任艷艷,楊宏鋒

江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,江蘇鎮(zhèn)江 212000

膿毒癥是由感染引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫功能紊亂,會(huì)導(dǎo)致各個(gè)器官的炎癥損傷。早期診斷膿毒癥并予以適當(dāng)?shù)目咕幬?、液體和血管活性藥物治療對(duì)減少器官/系統(tǒng)損傷和降低病死率十分重要[1-2]。膿毒癥的診斷具有滯后性,但患者的病情發(fā)展非常迅速,如果不能得到及時(shí)、有效地治療,患者往往會(huì)發(fā)展為膿毒性休克,病死率較高[3]。因此,尋找評(píng)估膿毒癥預(yù)后的生物評(píng)估指標(biāo),對(duì)于降低病死率顯得十分重要[4]。circRNA是一類(lèi)非編碼RNA,是由轉(zhuǎn)錄本兩端的共價(jià)鍵結(jié)合而形成的閉環(huán)結(jié)構(gòu),主要在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,已有研究證實(shí)circRNA可以影響膿毒癥發(fā)病[5-6]。有研究證明,環(huán)狀RNA液泡ATP酶組裝因子(circVMA21)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥中發(fā)揮作用[7]。但是,膿毒癥患者血清中circVMA21表達(dá)水平及其對(duì)膿毒癥的影響和作用機(jī)制尚不明確,本研究檢測(cè)膿毒癥患者血清circVMA21水平,并對(duì)其在膿毒癥患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值進(jìn)行分析,從而為膿毒癥的早期治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年7月至2022年12月本院收治的200例膿毒癥患者納入研究作為膿毒癥組,其中男105例,女95例,年齡18～70歲,平均(50.45±6.97)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)通過(guò)檢查診斷為膿毒癥的患者,并且符合膿毒癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8],(2)肝腎功能正常,(3)首次確診。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并自身免疫等免疫系統(tǒng)疾病,(2)合并慢性炎癥反應(yīng)疾病,(3)合并血液系統(tǒng)疾病,(4)合并肝腎疾病、惡性腫瘤,(5)妊娠期或哺乳期女性,(6)信息缺失及無(wú)法配合研究者。另外,選取同期于本院治療的普通感染患者200例作為對(duì)照組(普通感染患者是指未引起嚴(yán)重臟器功能損害的感染者),其中男101例,女99例,年齡19～69歲,平均(51.23±6.78)歲。納入研究者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 記錄納入研究者性別、年齡、體重、身高、體重指數(shù)(BMI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、血清超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEU)、血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血紅蛋白(Hb)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cr)、血?dú)夥治鲋笜?biāo)血氧飽和度(SaO2)等各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2標(biāo)本采集與保存 納入研究者入院后24 h內(nèi)采集5 mL空腹靜脈血標(biāo)本,于室溫靜置30 min后,3 000 r/min離心15 min,取上層血清,密封放置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.3各項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α水平,試劑盒采購(gòu)于上海酶聯(lián)生物公司(貨號(hào):ml077385)。采用日本希森美康公司XN-1000型血細(xì)胞分析儀通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定WBC、NEU。采用美國(guó)雅培公司Ci8200型全自動(dòng)生化分析儀通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CK-MB水平,通過(guò)電化學(xué)法檢測(cè)cTnI水平,通過(guò)比濁法檢測(cè)hs-CRP水平。血常規(guī)檢測(cè)采用邁瑞B(yǎng)C5800型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)Hb水平。采用日立7170型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、Cr水平。采用飛利浦VM6型心電監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)SaO2水平。各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.4血清circVMA21水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)法測(cè)定血清circVMA21水平,使用Trizol(Invitrogen)試劑提取血清總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA純度和濃度,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將部分RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用SYBR Premix EX TaqTM試劑盒配制qPCR反應(yīng)體系,引物序列見(jiàn)表1,引物由尚亞生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算circVMA21的相對(duì)表達(dá)水平,GAPDH作為內(nèi)參。為排除實(shí)驗(yàn)誤差,所有檢測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行檢測(cè)。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.5計(jì)算SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分 計(jì)算膿毒癥患者序貫性器官衰竭(SOFA)評(píng)分、急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分。SOFA評(píng)分≥2分時(shí),可診斷為膿毒癥。APACHEⅡ評(píng)分分值越高說(shuō)明病情越嚴(yán)重。

1.2.6隨訪(fǎng) 對(duì)患者治療后28 d內(nèi)的生存情況進(jìn)行隨訪(fǎng)。根據(jù)膿毒癥患者治療后28 d是否存活,將其分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清circVMA21水平比較 膿毒癥組血清circVMA21水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.69±0.15vs.1.03±0.26,P<0.05)。

2.2血清circVMA21水平與SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性 膿毒癥患者血清circVMA21水平與SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.553、-0.543,P<0.001),見(jiàn)圖1、2。

圖1 膿毒癥患者血清circVMA21水平與SOFA評(píng)分的相關(guān)性

圖2 膿毒癥患者血清circVMA21水平與APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性

2.3預(yù)后不良組和預(yù)后良好組血清circVMA21水平比較 根據(jù)膿毒癥患者治療后28 d的存活情況,將其分為預(yù)后良好組128例和預(yù)后不良組72例。預(yù)后不良組血清circVMA21水平低于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.46±0.12vs.0.82±0.17,P<0.05)。

2.4不同預(yù)后的膿毒癥患者臨床資料比較 兩組間男女比例、年齡、ALT、AST、Hb、Cr、SaO2比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。預(yù)后不良組CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA評(píng)分、APACHEⅡ高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同預(yù)后的膿毒癥患者臨床資料比較[n(%)或

2.5血清circVMA21水平對(duì)膿毒癥患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值 以circVMA21水平為檢驗(yàn)變量,以膿毒癥患者是否預(yù)后不良(否=0,是=1)為狀態(tài)變量,繪制ROC曲線(xiàn)。分析顯示,circVMA21水平用于預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后不良的曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.848(95%CI：0.793～0.902),當(dāng)截?cái)嘀禐?.55,靈敏度為83.30%,特異度為78.90%,約登指數(shù)為0.622,見(jiàn)圖3。

圖3 circVMA21水平用于預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)

2.6Kaplan-Meier法分析circVMA21與膿毒癥患者預(yù)后生存的關(guān)系 對(duì)膿毒癥患者治療后進(jìn)行28 d隨訪(fǎng),以ROC曲線(xiàn)分析中得到的circVMA21相對(duì)表達(dá)水平用于預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后不良的截?cái)嘀禐榻?將患者分為circVMA21>0.55與circVMA21≤0.55兩組。Kaplan-Meier法分析顯示,兩組間累積生存率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=5.138,P=0.023),見(jiàn)圖4。

圖4 circVMA21水平與膿毒癥患者預(yù)后生存期的關(guān)系

2.7Logistic回歸分析膿毒癥患者預(yù)后的影響因素 以膿毒癥患者是否預(yù)后不良為因變量(否=0,是=1),以CK-MB入院實(shí)測(cè)值、cTnI入院實(shí)測(cè)值、hs-CRP入院實(shí)測(cè)值、TNF-α入院實(shí)測(cè)值、WBC入院實(shí)測(cè)值、NEU入院實(shí)測(cè)值、APACHEⅡ入院實(shí)測(cè)值及circVMA21(相對(duì)表達(dá)水平>0.55=0,≤0.55=1)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。分析結(jié)果顯示,APACHEⅡ是膿毒癥患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,circVMA21為保護(hù)因素(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 影響膿毒癥患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

膿毒癥是一種由創(chuàng)傷性感染引發(fā)的疾病,其病原體微生物包括真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和病毒等[9]。嚴(yán)重創(chuàng)傷、多發(fā)傷、大手術(shù)或休克可能會(huì)導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生。隨著病情的加重,膿毒癥可以發(fā)展為多器官衰竭,甚至死亡[10]。能夠在膿毒癥早期準(zhǔn)確評(píng)估患者病情和預(yù)后并及時(shí)予以治療,對(duì)于改善患者預(yù)后有十分重要的意義[11]。經(jīng)典的檢測(cè)指標(biāo)有利于膿毒癥的診斷,但在一定程度上有靈敏度和特異度的缺陷。因此,尋找靈敏度和特異度較高的用于膿毒癥早期診斷和預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)是目前臨床研究的熱點(diǎn)[12]。

circRNAs可能在調(diào)節(jié)患者對(duì)不同病原體(細(xì)菌和病毒)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮十分重要的作用,例如在包括膿毒癥在內(nèi)的多種疾病的早期患者中出現(xiàn)circRNAs的失調(diào),雖然膿毒癥患者中circRNA水平發(fā)生改變,但控制這些circRNA失調(diào)的具體作用機(jī)制尚未完全明確[13]。有研究發(fā)現(xiàn)circRNAs影響了膿毒癥的發(fā)病[14]。還有研究證實(shí)hsa_circRNA_104484、hsa_circRNA_104670這兩種circRNA可以作為膿毒癥的診斷標(biāo)志物[15]。circVMA21可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-9-39/SMG1/炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),在調(diào)節(jié)膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷中發(fā)揮重要作用[16]。還有研究證明circVMA21通過(guò)靶向miR-497-5p/CD2AP改善了膿毒癥大鼠模型的肺損傷,circVMA21可能是膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷新的治療靶點(diǎn)[17]。

在本研究中,相較于對(duì)照組,膿毒癥組CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分較高;相較于預(yù)后良好組,預(yù)后不良組CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA評(píng)分、APACHEⅡ水平也較高。本研究的結(jié)果與既往研究的結(jié)果一致[18],提示CK-MB、cTnI、hs-CRP、TNF-α、WBC、NEU、SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分可能與膿毒癥的發(fā)生有關(guān)。膿毒癥組circVMA21水平較低,而且預(yù)后不良組circVMA21水平低于生存組,說(shuō)明circVMA21可能參與了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展,臨床中應(yīng)及時(shí)檢測(cè)其表達(dá)水平,對(duì)評(píng)估膿毒癥的發(fā)生有一定的價(jià)值。circVMA21水平與SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分均呈負(fù)相關(guān),SOFA評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分可反映膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度,circVMA21水平越低,表示患者病情越嚴(yán)重。ROC曲線(xiàn)分析顯示,circVMA21對(duì)膿毒癥預(yù)后不良有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值,提示circVMA21可作為膿毒癥患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。APACHEⅡ是影響膿毒癥患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素,circVMA21為保護(hù)因素,提示血清circVMA21水平和APACHEⅡ評(píng)分對(duì)評(píng)估膿毒癥患者預(yù)后評(píng)估有一定價(jià)值。

綜上所述,膿毒癥患者血清circVMA21水平降低,而且預(yù)后不良患者血清circVMA21水平較預(yù)后良好患者低,與APACHEⅡ評(píng)分有關(guān),提示膿毒癥患者血清circVMA21可能與該病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究為臨床研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究方向,但circVMA21水平對(duì)膿毒癥的影響及具體的作用機(jī)制還有待研究。本研究納入病例數(shù)較少,并且未進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,沒(méi)有對(duì)膿毒癥患者不同時(shí)期血清circVMA21進(jìn)行比較,結(jié)果可能存在一定的偏倚,今后需增加樣本量進(jìn)行研究和探討。