吳淑霞,李金珠,劉迎光

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦科,山東濟(jì)南 250022

人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素,HPV可根據(jù)致病能力差異分為低危型和高危型;多項(xiàng)研究表明,持續(xù)性高危型HPV16/18感染與宮頸病變發(fā)生、進(jìn)展聯(lián)系密切[1-3]。HPV DNA檢測(cè)已由基因分型初篩拓展至更精準(zhǔn)的特異性檢驗(yàn),但HPV感染并非宮頸病變的唯一原因,宮頸局部免疫微環(huán)境的免疫細(xì)胞功能和炎癥反應(yīng)具有高度組織特異性,可通過免疫應(yīng)答、免疫逃逸等機(jī)制促使高危型HPV持續(xù)感染、宮頸病變程度加重,故備受關(guān)注[4-5]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)屬T淋巴細(xì)胞亞群,在腫瘤細(xì)胞與機(jī)體免疫水平的分析中發(fā)揮重要作用;叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3陽性(FoxP3+)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)參與腫瘤免疫應(yīng)答整個(gè)調(diào)控過程,對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)十分關(guān)鍵[6-7]。宮頸灌洗液中炎癥因子表達(dá)異常與宮頸菌群及微環(huán)境改變有關(guān),可直觀反映宮頸感染狀態(tài)[8]。本研究分析了HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及宮頸灌洗液中炎癥因子與高危型HPV感染、宮頸病變的相關(guān)性,以期為高危型HPV持續(xù)感染臨床防治提供新的思路?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年9月至2021年2月本院收治的高危型HPV感染患者100例納入研究作為研究組,進(jìn)一步將其中50例高危型HPV16/18陽性患者作為HPV16/18組,50例其他12種高危型陽性患者作為其他亞型組(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68亞型中有一個(gè)以上為陽性)。研究組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理檢查確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變或?qū)m頸癌且均有高危型HPV感染;(2)自身免疫功能正常;(3)近3個(gè)月無抗HPV治療史、性激素用藥史、抗感染治療史;(4)無宮頸手術(shù)史、放化療史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)內(nèi)分泌異常;(2)處于哺乳、妊娠狀態(tài);(3)伴有結(jié)締組織疾病;(4)存在婦科惡性腫瘤病史;(5)蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估異常;(6)存在活動(dòng)性陰道感染;(7)肝腎功能障礙。另外,選取同期健康體檢女性50例作為對(duì)照組。研究組和對(duì)照組一般資料比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。納入研究者及家屬對(duì)本研究知情同意,愿意接受本研究相關(guān)檢測(cè)。

表1 一般資料比較

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 檢測(cè)標(biāo)本均于納入研究者經(jīng)期結(jié)束后3 d采集,采用宮頸刷在宮頸口鱗柱交接處逆時(shí)針輕微旋轉(zhuǎn)3圈并停留10 s,收集宮頸脫落細(xì)胞,置于細(xì)胞保存液中送檢。

1.2.2液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查、HPV檢測(cè) 將合格標(biāo)本采用液基薄層制片儀(愛爾蘭Cellslide系統(tǒng))完成制片,進(jìn)行巴氏染色后閱片。閱片結(jié)果包括以下類型:正常細(xì)胞、未確定意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)、鱗狀細(xì)胞癌。將細(xì)胞標(biāo)本采用蘇州華益美生物科技有限公司生產(chǎn)的HPV核酸分型檢測(cè)試劑盒以PCR-熒光法進(jìn)行檢測(cè),觀察檢測(cè)結(jié)果,若可見清晰的藍(lán)紫色圓點(diǎn)為陽性,否則為陰性;根據(jù)膜條HPV分型分布圖進(jìn)行亞型區(qū)分。

1.2.3HPV DNA負(fù)荷量檢測(cè) 無需陰道沖洗,將所收集的合格標(biāo)本采用HC-Ⅱ雜交捕獲試驗(yàn)試劑盒(美國(guó)Digene公司,第2代)進(jìn)行HPV DNA負(fù)荷量檢測(cè)。

1.2.4Th17檢測(cè) 采集受試者4 mL肘靜脈血,EDTA抗凝,室溫靜置15 min,離心(1 000 r/min,10 min),取下沉部分的血細(xì)胞與磷酸鹽緩沖液(PBS)等比例稀釋,再加入等體積的人淋巴細(xì)胞分離液,離心(1 500 r/min,15 min)吸取分層液云霧層,PBS洗滌后采用RPMI-1640培養(yǎng)液吹打混勻,采用流式細(xì)胞儀[廠家:艾森生物(杭州)有限公司,型號(hào):NovoCyte D1040]檢測(cè)外周血Th17水平。

1.2.5FoxP3+Treg檢測(cè) 將100 μL血液標(biāo)本加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋,將其加入96孔平板,使用離子霉素、丙二醇甲醚醋酸酯及莫能霉素工作液進(jìn)行混合,在CO2培養(yǎng)箱(5%)中培養(yǎng)5 h,棄上清液,加入10 μL CD4 FITC單克隆抗體。在避光狀態(tài)下保存15 min,PBS清洗,加入破膜劑,避光放置15 min,PBS再次清洗,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FoxP3+Treg水平。

1.2.6宮頸灌洗液中炎癥因子檢測(cè) 采用無菌鹽水(10 mL)注入宮頸后穹窿灌洗(受試者處于非月經(jīng)期且3 d內(nèi)無性生活),收集宮頸灌洗液,采用Luminex多重分析檢測(cè)宮頸灌洗液中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-17A水平。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較研究組和對(duì)照組HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中炎癥因子(IL-10、TNF-α、IL-17A)水平情況。(2)比較HPV16/18組、其他亞型組HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg、炎癥因子水平。(3)比較不同宮頸病變(包括宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)、宮頸癌)患者HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平。(4)分析HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平與高危型HPV感染及宮頸病變的相關(guān)性。(5)分析HPV DNA負(fù)荷量與Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子的相關(guān)性。(6)分析HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子對(duì)宮頸病變患者高危型HPV16/18陽性的診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1研究組和對(duì)照組HPV DNA、Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子水平比較 兩組HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 研究組和對(duì)照組HPV DNA、Th17、FoxP3+ Treg及炎癥因子水平比較

2.2HPV16/18組、其他亞型組HPV DNA、Th17、FoxP3+Treg、炎癥因子水平比較 HPV16/18組HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平均高于其他亞型組(P<0.05),見表3。

表3 HPV16/18組、其他亞型組HPV DNA、Th17、FoxP3+ Treg、炎癥因子水平比較

2.3不同宮頸病變患者HPV DNA、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平 不同宮頸病變患者HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 不同宮頸病變患者HPV DNA、FoxP3+ Treg、Th17及炎癥因子水平

2.4HPV DNA、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平與高危型HPV感染、宮頸病變的相關(guān)性分析 HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平與高危型HPV感染分型(HPV16/18=1,其他亞型=2)均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與宮頸病變(宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)=1,宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)=2,宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)=3,宮頸癌=4)均呈正相關(guān)(P<0.05),見表5。

表5 相關(guān)性分析結(jié)果

2.5HPV DNA負(fù)荷量與Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子的相關(guān)性分析 HPV DNA負(fù)荷量與Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平均呈正相關(guān)(r=0.692、0.724、0.605、0.587、0.631,P<0.05)。

2.6HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子診斷宮頸病變患者高危型HPV16/18陽性的ROC曲線分析 以HPV16/18陽性作為陽性樣本,其他亞型陽性作為陰性樣本,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg、IL-10、TNF-α、IL-17A單獨(dú)診斷高危型HPV16/18陽性的曲線下面積(AUC)分別為0.704(95%CI：0.604～0.791)、0.732(95%CI：0.634～0.816)、0.773(95%CI：0.679～0.851)、0.781(95%CI：0.687～0.858)、0.741(95%CI：0.644～0.823)、0.795(95%CI：0.703～0.869)。各項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷高危型HPV16/18陽性的AUC為0.911(95%CI：0.837～0.959),大于各指標(biāo)單獨(dú)診斷(P<0.05),見圖1、2。

圖1 各指標(biāo)單獨(dú)診斷高危型HPV16/18陽性的ROC曲線

圖2 各指標(biāo)聯(lián)合診斷高危型HPV16/18陽性的ROC曲線

3 討 論

高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的危險(xiǎn)因素,宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生高危型HPV感染后,HPV遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組DNA,改變癌基因、抑癌基因表達(dá),激活癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲活性,改變免疫調(diào)節(jié)基因表達(dá),導(dǎo)致免疫應(yīng)答紊亂[9-10]。HPV DNA負(fù)荷量與宮頸癌、宮頸病變程度的關(guān)系尚不十分明確,武振宇等[11]研究顯示,HPV DNA單獨(dú)檢測(cè)用于宮頸癌診斷的特異度、陽性預(yù)測(cè)值不足,需HPVE6/E7 mRNA檢測(cè)輔助診斷。本研究結(jié)果顯示,HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平隨宮頸病變程度加深而升高。分析原因:高危型HPV持續(xù)感染影響機(jī)體免疫耐受,Th17/Treg介導(dǎo)的免疫應(yīng)答失衡是宮頸病變患者體內(nèi)重要特征[12]。Treg作為輔助性T細(xì)胞亞群發(fā)揮機(jī)體免疫抑制功能,叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(FoxP3)是Treg的特征性分子標(biāo)志,廣泛存在于細(xì)胞生物中,參與FoxP3+Treg新陳代謝[13-14]。既往研究證實(shí),Treg與多種急慢性病毒感染、腫瘤疾病有關(guān),FoxP3+Treg水平在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌患者中明顯上升[15-17]。有報(bào)道指出,Treg可通過抑制T細(xì)胞殺傷作用或抑制抗體產(chǎn)生等協(xié)助腫瘤免疫逃逸[18]。HPV感染早期,FoxP3+Treg在宮頸病變進(jìn)展的免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避機(jī)制中發(fā)揮重要作用[19]。FoxP3+Treg水平升高表示病毒在免疫系統(tǒng)中的逃逸風(fēng)險(xiǎn)升高,可一定程度反映患者預(yù)后,對(duì)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展具有指導(dǎo)意義。

陳國(guó)艷等[20]的研究表明,宮頸病變患者外周血Th17水平與HPV感染有關(guān),可影響疾病進(jìn)展。Th17與Treg有同源性,Th17分泌的IL-17可促使癌細(xì)胞侵襲,Treg分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1可以導(dǎo)致抗腫瘤免疫耐受,增加癌細(xì)胞免疫逃逸機(jī)會(huì)[21]。研究組HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中IL-10、TNF-α、IL-17A水平均高于對(duì)照組,HPV16/18組各項(xiàng)指標(biāo)水平均高于其他亞型組,表明HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子共同參與了HPV感染發(fā)生、進(jìn)展,影響高危型HPV持續(xù)感染情況,分析可能與Th17、FoxP3+Treg異常表達(dá)打破機(jī)體免疫功能平衡有關(guān)。正常狀態(tài)下Th17、Treg在分化過程中互相影響、共同保持平衡,維持生殖道微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)態(tài);在宮頸病變過程中,二者平衡被打破,引起免疫功能紊亂[22]。另一方面,局部病灶部位炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)也可上調(diào)Treg水平,導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂,減弱機(jī)體對(duì)HPV的殺傷能力,增大持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)[23]。

本研究分析了FoxP3+Treg、Th17及宮頸灌洗液中炎癥因子水平分別與HPV感染、宮頸病變的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)HPV DNA負(fù)荷量、FoxP3+Treg、Th17及炎癥因子水平與高危型HPV感染分型相關(guān),與宮頸病變類型相關(guān),而且HPV DNA負(fù)荷量與Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子水平呈正相關(guān)。ROC分析顯示,HPV DNA負(fù)荷量、Th17、FoxP3+Treg及宮頸灌洗液中炎癥因子對(duì)宮頸病變患者高危型HPV16/18感染的診斷價(jià)值較高,而且聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC達(dá)0.911,進(jìn)一步證實(shí)高危型HPV16/18感染與上述指標(biāo)介導(dǎo)的免疫功能紊亂密切相關(guān),臨床可通過檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)來預(yù)測(cè)、評(píng)估宮頸病變患者高危型HPV16/18持續(xù)感染情況。

綜上所述,HPV DNA、Th17、FoxP3+Treg及炎癥因子表達(dá)與高危型HPV感染分型、宮頸病變聯(lián)系密切,HPV DNA負(fù)荷量與Th17、FoxP3+Treg、炎癥因子具有相關(guān)性,各項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)有利于臨床篩查宮頸惡性病變高?；颊?、防治高危型HPV持續(xù)感染,對(duì)改善患者預(yù)后具有指導(dǎo)意義。