦慮樣行為的惡化[12]。ERβ的激活能調(diào)節(jié)自噬炎癥小體途徑,抑制白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌,調(diào)節(jié)腸道微生物群,最終緩解結(jié)腸炎[13]。與誘導(dǎo)結(jié)腸炎后的雄性小鼠相比[14],雌性小鼠的Turicibacter和未分類梭菌科顯著富集,這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。Turicibacter在腸道中異常增殖或能預(yù)示女性腸道菌群的紊亂以及潛在的胃腸疾病。氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉處理后,缺失ERβ的小鼠富集了影響碳水化合物代謝和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的微生物群,同時(shí)減少了影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的微生物群[15]。變形桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門(包括乳酸桿菌門)的代表性順序也因小鼠ERβ存在與否而異[16]。ERβ在重構(gòu)腸道微生物群、緩解胃腸道疾病上發(fā)揮著重要作用。

雌激素的激活是在信號(hào)通路上與相關(guān)受體結(jié)合被觸發(fā)活化的結(jié)果,雌激素的抗炎效應(yīng)是通過(guò)激活ERβ受體介導(dǎo)[17]。GOODMAN等[18]研究證明ERβ通過(guò)調(diào)控GILZ轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)中免疫穩(wěn)態(tài)的修復(fù)。IL-6和TNF-α在IBD患者中有顯著的性別差異,男性明顯高于女性,與對(duì)照組相比,ERβ在IBD患者中表達(dá)明顯降低。便秘癥狀中ERβ表達(dá)與炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1等之間的相關(guān)性也有待進(jìn)一步研究,以解析ERβ通過(guò)免疫途徑影響腸道運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。

人類的ERβ蛋白存在于肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的腸神經(jīng)元中[19]。RASTELLI等[20]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ERβ的激動(dòng)劑處理會(huì)促進(jìn)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生,本研究結(jié)果表明ERβ的抑制劑減少了結(jié)腸中腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量,抑制其對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng),造成結(jié)腸動(dòng)力不足。通過(guò)刺激ERβ的增殖或恢復(fù)ERβ在結(jié)腸中的表達(dá)或許能夠促進(jìn)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及功能恢復(fù)到正常水平,達(dá)到緩解便秘的效果。

綜上所述,應(yīng)用ERβ受體抑制劑可成功構(gòu)建靶向女性便秘的動(dòng)物模型。同時(shí)ERβ受體抑制劑在造成便秘的同時(shí)也會(huì)造成結(jié)腸腸神經(jīng)受損及腸屏障的損傷?？傊?本研究為構(gòu)建靶向篩選緩解女性便秘的益生菌動(dòng)物模型提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)支持。