張穎,董耀,呂云斌,王紹琛,馮治洋

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京,210000)

酯酶屬于α/β水解酶超家族,通常催化酯鍵的裂解和形成,包括酯化和酯交換等反應(yīng),一般情況下優(yōu)先水解短鏈酯,在結(jié)構(gòu)上具有α/β水解酶典型的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)和相對(duì)保守的催化域[1-3]。1999年,ARPIGNY等將細(xì)菌源酯酶分類成8個(gè)家族[4]。其中,酯酶的第Ⅳ家族(HSL家族)有典型的帽結(jié)構(gòu)域[5],通常由4～5個(gè)α螺旋組成,覆蓋活性位點(diǎn)[6],并且其N末端部分(帽結(jié)構(gòu)域的一部分)可能與底物特異性和催化效率的調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。

脂解酶作為一種工業(yè)生物催化劑應(yīng)用廣泛[8-9],工業(yè)上對(duì)高酶活酯酶的需求也日益增大,因此對(duì)酯酶的研究有巨大的價(jià)值。有的研究者通過直接分離產(chǎn)酯酶的菌株,在菌種中分離所需的酯酶[10],再去擴(kuò)展被表征的高活性酯酶[11],但大多數(shù)產(chǎn)酯酶的菌株及其酶會(huì)由于培養(yǎng)條件受限而難以被發(fā)現(xiàn)[12]。于是,有的研究者直接基于活性去篩選酯酶[13]?，F(xiàn)在,利用宏基因組序列篩選或功能篩選新型酯酶成為了一種趨勢(shì)[14],KANG等[15]便在宏基因組庫中分離得到1種新型熱穩(wěn)定酯酶。

本試驗(yàn)在以三丁酸甘油酯為指示底物的瓊脂平板上基于活性功能篩選到了1個(gè)高活性的陽性克隆,構(gòu)建亞克隆測(cè)序驗(yàn)證后,對(duì)其進(jìn)行了異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的表征,展現(xiàn)了其在工業(yè)應(yīng)用方面的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集與處理

本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的珠穆朗瑪峰土壤宏基因組文庫[16]:2014年2月取樣于珠穆朗瑪峰(北緯28.21°,東經(jīng)86.56°,海拔高度4 276 m)。文庫宿主:EscherichiacoliEPI100;文庫載體:Cosmid pWEB-TNC。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基材料等

EPI100-T1R、Cosmid pWEB-TNC、E.coliBL21(DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10。三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基:12.5 μg/mL氯霉素、100 μg/mL氨芐青霉素、體積分?jǐn)?shù)為1%甘油三丁酸酯,體積分?jǐn)?shù)為1%阿拉伯樹膠的LB固體培養(yǎng)基。

1.2 酯酶的陽性克隆的篩選

在三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基平板上鋪約包含400～500個(gè)克隆的文庫菌液,37 ℃培養(yǎng)1周,挑出具有透明圈的陽性克隆后,水平轉(zhuǎn)移鋪板驗(yàn)證。

1.3 亞克隆的構(gòu)建

提取陽性克隆質(zhì)粒后,用限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分酶切,膠回收,去磷酸化后,將酶切基因片段連接到經(jīng)完全酶切、去磷酸化后的pWEB-TNC載體中,連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coliEPI100-T1R,涂布在三丁酸甘油酯篩選培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)1周,挑出陽性亞克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 酯酶基因的生物信息學(xué)分析

提取陽性亞克隆質(zhì)粒并進(jìn)行酶切檢驗(yàn)后送公司進(jìn)行雙末端測(cè)序,拼接后的結(jié)果使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行開放閱讀框分析。序列相似性使用BLASTp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行分析,通過Clustal W(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和在線工具ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/) 進(jìn)行多序列比對(duì)及同源序列分析。使用MEGA6.0 基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展值設(shè)為1 000,系統(tǒng)發(fā)育樹的美化采用在線工具 ITOL(https://itol.embl.de/)。使用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析預(yù)測(cè)蛋白的理論分子質(zhì)量和等電點(diǎn),使用SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預(yù)測(cè)蛋白是否含有信號(hào)肽序列,使用TMHMMOL/L(https://dtu.biolib.com/DeepTMHMMOL/L)預(yù)測(cè)是否存在跨膜區(qū)域,使用PDB (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)尋找相似三維結(jié)構(gòu),使用SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行同源蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和模型構(gòu)建,使用SAVES v5.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)對(duì)模型進(jìn)行可信度評(píng)價(jià)。圖像處理使用軟件AdobeIllustrator。數(shù)據(jù)處理使用軟件EXCEL。采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接,使用PyMol 2.5.2 對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.5 異源表達(dá)和純化

設(shè)計(jì)目的基因上帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物(AesZF899-R:5′-ATATCTCGAGCGCCTTGGACTTCA-3′, AesZF899-F:5′-ATATGAATTCATGCCGATCGTAC-TCGA-3′),通過PCR(條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s;62 ℃ 45 s;72 ℃ 3 min;72 ℃ 10 min)擴(kuò)增得到目的片段序列,然后將其與帶有相同酶切位點(diǎn) Nco I和 Xho I 的表達(dá)載體相連接,建立pET-28a(+)-AesZF899重組質(zhì)粒。通過序列分析和三丁酸甘油酯底物驗(yàn)證,將陽性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。挑取已驗(yàn)證正確的重組克隆子E.coliBL21(DE3)-AesZF899于LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8時(shí),添加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside ,IPTG)使其終濃度為0.5 mmol/L,18 ℃,200 r/min,誘導(dǎo)表達(dá)20 h后離心棄上清液,用裂解液重懸菌體后超聲波破碎30 min(6 mmol/L超聲探頭,1 s超聲,間隔2 s),高速離心(12 000 r/min,20 min)取上清液過偶聯(lián)鎳離子的親和層析純化。將純化后的蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液按相應(yīng)比例混合,98 ℃反應(yīng)10 min使蛋白變性,選擇體積分?jǐn)?shù)為12%的聚丙烯酰胺分離凝膠和體積分?jǐn)?shù)為5%濃縮膠來檢測(cè)純化效果,采用考馬斯亮藍(lán)法染色脫色。

1.6 酯酶活力的測(cè)定

采用對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)比色法測(cè)定酯酶活力,以1 mmol/L的p-NP為標(biāo)準(zhǔn)液,稀釋不同濃度,用酶標(biāo)儀讀取405 nm處的OD值。以吸光度值為橫坐標(biāo),p-NP 濃度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在40 ℃、pH 9.0條件下,每分鐘降解底物對(duì)硝基苯酯生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。反應(yīng)混合物(500 μL)包含最終濃度為50 mmol/L的pH值為8.0的Tris-HCl和0.2 mmol/L對(duì)硝基苯酯底物,除非另有說明,還包括純化的AesZF899,所有反應(yīng)都平行測(cè)定3次,酶反應(yīng)時(shí)間5 min。

1.7 底物特異性的測(cè)定

以4種對(duì)硝基苯酚酯:對(duì)硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對(duì)硝基苯己酸酯(pNPC6)、對(duì)硝基苯辛酸酯(pNPC8)為底物,評(píng)估純化的AesZF899的底物特異性。

1.8 酯酶的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

溫度對(duì)AesZF899活性的影響:在pH 8.0條件下,設(shè)置溫度梯度20～100 ℃,按照酯酶酶活力測(cè)定方法,依次計(jì)算各個(gè)溫度酶活力大小,從而得到該酶作用的最適溫度。將最高酶活力的實(shí)驗(yàn)組的酶活力記為100%。

pH對(duì)AesZF899活性的影響:在溫度40 ℃條件下,設(shè)置pH梯度(甘氨酸緩沖液pH 9.0、10.0,Tris緩沖液pH 8.0、9.0,磷酸鹽緩沖液pH 6.0、7.0、8.0,檸檬酸緩沖液pH 3.0、4.0、5.0、6.0),按照酯酶酶活力測(cè)定方法,依次計(jì)算各個(gè)pH下酶活力大小,從而得到該酶作用的最適pH。將最高酶活力的實(shí)驗(yàn)組的酶活力記為100%。

溫度對(duì)AesZF899穩(wěn)定性的影響:在pH 9.0條件下,將酶液分別置于30、40、50 ℃保溫,期間每隔一段時(shí)間測(cè)定其在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)殘余酶活力大小。將未經(jīng)保溫操作的對(duì)照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測(cè)得的酶活力記為100%。

pH對(duì)AesZF899穩(wěn)定性的影響:在pH 9.0條件下,將酶液分別置于不同緩沖液中(檸檬酸緩沖液pH 3.0、4.0、5.0、6.0,磷酸鹽緩沖液pH 6.0、7.0、8.0,Tris緩沖液pH 8.0、9.0,甘氨酸緩沖液pH 9.0、10.0)4 ℃ 保溫2 h,期間每隔一段時(shí)間測(cè)定其在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)殘余酶活力大小。將未經(jīng)保溫操作的對(duì)照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測(cè)得的酶活力記為100%。

金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì) AesZF899 活性的影響:在最適條件下(40 ℃、pH 9.0),在緩沖液中加入10 mmol/L的不同的金屬離子(Cu2+、K+、Na+、Ni+、Mg2+、Fe3+、Mn2+、Li+)及體積分?jǐn)?shù)為1%和10%的化學(xué)溶劑[SDS、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、異戊醇],測(cè)定酯酶活力。將添加有機(jī)溶劑但未添加酶液的對(duì)照組作為空白,將添加酶液但未添加有機(jī)溶劑的對(duì)照組在最適條件下(40 ℃、pH 9.0)測(cè)得的酶活力記為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶的克隆、表達(dá)、序列分析和系統(tǒng)發(fā)育

本研究基于宏基因組功能篩選了約200萬個(gè)文庫菌克隆后獲得了多個(gè)周圍有透明圈的陽性克隆,選擇一個(gè)透明圈半徑最大的酯酶陽性克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)該陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩,確認(rèn)該克隆具有酯酶活性后進(jìn)行亞克隆的構(gòu)建,挑選具有酯酶活性的亞克隆,酶切驗(yàn)證酯酶陽性亞克隆構(gòu)建成功,并對(duì)該陽性亞克隆質(zhì)粒測(cè)序。

亞克隆測(cè)序結(jié)果經(jīng)ORF Finder在線工具分析后,定位一個(gè)長度為945 bp的開放閱讀框,命名為AesZF899,可編碼314個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白大小34 kDa,等電點(diǎn)是5.49,顯示其不含信號(hào)肽,不存在跨膜區(qū)域,提示AesZF899為胞內(nèi)酶。NCBI在線工具BLASTp中的UniProtKB/Swiss-prot (swissprot)數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)結(jié)果表明,與來自Afipiasp. P52-10中編碼313個(gè)氨基酸的α/β水解酶(GenBank登錄號(hào)為WP_034470467.1)一致性達(dá)76.43%,但該酶的酶學(xué)性質(zhì)尚未表征,Graphic Summol/Lary中提示AesZF899可能編碼一種乙?；ッ?。將AesZF899提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,登錄號(hào)為PRJNA932869。

利用MEGA X構(gòu)建了包含Arpigny和Jaeger的分類中8個(gè)家族的代表序列鄰接系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1-a),以對(duì)AesZF899進(jìn)行相關(guān)的分類,顯示AesZF899與酯酶第四家族密切相關(guān)。

對(duì)酯酶AesZF899及同家族的triacylglycerol lipase [Moraxellasp.](CAA37862)、esterase [RenibacteriumsalmoninarumATCC 33209](ABY25125)和Arylesterase(B5BLW5.1)進(jìn)行多序列同源比對(duì),結(jié)果如圖1-b所示,在AesZF899的氨基酸序列中存在酯酶第四家族(HSL家族)酯酶的保守基序HGGG和GDSAG,比對(duì)分析推測(cè)活性位點(diǎn)絲氨酸(Ser162)、保守天冬氨酸(Asp242)和組氨酸(His88)可能組成了催化三聯(lián)體。

2.2 AesZF899的結(jié)構(gòu)建模與分子對(duì)接

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明AesZF899 有10個(gè)α螺旋、8個(gè)β折疊、3個(gè)無規(guī)則卷曲。在SWISS-MODEL上進(jìn)行同源建模[17-21],根據(jù)Est8(PDB:4YPV,序列覆蓋度43.87%)的結(jié)構(gòu)建模得到AesZF899的結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2 所示。GMQE的可信度范圍為0～1,值越大表明質(zhì)量越好;QMEAN4評(píng)估待測(cè)蛋白與模板蛋白的匹配度,值越大表示匹配越好,該結(jié)構(gòu)的GMQE值是0.83,QMEAN4值是0.79。ERRAT分析不同原子類型之間非鍵合相互作用的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),結(jié)果表明,AesZF899有91.77%的得分。VERIFY 3D用于確定原子模型(3-dimension,3D)的準(zhǔn)確性,其中的結(jié)果是通過比較已經(jīng)被晶體學(xué)或核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)解析的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,AesZF899有96.15%的氨基酸殘基得分。以上結(jié)果顯示,同源建模得到的結(jié)構(gòu)合理,適合于下一步的分子對(duì)接。此外,還可以看到在AesZF899的三維結(jié)構(gòu)中存在α/β水解酶折疊子,即多個(gè)α螺旋和β折疊組成,并且可以看到上方存在一個(gè)CAP結(jié)構(gòu)域。

分子對(duì)接的對(duì)硝基苯乙酸酯(Cas號(hào):830-03-5)的3D結(jié)構(gòu)從PUBCHEM數(shù)據(jù)庫下載獲得,并在MMOL/LFF94力場(chǎng)下進(jìn)行能量最小化。在對(duì)接開始之前,使用PyMol 2.5.22對(duì)受體蛋白進(jìn)行處理,包括去除水分子、鹽離子以及小分子。結(jié)果如圖3所示,從右邊的相互作用細(xì)節(jié)圖中看到對(duì)硝基苯乙酸酯與AesZF899上的Leu-210、Asp-208發(fā)生氫鍵作用,和Lys-23發(fā)生陽離子pi共軛作用;此外,還可以觀察到對(duì)硝基苯乙酸酯和蛋白的Phe-16、Leu-210 發(fā)生疏水作用。氫鍵作用為最強(qiáng)的非共價(jià)作用之一,在此表明發(fā)生氫鍵作用的Leu-210、Asp-208為對(duì)結(jié)合起重要貢獻(xiàn)的氨基酸。結(jié)合親和力為負(fù)數(shù)表示存在結(jié)合的可能,通常數(shù)值小于-6 kcal/mol被認(rèn)為結(jié)合可能性較大。在該復(fù)合物中,對(duì)接軟件給出對(duì)硝基苯乙酸酯與AesZF899結(jié)合親和力評(píng)分為-6.0 kcal/mol,意味著對(duì)硝基苯乙酸酯與AesZF899蛋白具備結(jié)合可能性。

a-AesZF899的系統(tǒng)發(fā)育樹;b-AesZF899的多重序列比對(duì)

圖2 AesZF899的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of AesZF899

圖3 AesZF899與對(duì)硝基苯乙酸酯的分子對(duì)接圖Fig.3 Molecular docking diagram of AesZF899 with p-nitrophenylacetate

2.3 重組酯酶的表達(dá)和純化

N端包含His-Tag的重組AesZF899在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達(dá),并經(jīng)Ni+親和層析純化,SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示,AesZF899的大小與理論大小34 kDa相符。

M-蛋白Marker;1-粗酶液;2-純酶

2.4 酯酶的酶學(xué)特性分析

酶的最適底物如圖5所示,在對(duì)對(duì)硝基苯乙酸酯(pNPC2)、對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPC4)、對(duì)硝基苯己酸酯(pNPC6)和對(duì)硝基苯辛酸酯(pNPC8) 4種底物的底物特異性實(shí)驗(yàn)中,AesZF899對(duì)對(duì)硝基苯乙酸酯(pNPC2)的酶活性最佳,底物活性譜是酯酶活性的特征,即酯酶通常僅在短鏈酯上具有活性,因此,AesZF899是一個(gè)酯酶,而不是脂肪酶。

圖5 底物特異性Fig.5 Specificity of substrate

酶的最適溫度如圖6所示,酶活性在40 ℃時(shí)達(dá)到最大值,酶促反應(yīng)理想溫度在40～50 ℃,反應(yīng)溫度大于60 ℃后,相對(duì)酶活性不足20%,酶的作用溫度區(qū)間較窄,反映了AesZF899是一個(gè)中溫酶。

圖6 溫度對(duì)酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on enzyme activity

酶的溫度穩(wěn)定性如圖7所示,在30 ℃溫育8 h后仍可保持初始活性,酯酶在溫度35、40 ℃的半衰期分別是7、4 h,當(dāng)溫育溫度大于50 ℃后,溫育半小時(shí)后相對(duì)酶活性僅50%,溫育1 h后酶活性幾乎完全喪失,反映了AesZF899并不耐高溫。

圖7 時(shí)間對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on enzyme stability

酶的最適pH如圖8所示,酶活性隨著酶促反應(yīng)的pH值的上升先升后降,pH值小于5.0時(shí)酯酶幾乎無活性,pH值在9.0時(shí)酯酶的活性最大,反映了AesZF899是一個(gè)堿性酶。

圖8 pH 對(duì)酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響如圖9所示,過酸或過堿的環(huán)境都會(huì)降低酶的穩(wěn)定性,中度偏堿的環(huán)境更適合酶的穩(wěn)定,酶在pH 9的情況下可維持65%的活性。

圖9 pH 對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of pH on enzyme stability

金屬離子對(duì)酶活性的影響如圖10所示,Fe3+可以增強(qiáng)酶活性,Mn2+和Cu2+對(duì)AesZF899的酶活性抑制作用較弱,K+和Ca2+對(duì)AesZF899的酶活性抑制作用較強(qiáng),Na+、Li+和Mg2+對(duì)AesZF899的酶活性抑制作用最強(qiáng),反應(yīng)體系中加入Na+、Li+和Mg2+可使AesZF899的相對(duì)酶活性降低到50%以下。

圖10 金屬離子對(duì)酶活性的影響Fig.10 Effect of metal ions on enzyme activity

有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響如圖11所示,酶在10%甲醇和10%丙醇溶劑中活性明顯降低,可能是由于有機(jī)溶劑分子阻礙底物和酶活性位點(diǎn)的接觸[22];酶在1% DMSO中活性明顯增強(qiáng),可能是由于其使酶的柔性部位增加[23];酶在1%和10%的異戊醇中活性稍微增加,可能是由于二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[24]。

圖11 有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響Fig.11 Effect of organic solvent on enzyme activity

在最佳條件下,即酶促反應(yīng)溫度40 ℃,pH值為9.0,底物是對(duì)硝基苯乙酸酯,反應(yīng)體系不額外加金屬離子,不加有機(jī)溶劑的情況下,酯酶AesZF899的比活力可高達(dá)(3 957±3) U/mg。

3 結(jié)果與討論

本研究通過宏基因組手段從前期建立的珠穆朗瑪峰土壤文庫中,篩選了約200萬個(gè)文庫菌克隆后獲得了多個(gè)周圍有透明圈的陽性克隆,選擇一個(gè)透明圈半徑最大的酯酶陽性克隆,即酯酶活性最大的一個(gè)陽性克隆,構(gòu)建正確的陽性亞克隆后在NCBI上比對(duì)序列信息,并利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的異源表達(dá),通過鎳柱親和層析純化后得到純度較高的純酶,在脫鹽柱上脫鹽后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。通過對(duì)進(jìn)化樹的分析,推測(cè)該酯酶是酯酶第四家族。選取進(jìn)化樹上與該酯酶相近的分支的序列進(jìn)行多重序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)該酯酶的序列具有保守基序HGGG和GDSAG,符合酯酶第四家族GDSAG亞族的特點(diǎn)。采用了測(cè)定酯酶活性的通用底物對(duì)硝基苯酯測(cè)定該酶的底物特異性,該酶在底物特異性實(shí)驗(yàn)中偏好短鏈酯,最佳底物是對(duì)硝基苯乙酸酯,最佳pH值為9.0,偏堿性,最佳溫度40 ℃。在最佳條件下的該酯酶的比活力可達(dá)3 957 U/mg。同時(shí),Fe3+可以增強(qiáng)酶活性,適用于工業(yè)中鐵容器材質(zhì)。

通常采用在同等條件下釋放的對(duì)硝基苯酚的含量去衡量酯酶的活性大小,這是因?yàn)轷ッ杆怩ユI,產(chǎn)生游離酚重新激活顯色基團(tuán)或熒光基團(tuán),進(jìn)一步通過分光光度計(jì)定量測(cè)定,從而反應(yīng)水解能力的大小[25]。AesZF899的比活力可達(dá)3 957 U/mg,Sigma-Aldrich提供的商業(yè)酯酶的活性也僅為104～105U/g,雖然商業(yè)酯酶的活力通常小于天然酯酶的活力,大于人工設(shè)計(jì)的酯酶活力[26]。在一些實(shí)驗(yàn)中為了獲得具有較高催化活性的酶,會(huì)對(duì)其底物結(jié)合口袋的形成、相互作用和疏水性進(jìn)行合理的定向突變[27]。在未來的研究中,可以對(duì)AesZF899進(jìn)行突變獲得更高活性的酯酶,或者可以通過突變底物分子周圍重要的氨基酸從而改造酶的分子結(jié)構(gòu)以提高酶的穩(wěn)定性以及增強(qiáng)酶的選擇性、改變酶的表面特性等。酯酶主要催化短鏈的脂肪酸酯及醇的反應(yīng),且生產(chǎn)成本低于脂肪酶,成為了化學(xué)合成中重要的催化劑[28]。有研究者從豌豆中分離得到酯酶,并根據(jù)底物特異性將其歸類為羧酸酯酶,用于酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留[29]。所以根據(jù)底物特異性可以將AesZF899也歸類為酯酶,用于生物催化劑等工業(yè)領(lǐng)域。同時(shí),AesZF899在30 ℃的穩(wěn)定性很好,利于工業(yè)酶制劑的常溫儲(chǔ)存,保持高效的酶活性,減少工業(yè)酶制劑的貯存成本。