李娟娟,徐啟革,張 淼

青島市膠州中心醫(yī)院:1.內(nèi)分泌血液內(nèi)科;2.病理科;3.呼吸內(nèi)科,山東青島 266300

再生障礙性貧血(AA)是一種因骨髓微環(huán)境和骨髓造血干細(xì)胞受損導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭、全身血細(xì)胞數(shù)量減少的自身免疫性疾病,以青壯年多見(jiàn),在我國(guó)發(fā)病率為萬(wàn)分之0.74[1]。AA患者常出現(xiàn)感染、貧血、出血等癥狀,根據(jù)疾病嚴(yán)重程度分為重型AA及非重型AA,重型AA起病急,病情嚴(yán)重,疾病發(fā)展迅速,非重型AA疾病嚴(yán)重程度容易控制,但部分患者久治無(wú)效,病程長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年,嚴(yán)重威脅患者生命健康和生活質(zhì)量[2]。相關(guān)報(bào)道指出,AA發(fā)病機(jī)制主要為免疫機(jī)制異常[3]。miR-155-5p、miR-1260b均與AA的發(fā)生有關(guān)[4-5],通過(guò)有效的治療可降低二者血清水平。本課題組推測(cè)外周血外周血miR-155-5p、miR-1260b水平與疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān),但相關(guān)報(bào)道較少。為驗(yàn)證此推測(cè),指導(dǎo)臨床治療,本研究選取108例AA患者和102例健康志愿者進(jìn)行試驗(yàn),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2014年1月至2019年8月收治的初診AA患者108例納入研究作為觀察組,男55例,女53例,年齡21～57歲,平均(36.7±6.3)歲,病程7 d至13個(gè)月,平均(7.3±1.0)個(gè)月。其中,重型AA 53例,非重型AA 55例。觀察組所有患者均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[6]中AA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外,選取同期于本院體檢的健康志愿者102例作為健康組,男52例,女50例,年齡22～56歲,平均(37.6±6.3)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并嚴(yán)重心、肝、腎等原發(fā)疾病;(2)伴有心、肝、腎等重要臟器惡性腫瘤;(2)慢性高鈉血癥、應(yīng)激性高血糖、糖尿病;(3)酗酒;(4)妊娠、哺乳期婦女。觀察組和健康組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有受試者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):201401A01)。

1.2方法

1.2.1外周血miR-155-5p、miR-1260b水平檢測(cè) 觀察組在納入本研究次日(未接受治療前)及治療后,健康組在納入本研究次日進(jìn)行標(biāo)本采集。于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下取肘部靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC),于-80 ℃凍存。采用總RNA抽提試劑(Trizol,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)120617115,規(guī)格100 mL)提取PBMNC中的總核糖核酸(RNA),采用紫外分光光度法(上海美譜儀器有限公司,型號(hào)為UV-1800)檢測(cè)總RNA的純度與水平。取20 μL總RNA,采用多聚胸腺嘧啶、T重復(fù)寡核苷酸[Oligo(dT)]利用反轉(zhuǎn)錄酶(廠家:北京賽爾瑞成生命科學(xué)技術(shù)有限公司,中國(guó)北京,批號(hào):121025189A,規(guī)格:100 μL)反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA),反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為16 ℃ 30 min,42 ℃ 40 min,85 ℃5 min。再以cDNA為模板用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)miR-155-5p、miR-1260b水平(PCR擴(kuò)增儀由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司提供,型號(hào)為7300型),miR-155-5p引物:上游為5′-GTGGGTACTGCTATTCGTGCT-3′,下游為5′-GTCCGTGACGTGGCGTAG-3′;miR-1260b引物:上游為5′-GGCCTACCTACCACGTC-3′,下游為5′-GTCCGTGTGGTGGACTCG-3′;U6引物:上游為5′-GGTCGGCTGCACAGATACGA-3′,下游為5′-CGGTTCACTAAT TTCCGTGTGCT-3′。qPCR反應(yīng)條件如下,95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃60 s,共40個(gè)PCR循環(huán)。以U6為內(nèi)參物,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155-5p、miR-1260b的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2治療方法 (1)輸血支持:輸注紅細(xì)胞、血小板,參照文獻(xiàn)[7]。(2)分型治療:非重型AA患者予以環(huán)孢素A(江蘇九陽(yáng)生物制藥有限公司,批號(hào)131014HB,規(guī)格100 mg∶50 mL)聯(lián)合雄激素(十一酸睪酮注射液,浙江仙琚制藥股份有限公司,批號(hào)1307135682A,規(guī)格2 mL∶0.25 g)治療;重型AA患者年齡≤35歲者采用人類白細(xì)胞抗原(HLA)相合同胞供者造血干細(xì)胞移植治療,若HLA不匹配則采用抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)[賽諾菲(北京)制藥有限公司,中國(guó)北京,批號(hào)36190812AC,規(guī)格5 mL∶25 mg]聯(lián)合環(huán)孢素A維持治療,年齡>50歲者采用ATG聯(lián)合環(huán)孢素A維持治療,年齡>35～50歲者可采用與年齡≤35歲或年齡>50歲者相同的治療方案,所有患者維持治療期間若符合條件接受無(wú)關(guān)供者造血干細(xì)胞移植治療[8]。(3)維持治療:患者均續(xù)予以司坦唑醇(廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào)131012A,規(guī)格2 mg)聯(lián)合環(huán)孢素A治療6個(gè)月。隨訪1年。

1.3觀察指標(biāo) 所有患者均通過(guò)電話、門診復(fù)查等方式隨訪,截至2022年12月份。比較觀察組與健康組外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;比較重型AA患者、非重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;統(tǒng)計(jì)隨訪期間觀察組死亡例數(shù),計(jì)算病死率。病死率=死亡例數(shù)/觀察組總例數(shù)×100.00%;比較死亡患者與存活患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平;分析AA患者死亡的影響因素。

2 結(jié) 果

2.1健康組、觀察組外周血miR-155-5p、miR-1260b水平比較 觀察組外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于健康組(1.3±0.2vs.1.0±0.1、1.8±0.3vs.1.0±0.2,t=28.924、21.255,P<0.05)。觀察組治療后外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均低于治療前(1.2±0.1vs.1.3±0.2、1.4±0.3vs.1.8±0.3,P<0.05)。

2.2重型AA患者、非重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平比較 重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于非重型AA患者(1.4±0.1vs.1.2±0.2、2.0±0.2vs.1.58±0.2,t=5.706、10.854,P<0.05)。

2.3觀察組治療效果觀察 觀察組治療期間4例死亡,40例顯效(治療后Hb上升幅度≥30 g/L)、29例有效(治療后Hb上升但上升幅度<30 g/L),35例無(wú)效(治療后Hb未上升甚至下降)。

2.4外周血miR-155-5p、miR-1260b水平與AA患者死亡的關(guān)系 AA患者死亡45例(其中治療期間死亡4例、隨訪期間死亡41例),病死率為42.86%。死亡患者與存活患者的性別、年齡、骨髓增生程度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);死亡患者中重型AA患者比例高于非重型AA患者(P<0.05),死亡患者并發(fā)感染、出血比例,淋巴細(xì)胞與非造血細(xì)胞比值,治療前外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于存活患者(P<0.05),死亡患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞均值、基線血小板計(jì)數(shù)均低于存活患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AA患者死亡與存活的單因素分析[n(%)或

單因素分析顯示,臨床分型為重型AA,并發(fā)感染、出血,正細(xì)胞正色素性貧血、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞均值、淋巴細(xì)胞與非造血細(xì)胞比值、基線血小板計(jì)數(shù),治療前外周血miR-155-5p、miR-1260b水平、治療無(wú)效均與AA患者死亡有關(guān)(P<0.05),將這些因素納入多因素分析,發(fā)現(xiàn)上述因素及治療后miR-155-5p、miR-1260b水平均是AA患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 Cox回歸分析AA患者死亡的危險(xiǎn)因素

3 討 論

AA病因的復(fù)雜性和疾病本身的難治性導(dǎo)致該病病死率高[9]。盡管隨著醫(yī)療與科技的進(jìn)步,重型AA病死率得到有效控制,由90%降至30%以下[10],但仍對(duì)人類的生命健康有嚴(yán)重威脅。本研究中觀察組病死率為42.86%,高于吳鴻飛等[11]報(bào)道的7.9%,可能與患者治療方案、隨訪時(shí)間等差異有關(guān)。對(duì)AA患者死亡風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)十分必要,但目前尚無(wú)公認(rèn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示,觀察組外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均高于健康組,提示AA患者miR-155-5p、miR-1260b水平升高。miR-155是一個(gè)明星分子,參與機(jī)體免疫、造血、炎癥等多種生命活動(dòng)[12]。輔助性T細(xì)胞(Th)是T細(xì)胞的一個(gè)亞群,Th活化過(guò)程中,若miR-155表達(dá)增加,會(huì)促使Th0分化為Th1,導(dǎo)致Th1/Th2失衡,T細(xì)胞功能異常[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),在未分化的CD34+造血干細(xì)胞中miR-155呈現(xiàn)高表達(dá),它嚴(yán)密調(diào)控人類造血干細(xì)胞髓系和紅系細(xì)胞的分化,是維持機(jī)體正常造血功能的調(diào)節(jié)器[14]。miR-155-5p是miR-155的一個(gè)亞型,相關(guān)研究證實(shí)miR-155-5p在免疫反應(yīng)等過(guò)程中充當(dāng)重要角色[15]。本研究中AA患者miR-155-5p水平上升可能在Th1/Th2極化以及調(diào)控造血干細(xì)胞中發(fā)揮重大作用。miR-1260b被認(rèn)為具有類似癌基因的功能,可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路中具有抑癌作用的基因從而促進(jìn)腎細(xì)胞癌的發(fā)展[16]。AA患者miR-155-5p、miR-1260b高水平可能通過(guò)協(xié)同作用調(diào)控T細(xì)胞凋亡,使T細(xì)胞功能下降,降低對(duì)B細(xì)胞的抑制作用,B細(xì)胞功能亢進(jìn)而產(chǎn)生的大量自身抗體可會(huì)引起自身免疫病,從而促進(jìn)AA患者骨髓造血障礙,加重其疾病嚴(yán)重程度,增大死亡風(fēng)險(xiǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn),觀察組重型AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平高于非重型AA患者,死亡患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平高于存活患者,提示AA患者外周血miR-155-5p、miR-1260b水平與病情及預(yù)后有關(guān),重型AA中二者水平更高。李峻等[17]的研究顯示,重型AA和非重型AA患者miR-155-5p、miR-1260b水平均高于對(duì)照組人群,而且重型AA患者水平更高。相關(guān)研究結(jié)果顯示,miR-1260水平可影響惡性腫瘤患者的生存率[18]。本研究結(jié)果與上述報(bào)道的結(jié)果一致,提示外周血miR-155-5p、miR-1260b水平可用于評(píng)價(jià)AA患者的病情、預(yù)測(cè)其死亡風(fēng)險(xiǎn)。另外,本研究還顯示治療前后外周血miR-155-5p、miR-1260b水平均是AA患者死亡的危險(xiǎn)因素,與上述報(bào)道及分析一致[17-18]。

本研究結(jié)果中,正細(xì)胞正色素性貧血、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞均值水平、淋巴細(xì)胞與非造血細(xì)胞比值、基線血小板計(jì)數(shù)、并發(fā)感染、出血、無(wú)效均是AA患者死亡的影響因素,與既往相關(guān)研究報(bào)道一致[19-21]。正細(xì)胞正色素性貧血意味著骨髓造血功能受損;白細(xì)胞減少可引起感染,從而增加AA患者死亡的風(fēng)險(xiǎn);網(wǎng)織紅細(xì)胞均值降低意味著骨髓造血功能被抑制、病情重,可增加死亡風(fēng)險(xiǎn);淋巴細(xì)胞與非造血細(xì)胞比值升高,T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn),導(dǎo)致造血組織損傷;AA患者出血與血小板計(jì)數(shù)減少、血小板功能下降有關(guān),加重貧血癥狀、增加出血和死亡風(fēng)險(xiǎn);AA患者并發(fā)感染會(huì)進(jìn)一步抑制骨髓造血功能,造血干細(xì)胞增殖受到抑制,一些病毒、細(xì)菌侵襲感染導(dǎo)致中粒細(xì)胞難以生存,死亡風(fēng)險(xiǎn)升高;無(wú)效患者可因病情控制不理想導(dǎo)致死亡風(fēng)險(xiǎn)增高。

綜上所述,臨床分型為重型AA,并發(fā)感染、出血,正細(xì)胞正色素性貧血、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞均值、淋巴細(xì)胞與非造血細(xì)胞比值、基線血小板計(jì)數(shù),外周血miR-155-5p、miR-1260b水平,治療無(wú)效均是AA患者死亡的影響因素。外周血miR-155-5p、miR-1260b水平可作為AA患者嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。另外,由于本試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、所選病例時(shí)間較早等,患者的治療方案與2022版《再生障礙性貧血診斷與治療中國(guó)指南》[22]有出入,會(huì)影響研究結(jié)果,后續(xù)應(yīng)更新治療方案探討該問(wèn)題,以期更好地服務(wù)于臨床。