王 丹,張前進(jìn),吳 娟△

宿遷市第一人民醫(yī)院:1.醫(yī)學(xué)檢驗科;2.泌尿外科,江蘇宿遷 223800

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,在發(fā)展中國家/地區(qū)病死率較高,主要癥狀為鏡下血尿或肉眼血尿,復(fù)發(fā)率較高[1]。微小RNA(miRNA)的相互作用是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制,在癌癥發(fā)展過程中具有重要作用,能影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[2]。miR-124主要存在于大腦中,能參與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)傳遞等,調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞活性,在癌組織中水平較低,能抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。曾有研究表明,miR-124能通過調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制膀胱癌的遷移和侵襲[4]。miR-124在膀胱癌、胃癌等癌組織中下調(diào),可作為膀胱癌、胃癌等癌癥進(jìn)展的腫瘤抑制因子[5]。miR-320a在乳腺癌、前列腺癌等癌癥中常表現(xiàn)為下調(diào),其與腫瘤分期有關(guān),miR-320a缺失會導(dǎo)致腫瘤相關(guān)促進(jìn)因子被激活,從而促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)展和侵襲[6]。曾有研究表明,與正常膀胱細(xì)胞相比,miR-320a在膀胱癌細(xì)胞中下調(diào),其過表達(dá)能抑制膀胱癌侵襲[7-8]。膀胱癌細(xì)胞中miR-124下調(diào),miR-124能通過抑制STAT3表達(dá)減少腫瘤生長[9]。miR-124-3p能靶向抑制內(nèi)皮素受體B型表達(dá)來調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的增殖和凋亡[10]。miR-124[11]、miR-320a[7]可通過調(diào)節(jié)FOXQ1影響膀胱癌的進(jìn)展,但二者是否與膀胱癌患者生存預(yù)后有關(guān)尚不明確,而且目前關(guān)于miR-124、miR-320a聯(lián)合評估膀胱癌生存預(yù)后的研究相對較少。因此,本研究主要分析膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平變化,并探討其在膀胱癌患者生存預(yù)后評估中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2018年2月至2020年2月收治的100例膀胱癌患者納入研究作為研究組,男64例、女36例,年齡34～75歲、平均(62.16±8.74)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理檢查確診,符合膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[12];(2)患者臨床資料完整;(3)未進(jìn)行過放療、化療等抗腫瘤治療;(4)隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他部位腫瘤;(2)其他臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷;(3)具有血液或免疫系統(tǒng)疾病;(4)近期接受過激素治療;(5)有急性泌尿系統(tǒng)感染。參照國際抗癌協(xié)會TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[13],將患者分為Ta+T1期41例、T2～T4期59例。另外,選取100例同期體檢健康者作為對照組,男60例、女40例,年齡35～73歲、平均(62.58±9.21)歲。研究組與對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入研究者對本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清miR-124和miR-320a水平 收集研究組入院時及對照組體檢時采集的空腹外周靜脈血標(biāo)本,采用RN4601型血清RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物)提取血清總RNA,再使用miRcute miRNA第1鏈cDNA合成試劑盒(德國Qiagen公司)得到cDNA。以U6作為內(nèi)參,引物經(jīng)設(shè)計軟件設(shè)計后由上海真固生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-124和miR-320a的相對表達(dá)水平(下稱水平)。引物序列見表1。

表1 miR-124、miR-320a qPCR檢測的引物序列(5′-3′)

1.2.2隨訪 對研究組的膀胱癌患者以電話或門診復(fù)查方式進(jìn)行為期3年隨訪,隨訪截止時間為2023年2月,記錄患者生存狀況,計算生存率。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-124和miR-320a水平比較 研究組血清miR-124、miR-320a水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

注:與對照組比較,*P<0.05。

2.2不同生存預(yù)后的膀胱癌患者血清miR-124、miR-320a水平比較 對研究組的膀胱癌患者隨訪36個月后(無失訪患者),共死亡27例(死亡組),生存73例(生存組)。對不同生存預(yù)后的患者血清miR-124和miR-320a水平進(jìn)行比較,生存組血清miR-124、miR-320a水平高于死亡組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注:與死亡組比較,*P<0.05。

2.3miR-124和miR-320a用于評估膀胱癌患者生存預(yù)后的價值 ROC曲線分析顯示,miR-124評估膀胱癌患者生存預(yù)后的AUC為0.823,截斷值為0.46,靈敏度為97.00%,特異度為69.86%;miR-320a評估膀胱癌患者生存預(yù)后的AUC為0.785,截斷值為0.40,靈敏度為88.89%,特異度為60.27%;二者聯(lián)合評估的AUC為0.880,靈敏度為92.57%,特異度為73.97%。聯(lián)合評估的效能優(yōu)于單一指標(biāo)(ZmiR-124 vs. 聯(lián)合=2.087,P=0.037;ZmiR-320a vs. 聯(lián)合=2.489,P=0.013)。見表2、圖3。

表2 血清miR-124和miR-320a水平用于膀胱癌患者生存預(yù)后評估的價值

圖3 血清miR-124、miR-320a水平用于評估膀胱癌患者生存預(yù)后的ROC曲線分析

2.4血清miR-124和miR-320a水平的相關(guān)性分析 以ROC曲線分析中獲得的miR-124、miR-320a截斷值(0.46、0.40)的作為分界值,分別將膀胱癌患者分為miR-124高水平(43例)、低水平(57例),miR-320a高水平(45例)、低水平(55例)。由Spearman相關(guān)性分析可知,膀胱癌患者血清miR-124水平高低和miR-320a水平高低呈正相關(guān)(r=0.432,P<0.05)。見表3。

表3 miR-124和miR-320a水平高低的相關(guān)性

2.5血清miR-124和miR-320a水平與臨床病理特征的關(guān)系 膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平與性別、年齡以及是否吸煙無關(guān)(P>0.05)。TNM分期為Ta+T1期、腫瘤最大徑≤3 cm、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a高水平比例分別高于TNM分期為T2～T4期、腫瘤最大徑>3 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表4。

表4 血清miR-124和miR-320a水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.6血清miR-124和miR-320a水平與膀胱癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 100例膀胱癌患者3年總生存率為73.00%(73/100)。miR-320a高水平患者3年總生存率為88.89%(40/45),miR-320a低水平患者3年總生存率為60.00%(33/55);miR-124高水平患者3年總生存率為88.37%(38/43),miR-124低水平患者3年總生存率為61.40%(35/57)。Kaplan-Meier法分析顯示,miR-124高水平患者3年累積生存率高于miR-124低水平患者(Log-rankχ2=9.314,P<0.05);miR-320a高水平患者3年累積生存率高于miR-320a低水平患者(Log rankχ2=10.827,P<0.05)。見圖4、5。

圖4 血清miR-124水平高低與膀胱癌患者3年累積生存率的關(guān)系

圖5 血清miR-320a水平與膀胱癌患者3年累積生存率的關(guān)系

2.7多因素Cox回歸分析膀胱癌患者生存預(yù)后的影響因素 以血清miR-124水平(低水平=0,高水平=1)、miR-320a(低水平=0,高水平=1)、TNM分期(Ta+T1=0,T2～T4=1)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移(是=0,否=1)、腫瘤最大徑(≤3 cm=0,>3 cm賦值1)為自變量,以患者生存預(yù)后(生存=0,死亡=1)為因變量,進(jìn)行Cox回歸分析,結(jié)果顯示,miR-124、miR-320a、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者生存預(yù)后的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 膀胱癌患者生存預(yù)后影響因素分析

3 討 論

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一,吸煙是其主要危險因素,此外多種致癌物的暴露也是其發(fā)病的危險因素,對膀胱癌高危人群針對性地進(jìn)行篩查可能會降低其病死率[13]。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及基因表達(dá)、蛋白功能障礙及多種信號通路,但具體的作用機(jī)制尚不明確[14]。miRNA能與mRNA結(jié)合,調(diào)節(jié)mRNA的翻譯和轉(zhuǎn)錄,從而控制基因的表達(dá),miRNA與腫瘤關(guān)系密切,能參與前列腺癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15-16],可作為腫瘤抑制因子或癌基因在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用[17]。因此,miRNA對膀胱癌的作用逐漸受到重視。

有研究表明,miR-320a在乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等癌細(xì)胞系和組織中顯著下調(diào)[18]。ZHANG等[19]報道,miR-124在膀胱癌癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)水平明顯較正常細(xì)胞/組織低,提高miR-124表達(dá)水平能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和發(fā)展,促使其凋亡。CAO等[20]報道,miR-124在膀胱癌細(xì)胞中呈低表達(dá),其過表達(dá)能抑制癌細(xì)胞活力,可能作為治療膀胱癌的靶向位點(diǎn)。在本研究中,膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a水平低于健康志愿者,Spearman分析顯示,膀胱癌患者血清中miR-124和miR-320a水平高低呈正相關(guān),提示miR-124和miR-320a可能通過某種相互的正反饋機(jī)制抑制膀胱癌的發(fā)生。

ROC曲線分析表明,血清miR-124和miR-320a聯(lián)合檢測評估膀胱癌患者生存預(yù)后的效能優(yōu)于單一指標(biāo),而且TNM分期為Ta+T1期、腫瘤最大徑≤3 cm、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a高水平比例分別顯著高于TNM分期為T2～T4期、腫瘤最大徑>3 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,提示miR-124和miR-320a與膀胱癌患者臨床病理特征及生存預(yù)后有關(guān)。承麗萍等[21]報道,胃癌組織中miR-320a水平明顯低于癌旁組織,miR-320a水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑有關(guān),與本研究結(jié)果具有一致性。本研究多因素Cox回歸分析顯示,miR-124、miR-320a、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者生存預(yù)后的影響因素,而且Kaplan-Meier法分析表明,miR-124、miR-320a高水平患者3年累積生存率高于miR-124、miR-320a低水平患者,這與王適等[22]和董奇觀等[23]的研究結(jié)果一致,提示血清miR-124、miR-320a對膀胱癌患者生存預(yù)后具有一定的評估價值,可作為評估膀胱癌患者生存預(yù)后的參考指標(biāo)。

綜上所述,膀胱癌患者血清miR-124和miR-320a呈低水平,與TNM分期、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),miR-124和miR-320a聯(lián)合檢測對評估患者生存預(yù)后具有重要價值。但是,本研究尚存在不足之處,如納入的樣本例數(shù)較少,樣本范圍單一等,而且關(guān)于miR-124、miR-320a影響膀胱癌的具體機(jī)制的研究較為缺乏,后續(xù)會采用多中心大樣本試驗,對本研究結(jié)果進(jìn)行驗證。