單逸藍(lán),楊夢蓮,趙琳,沈微*,楊海泉,夏媛媛,陳獻(xiàn)忠

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(安徽華恒生物科技有限公司,安徽 合肥,231131)

β-葡聚糖主要存在于廣泛應(yīng)用于釀造、飼料等工業(yè)中的大麥、高粱等谷物的胚乳細(xì)胞壁中[1]。由于家禽缺乏相應(yīng)的腸酶來有效分解胚乳細(xì)胞壁的主要多糖:β-葡聚糖[2],谷物應(yīng)用于家禽飼料中往往營養(yǎng)價值較低。β-葡聚糖遇水會膨脹,黏度增加,不僅導(dǎo)致家禽腸道中的食糜黏稠度增高、養(yǎng)分吸收受阻,而且含有β-葡聚糖的黏性糞便極大增加了養(yǎng)雞場清潔工作的勞動量,并帶來一定的環(huán)境污染問題[3]。在飼料中加入β-葡聚糖酶有利于改善以上問題。由于家禽特殊的攝食習(xí)慣,其飼料需要保持較高的顆粒穩(wěn)定性(particle stability,PDI)。在造粒生產(chǎn)環(huán)節(jié)階段中采用高溫處理使飼料中的淀粉充分糊化是提高飼料PDI的主要方法。張亮等[4]研究了造粒溫度對顆粒飼料質(zhì)量的影響,發(fā)現(xiàn)溫度的升高(80～90 ℃)可以改善顆粒飼料的質(zhì)量,其中造粒溫度達(dá)到90 ℃時獲得的飼料的PDI等指標(biāo)顯著優(yōu)于采用85 ℃或80 ℃獲得的飼料。目前市場上尚沒有能耐受80 ℃以上高溫的β-葡聚糖酶。本課題組在前期工作中,發(fā)現(xiàn)了一種來源于黑曲霉的高耐熱葡聚糖酶AnEglA6[5-6],這種酶在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)產(chǎn)物AnEglA6K能短時耐受85 ℃高溫[6]。序列比對發(fā)現(xiàn),AnEglA6分子由兩部分組成,前端311個氨基酸殘基形成催化功能結(jié)構(gòu)域,而羧基端的36個氨基酸殘基則構(gòu)成纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain,CBD)[6],兩者之間是由44個氨基酸殘基組成的連接橋。在葡聚糖酶系中,CBD往往與結(jié)晶型纖維素的水解有關(guān)[6-7],但AnEglA6K對微晶纖維素只具有很微弱的水解能力。碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate binding module,CBM)是一類多模塊酶蛋白,其功能是與纖維素、木聚糖等碳水化合物底物結(jié)合[7],CBM通常與催化多糖水解反應(yīng)的催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domains,CD)連接[8]。CBD是最早被發(fā)現(xiàn)的碳水化合物結(jié)合模塊[9]。部分CBM家族具有與結(jié)晶型纖維素結(jié)合的能力,廣泛應(yīng)用于碳水化合物生物材料的功能化,促進(jìn)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、穩(wěn)定和固定化等[10]。纖維素酶應(yīng)用于畜禽飼料中能提高仔雞、肉牛等動物營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[11]。替換或增加CBD是提高纖維素酶降解結(jié)晶型纖維素活性的方法之一[12]。本課題組在前期工作中,將不同微生物來源的碳水化合物結(jié)合模塊CBM更換AnEglA6自身的CBD,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所獲得的融合體酶的催化活性基本喪失或大幅度下降,但AnEglA6與來自嗜熱菌(Caldicellulosiruptorkristjanssonii)的木聚糖酶的碳水化合物結(jié)合模塊CBM9[13]以及來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的木聚糖酶的模塊CBM10[14]重組獲得的融合酶保持了較高的葡聚糖酶活力,兩者均獲得了明顯的降解微晶纖維素的能力,后者的熱穩(wěn)定性顯著提高。本文主要研究上述融合酶的獲得方法及應(yīng)用性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

含有eglA6基因的質(zhì)粒pPIC9K-eglA6為實驗室前期構(gòu)建[5]。表達(dá)載體pPIC9K、宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115為Invitrogen公司產(chǎn)品,為本課題組保藏。含有碳水化合物結(jié)合模塊CBM9[13]和CBM10[14]的編碼基因按文獻(xiàn)報道的序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,片段合成后插入載體pUC57后分別獲得重組質(zhì)粒pUC-CBM9和pUC-CBM10。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶PrimerStar、核酸標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量,寶日醫(yī)(北京)有限公司;無縫克隆連接試劑盒,寶日醫(yī)公司;質(zhì)粒提取和DNA片段回收試劑盒,蘇州康寧生物科技有限公司;蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量,翌圣生物科技有限公司;茯苓多糖、酵母葡聚糖、大麥葡聚糖、樺樹木聚糖、CMC-Na,MegaZyme公司;熱凝膠、甘露聚糖、微晶纖維素,上海源葉生物技術(shù)公司;蛋白純化鎳親、層析填料,無錫天演技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基與試劑的配制

LB培養(yǎng)基(luria-bertani medium)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)、MM基本培養(yǎng)基(mineral medium)、甘油緩沖復(fù)合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY) 和誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY)均參考文獻(xiàn)[5]。

檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液參考文獻(xiàn)[5]。

1.1.4 引物及基因的合成

根據(jù)eglA6的核苷酸序列(NCBI登錄號:MG913988)以及CBM9和CBM10的核苷酸序列[11-12]設(shè)計引物,序列如下:

Peg01:5′-CTGAAGCTTACGTAGAATTCAGTCCG-AGGGCTAAGCGGTC-3′

Peg02:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgCAAACACTGCGAATACCAC-3′

Peg9:5′-CTTACATATATCCTCTTTGCCGCAGCT-ACAGCCGTCGATG-3′

Peg10:5′-CAATTACATTGCTGGTTACCCGCAGCTACAGCCGTCGATG-3′

其中Peg01和Peg02用于擴增eglA6完整的成熟肽編碼區(qū)。Peg01和Peg9、Peg10用于擴增eglA6中不含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的部分。引物中單下劃線部分為內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和NotI識別位點,雙下劃線部分與CBM9、CBM10編碼區(qū)5′-端互補,用于片段間的無縫連接。單下劃線小寫字母部分為His-tag編碼區(qū)。

根據(jù)核苷酸序列[13-14]設(shè)計擴增CBM9、CBM10的引物如下:

P901:5′-GCAAAGAGGATATATGTAAG-3′

P902:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgGGTAACCAGCAATGTAATTG-3′

P1001:5′-GGTAACCAGCAATGTAATTG-3′

P1002:5′-GCGAATTAATTCGCGGCCGCCTATTA-atggtgatggtgatggtgGCCGCTCCCCACAATACCAA-3′

雙下劃線部分與CBM基因5′-端一致,用于CBM基因的擴增,同時也用于與eglA6擴增片段的無縫連接。

1.2 實驗方法

1.2.1 融合酶表達(dá)載體構(gòu)建

以質(zhì)粒pPIC9K-eglA6作為模板,用引物Peg01、Peg9擴增eglA6基因中不含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的片段。PCR條件為:98 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性 30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,30個循環(huán)。擴增片段大約為1.1 kb。再以pUC-CBM9為模板,以引物P901、902擴增片段CBM9。PCR條件為:98 ℃預(yù)變性 3 min,94 ℃變性 30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸 40 s,30個循環(huán)。上述PCR擴增產(chǎn)物均以膠回收方法進(jìn)行純化。載體pPIC9K以EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切線性化,以PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后與兩次PCR獲得的片段混合,用無縫連接試劑盒進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后經(jīng)酶切電泳鑒定,獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM9。用引物Peg01、Peg10擴增eglA6基因,以pUC-CBM10為模板,以P1001、P1002為引物擴增片段CBM10,擴增產(chǎn)物約為0.15 kb。上述擴增片段與線性化的載體pPIC9K連接獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM10。操作方法與質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM9構(gòu)建方法一致。用引物Peg01、Peg02擴增eglA6基因中包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的完整編碼區(qū)的片段,由于該片段末端帶有His-tag標(biāo)簽,為便于和已有文獻(xiàn)報道[5]區(qū)別,將該片段命名為eglA6T。上述擴增產(chǎn)物純化后直接與經(jīng)EcoR I和NotI雙酶切的pPIC9K連接。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化及篩選

將1.2.1節(jié)中獲得的重組質(zhì)粒用BglⅡ線性化后分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選方法參考文獻(xiàn)[15]。獲得酵母轉(zhuǎn)化子后取單菌落劃線分離后再取單菌落參考文獻(xiàn)[5]的方法搖瓶發(fā)酵檢測葡聚糖酶酶活力。

1.2.3 融合酶的純化

離心并收集重組菌發(fā)酵上清液。由于融合酶C端帶有His-tag標(biāo)簽,用鎳柱進(jìn)行蛋白純化,方法參考文獻(xiàn)[16]。SDS-PAGE及蛋白濃度測定方法均參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 融合酶酶學(xué)性質(zhì)的測定

酶活力檢測、酶學(xué)性質(zhì)分析等方法均與文獻(xiàn)[6]相同。其中酶活力定義:以大麥葡聚糖為底物,每分鐘分解底物產(chǎn)生的還原糖,其還原力相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量,用1 U表示。濾紙纖維素酶檢測方法[17]:將濾紙裁剪成0.5 cm×0.5 cm大小的正方形,在2 mL的離心管中放入2片裁剪好的新華濾紙,加入400 μL的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液和100 μL酶液,在最適溫度、pH的反應(yīng)條件下反應(yīng)1 h立即加入750 μL的DNS溶液,沸水浴5 min。每分鐘降解濾紙釋放1 μmol 葡萄糖所需的酶量,定義為一個濾紙纖維素酶活力單位U。

1.2.5 融合酶水解產(chǎn)物的分析

取葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽六糖混合后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇配制成10 mg/mL的溶液,作為薄層層析的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液。展層溶劑體積比為乙酸乙酯∶冰醋酸∶水=2∶2∶1,顯色劑為1 g二苯胺、1 mL苯胺和5 mL磷酸溶于50 mL丙酮。將融合酶與大麥葡聚糖于75 ℃下進(jìn)行充分反應(yīng),待酶將底物水解徹底后進(jìn)行薄層層析,操作方法與文獻(xiàn)[6]相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pPIC9K-eglA6為模板,Peg01、Peg9為引物,擴增獲得1.1 kb左右的片段,與eglA6基因中不含CBD編碼區(qū)的片段大小一致。以pUC-CBM為模板,以P901、P902為引物,PCR擴增獲得約0.6 kb的片段,與CBM9編碼區(qū)大小一致。上述2個擴增產(chǎn)物與經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體pPIC9K混合后進(jìn)行無縫連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒以EcoR I、NotI雙酶,電泳結(jié)果如圖1中泳道2所示。由電泳圖可見,該重組質(zhì)粒酶切后得到大約9.3 kb和1.7 kb的片段,分別與pPIC9K及片段eglA6-CBM9一致,該質(zhì)粒命名為pPIC9K-eglA6-CBM9。采用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM10,其酶切電泳圖如圖1泳道3所示。以Peg01、Peg02為引物擴增獲得的含完整編碼區(qū)的eglA6T片段直接與經(jīng)雙酶切的載體pPIC9K連接,獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6T,其酶切電泳圖如圖2泳道1所示。

M1-10 000 bp的核酸Marker;M2-5 000 bp的核酸Marker; 1-重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6T以EcoR I、Not I雙酶切產(chǎn)物; 2-重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM9以EcoR I、Not I雙酶切產(chǎn)物; 3-重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM10以EcoR I、Not I雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組酵母的構(gòu)建、融合酶的表達(dá)與純化

上述3種重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,在MM平板上篩選轉(zhuǎn)化子。3種重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子各任取20個,劃線分離后取單菌落經(jīng)搖瓶發(fā)酵檢測酶活力。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6T轉(zhuǎn)化子的酶活力大約在500～900 U/mL,與韓冰等[5]報道的采用類似方法構(gòu)建的表達(dá)同一條基因的酵母轉(zhuǎn)化子酶活力基本一致。pPIC9K-eglA6-CBM9轉(zhuǎn)化子的酶活力大約為150～250 U/mL,pPIC9K-eglA6-CBM10轉(zhuǎn)化子的酶活力大約在600～750 U/mL。其中pPIC9K-eglA6-CBM9轉(zhuǎn)化子中編號為11的轉(zhuǎn)化子發(fā)酵酶活力最高,命名為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6-CBM9 YL11,簡稱AnEg-CB9 YL11,所表達(dá)的融合酶命名為AnEg-CBM9用于后續(xù)實驗。質(zhì)粒pPIC9K-eglA6-CBM10轉(zhuǎn)化子中酶活力最高的為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6-CBM10 YL05,簡稱AnEg-CB10 YL05,所表達(dá)的融合酶命名為AnEg-CBM10。質(zhì)粒pPIC9K-eglA6T轉(zhuǎn)化子中酶活力最高的為PichiapastorisGS115/pPIC9K-eglA6TYL19,簡稱AnEglA6T YL19,所表達(dá)的融合酶命名為AnEglA6T。

上述菌種的發(fā)酵上清液按1.2.3節(jié)進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物蛋白電泳如圖2所示。用圖像分析軟件Image Lab 4.0對電泳條帶進(jìn)行推算,結(jié)果顯示,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的表觀分子質(zhì)量分別為81 kDa和59 kDa。含野生酶完整結(jié)構(gòu)的AnEglA6T的表觀分子質(zhì)量為52 kDa,與本課題組前期研究獲得的AnEglA6的分子質(zhì)量基本一致[5]。根據(jù)核苷酸序列推算,AnEg-CBM9、AnEg-CBM10的理論分子質(zhì)量分別為62 kDa和43 kDa,AnEglA6T理論分子質(zhì)量為41 kDa。顯然3種酶的表觀分子質(zhì)量均明顯高于理論分子質(zhì)量,這是真核生物分泌表達(dá)的常見現(xiàn)象。真核生物的胞外蛋白在分泌表達(dá)過程中往往在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被糖基化修飾,因此胞外蛋白的表觀分子質(zhì)量往往大于理論分子質(zhì)量。將上述3種純化得到的融合酶分別用于酶學(xué)性質(zhì)的研究。

M-Protein Ladder;1-AnEglA6T;2-AnEg-CBM9; 3-AnEg-CBM10

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 融合酶的葡聚糖酶性質(zhì)

以大麥葡聚糖為底物,在pH值為4.5的條件下,測定60～90 ℃下2種融合酶的相對酶活力,結(jié)果如圖3-a所示。這3種酶的催化活性與溫度的關(guān)系非常相似,最適溫度均為75 ℃,在90 ℃時只有AnEg-CBM10有酶活力,AnEg-CBM9和AnEglA6T的酶活力幾乎為0。AnEglA6T的性質(zhì)與韓冰等[5]報道的eglA6基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物AnEglA6的性質(zhì)基本一致。

在最適溫度75 ℃下,測定pH 3～7 時2種融合酶的相對酶活力。結(jié)果如圖3-b所示。2種融合酶活力與pH的關(guān)系有一定的差異。AnEglA6T的最適pH值為4,這與韓冰等[5]的報道一致,而融合體酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的最適pH值分別是4.5和5.0,略有改變。

a-溫度;b-pH

2.3.2 融合酶的穩(wěn)定性

在各自的最適pH條件下,分別測定了融合酶在75、80、85 ℃下的相對酶活力變化。由圖4可見,3種酶的熱穩(wěn)定性有相當(dāng)大的差異。其中,AnEglA6T和AnEg-CBM9的耐熱性十分接近,AnEg-CBM10的熱穩(wěn)定性顯著高于AnEglA6T和AnEg-CBM9。在85 ℃高溫下,AnEglA6和AnEg-CBM9在保溫1 h后殘余酶活力均只有10%左右,而同樣條件下AnEg-CBM10的殘余酶活力約為30%。進(jìn)一步檢測顯示,85 ℃下AnEg-CBM10的酶活力半衰期大約為40 min,另兩種酶均不足5 min。在90 ℃下,AnEglA6T和AnEg-CBM9快速失活,大約在5 min后即完全失活。AnEg-CBM10可以短時耐受90 ℃高溫,其90 ℃下的酶活力半衰期大約為7 min。

圖4 融合酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of fusion enzymes

2.3.3 融合酶水解產(chǎn)物分析

將融合酶與大麥葡聚糖混合反應(yīng)后檢測反應(yīng)產(chǎn)物,結(jié)果如圖5所示。3種葡聚糖酶與底物反應(yīng)后的產(chǎn)物為不同分子質(zhì)量的寡糖,主體產(chǎn)物均比較接近麥芽糖和麥芽三糖,也形成少量分子質(zhì)量稍大的寡糖。

內(nèi)切型葡聚糖酶的特點就是產(chǎn)生大量不同分子質(zhì)量的寡糖,AnEglA6因這一特點被判定為內(nèi)切型葡聚糖酶[5]。由圖5可知,融合酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的水解產(chǎn)物與AnEglA6基本相同,可見AnEg-CBM9和AnEg-CBM10也是內(nèi)切型葡聚糖酶。

M-標(biāo)準(zhǔn)糖溶液(葡萄糖、麥芽二糖、麥芽三糖和麥芽六糖的混合 溶液);1-AnEglA6T的水解產(chǎn)物;2-AnEg-CBM9的水解產(chǎn)物; 3-AnEg-CBM10的水解產(chǎn)物;箭頭所指處為5 g/L大麥葡聚糖

2.3.4 融合酶的底物特異性

在最適條件下,將2種融合酶分別與10 g/L的不同底物反應(yīng)并測定比酶活力,結(jié)果如表1所示。與野生型酶AnEglA6T相比,兩種融合酶的底物特異性有明顯的變化。大麥葡聚糖和燕麥葡聚糖為底物時,3種酶的比酶活力基本一致。以地衣多糖為底物時,兩種融合酶的比酶活力均比野生型酶AnEglA6有較大幅度的下降。以CMC-Na為底物時,兩種融合酶的比酶活力明顯高于AnEglA6T,其中AnEg-CBM10的比酶活力幾乎達(dá)到AnEglA6T的2倍。內(nèi)切型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特點是水解葡聚糖分子內(nèi)部β-1,4-糖苷鍵,但優(yōu)先水解與1,3-鍵相鄰的β-1,4鍵[1],因此這一類酶對β-1,3-鍵豐富的地衣多糖具有更高的水解效率,而對只有β-1,4-鍵的CMC-Na水解效率較低。由表1可知,3種酶以地衣多糖為底物時比酶活力最高,而以CMC-Na為底物時的活性較低,結(jié)合前文對水解產(chǎn)物的研究結(jié)果可知,3種酶均具有內(nèi)切型β-1,3-1,4-葡聚糖酶的特點,但是它們對不同底物的水解效率又表現(xiàn)出明顯的差異。兩種融合酶的一個特點是對地衣多糖的水解活性明顯低于AnEglA6T,而對CMC-Na的活性又明顯高于AnEglA6T,可見β-1,3-鍵對兩種融合酶的影響相對較小。兩種融合酶的另一個特點是其底物范圍明顯擴大,均對微晶纖維素表現(xiàn)出明顯的水解活性,具有纖維素酶的特點,這顯然是纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域賦予融合酶的新功能。同時,這兩種融合酶還獲得了水解酵母葡聚糖和茯苓多糖的能力,這是一個意外的結(jié)果,因為提供催化結(jié)構(gòu)域的AnEglA6和提供纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的兩種木聚糖酶均不具有水解β-1,3型葡聚糖的能力。兩種融合體酶對木聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖等非葡萄糖單元構(gòu)成的多糖沒有表現(xiàn)出水解活性,由此推測融合體酶可能只限于水解葡萄糖單元構(gòu)成的底物。以濾紙為底物對兩種融合體酶的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10的最適溫度均為60 ℃,最適pH值分別為5.5和6.0。進(jìn)一步以纖維素酶為依據(jù)檢測融合酶的熱穩(wěn)定性,結(jié)果與采用葡聚糖酶為依據(jù)獲得的結(jié)果基本一致。實驗結(jié)果看,融合體酶在高溫下對結(jié)晶型纖維素的催化活性顯著下降,但這一變化與酶的高溫失活并不存在必然關(guān)系。

表1 底物特異性分析Table 1 Substrate specificity analysis

2.3.5 融合酶結(jié)構(gòu)變化影響催化活性改變的初步分析

利用I-Tasser對融合酶進(jìn)行同源建模,底物口袋使用網(wǎng)站POCASA 1.1進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如圖6所示。淺灰色區(qū)域為蛋白結(jié)構(gòu)部分,深灰色區(qū)域為預(yù)測的蛋白質(zhì)底物口袋。初步測算顯示兩種融合體酶的底物結(jié)合口袋顯著大于AnEglA6T,這可能間接說明了這3種酶對底物利用能力的改變。融合酶AnEg-CBM9的結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM9也顯示了兩個可能的底物結(jié)合口袋,如圖6箭頭所指,這可能證明了CBM的不同改變了重組蛋白的結(jié)構(gòu),賦予了融合酶一些新的功能[18]。在上述同源建模的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步預(yù)測可能的催化反應(yīng)的配體以及與配體結(jié)合的氨基酸殘基位點,結(jié)果如圖7及表2所示。

a-AnEglA6T;b-AnEg-CBM9;c-AnEg-CBM10

表2 融合酶配體名稱及配體結(jié)合位點殘基Table 2 Ligand names and ligand binding site residues of fusion enzymes

所預(yù)測結(jié)果中,AnEglA6T與AnEg-CBM10的預(yù)測的最適配體均為β-1,4-D-葡聚糖,與配體結(jié)合的氨基酸殘基均為6個,其中僅有一個殘基不同,由His100變?yōu)榱薃SN99。AnEg-CBM9的預(yù)測的最適配體為纖維三糖。從結(jié)構(gòu)分析結(jié)果看,兩種融合體酶的催化活性中心均與AnEglA6T有差異,這在一定程度上解釋了融合體酶底物范圍發(fā)生變化的原因。AnEg-CBM9預(yù)測的活性中心變化更大,顯示其底物特異性發(fā)生變化的可能性也較大,這與表1所列底物特異性分析結(jié)果基本相符,AnEg-CBM9對微晶纖維素、茯苓多糖等新底物的活性顯著高于AnEg-CBM10。上述預(yù)測結(jié)果與實驗結(jié)果也有一定的差異,例如兩種融合體酶預(yù)測的所有配體中均沒有β-1,3-葡聚糖。結(jié)構(gòu)預(yù)測與實驗結(jié)果之間出現(xiàn)差異的一個重要原因可能是酵母表達(dá)的酶有糖基化修飾但規(guī)律尚不完全清楚,因此分析時還難以考慮這方面的影響。

3 討論

本文將不同來源的纖維素、木聚糖等多糖水解酶類的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域更換黑曲霉耐熱型葡聚糖酶AnEglA6T本身的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,篩選到兩種保留了較高葡聚糖水解活性的融合體酶,AnEg-CBM9和AnEg-CBM10。檢測結(jié)果表明這兩種酶都具有明顯的水解微晶纖維素的能力,并且對濾紙的水解能力也有大幅度提高,可見CBM結(jié)構(gòu)域?qū)ζ暇厶敲改芊袼饨Y(jié)晶型纖維素具有關(guān)鍵性的作用。本文最有價值的研究結(jié)果是發(fā)現(xiàn)AnEglA6的CBD被來源于熒光假單胞菌的木聚糖酶的CBM10取代后得到的融合體酶AnEg-CBM10的熱穩(wěn)定性相較于AnEglA6T有顯著的提高。AnEg-CBM10在85 ℃下半衰期達(dá)到40 min左右,而AnEglA6T在同樣條件下半衰期不足5 min,同一條基因在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)產(chǎn)物AnEglA6K在85 ℃下半衰期大約為15 min[5]。本文構(gòu)建AnEg-CBM9的CBM9來源于極端嗜熱菌C.kristjanssonii,但獲得的融合體酶的耐熱性并沒有提高,這可能是由于CBM9的分子過大。有研究發(fā)現(xiàn),較大的CBM在改善融合體的熱穩(wěn)定性方面并不具有優(yōu)勢[19]。較大的 CBM 內(nèi)部通常包含多個較小的串行子模塊,這些子模塊具有不同的功能[20],后續(xù)研究可以考慮分別選取CBM9的部分模塊來構(gòu)建融合體,進(jìn)一步探索獲得高穩(wěn)定性葡聚糖酶的方法。與之相反,CBM10來源于假單胞菌,本身并不具有優(yōu)越的耐熱性,但獲得的融合體AnEg-CBM10的熱穩(wěn)定性卻有顯著的提高,這也在一定程度上說明較小的CBM可能更有利于耐熱酶的構(gòu)建。通過添加或更換CBM提高酶的耐熱性的研究已有報道,THONGEKKAEW等[21]將來自于里氏木霉的纖維素酶的CBD融合到隱球酵母的脂肪酶的羧基端,融合酶在80 ℃保溫2 h還具有80%的活性,而野生酶在80 ℃下保溫30 min就幾乎完全失活。王春娟等[22]將來自海棲熱袍菌的CBM27與宇佐美曲霉來源的β-甘露聚糖酶(Au Man5A)進(jìn)行融合,使后者的熱穩(wěn)定性提高了8 ℃。從文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果看,融合體酶的耐熱性有時比兩種供體來源的酶更加耐熱,本文獲得的AnEg-CBM10也具有這一特點,因此利用CBM探索構(gòu)建耐熱型融合體酶時不一定要局限于使用耐熱酶來源的CBM。

4 結(jié)論

本文將真菌高耐熱葡聚糖酶AnEglA6催化結(jié)構(gòu)域與熒光假單胞菌P.fluorescens的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM10融合獲得的融合體酶AnEg-CBM10在85 ℃下酶活力半衰期達(dá)到40 min,能短時耐受90 ℃高溫,并且對結(jié)晶型纖維素也有一定的水解能力,與AnEglA6相比,融合體酶在禽類飼料加工中具有更大的應(yīng)用潛力。