魏麗榮 綜述,杜玉珍 審校

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 201306

游離DNA是細(xì)胞凋亡、壞死和自噬等過程中釋放到血液、腹水、腦脊液、唾液、胸腔積液和尿液等體液中的DNA片段,長度為150～200 bp[1]。游離DNA的產(chǎn)生和清除是一個(gè)動態(tài)過程,半衰期為5～150 min,因此游離DNA可以對全身死亡細(xì)胞進(jìn)行“快照”,這一特點(diǎn)使其成為許多疾病的檢測目標(biāo)[2]。健康人的血漿中含有0～100 ng/mL的游離DNA,而在以細(xì)胞死亡和損傷為特征的疾病(包括癌癥、創(chuàng)傷、敗血癥和糖尿病等)患者的血漿中游離DNA水平可高達(dá)1 000 ng/mL[3],但這種游離DNA水平的顯著升高是非特異性的,無法明確游離DNA的組織細(xì)胞來源[4]。對游離DNA甲基化模式進(jìn)行分析,則可以溯源到相應(yīng)的組織或細(xì)胞,從而幫助判斷特定疾病的發(fā)生和進(jìn)展。

DNA甲基化是最廣泛存在并深入研究的表觀遺傳修飾類型,參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、基因組印記、維持X染色體失活、染色體維持和基因組穩(wěn)定性等重要過程,同時(shí)在個(gè)體發(fā)育、癌癥、自身免疫性疾病、代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和衰老等生理病理過程中發(fā)揮重要作用[5-9]。游離DNA甲基化模式具有組織特異性,與基因堿基突變信息相比,與來源細(xì)胞具有更好的一致性,因此,液體活檢樣本游離DNA甲基化的研究為特定疾病的微創(chuàng)檢測和監(jiān)測潛在病變提供了可能。游離DNA甲基化已應(yīng)用于多種異常疾病的診斷[10-12],特別在腫瘤早篩、微小病灶殘留和復(fù)發(fā)預(yù)測中的運(yùn)用是目前研究的熱門領(lǐng)域[13]。除腫瘤之外,游離DNA甲基化還與其他疾病的診療密切相關(guān),包括神經(jīng)退行性疾病、精神性疾病、心血管疾病、糖尿病及出生缺陷等。本文將重點(diǎn)闡述游離DNA甲基化檢測技術(shù)及其在上述非腫瘤疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 游離DNA甲基化檢測技術(shù)

DNA甲基化是指胞嘧啶或腺嘌呤在甲基化結(jié)合蛋白(MBDs)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下,從S-腺苷甲硫氨酸中獲得甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾。人體基因組中含量最高的甲基化修飾是5-甲基胞嘧啶(5mC),以及5mC經(jīng)TET蛋白催化形成的5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)修飾[14]。5mC和5hmC修飾具有組織特異性,也是目前游離DNA甲基化檢測技術(shù)的主要分析目標(biāo)。

游離DNA甲基化檢測技術(shù)一般需要5個(gè)步驟,包括體液樣本采集、游離DNA提取、游離DNA預(yù)處理、甲基化位點(diǎn)的檢測和數(shù)據(jù)分析。由于游離DNA甲基化并沒有產(chǎn)生堿基序列的差異,5mC和5hmC的甲基基團(tuán)位于DNA雙螺旋的溝槽中,因此直接采用傳統(tǒng)PCR、雜交或測序的方法檢測,無法判別胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化修飾。早期的游離DNA甲基化分析方法都需要先對DNA序列進(jìn)行預(yù)處理,然后再通過PCR擴(kuò)增、測序或雜交等方法進(jìn)行后續(xù)的分析。目前主要有4種預(yù)處理方法:重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法、限制性內(nèi)切酶法、親和富集法和TET酶轉(zhuǎn)化法[15-16]。4種預(yù)處理方法的原理和基于該預(yù)處理方法的游離DNA甲基化檢測技術(shù)如下:(1)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法原理是亞硫酸氫鹽處理后,5mC不變,非甲基化的胞嘧啶(C)變?yōu)槟蜞奏?U),再通過PCR反應(yīng)轉(zhuǎn)換為胸腺嘌呤(T),從而將甲基化修飾的差異轉(zhuǎn)化為序列的差異,最后通過識別C或T來鑒定胞嘧啶是否被甲基化修飾;基于該預(yù)處理法的技術(shù)有全基因組甲基化測序、亞硫酸鹽后接頭標(biāo)記測序、甲基化CpG串聯(lián)擴(kuò)增和測序、靶基因重壓硫酸鹽測序、甲基化芯片、氧化亞硫酸氫鹽測序和TET輔助的重亞硫酸鹽測序等。(2)限制性內(nèi)切酶法原理是基于特定的限制性內(nèi)切酶特異性剪切甲基化或非甲基化序列,經(jīng)大小選擇后,對未甲基化的CpG島區(qū)域進(jìn)行檢測;基于該預(yù)處理法的技術(shù)有簡化基因組甲基化測序、單細(xì)胞簡化代表性重亞硫酸鹽測序、甲基化特異性PCR、甲基化特異性數(shù)字PCR等。(3)親和富集法原理是利用抗體或MBDs的特異性來富集甲基化的基因組區(qū)域,用于后續(xù)分析;基于該預(yù)處理法的技術(shù)有甲基化cfDNA免疫沉淀測序、甲基-CpG結(jié)合域測序、甲基化芯片和5hmC選擇性化學(xué)標(biāo)記方法等。(4)TET酶轉(zhuǎn)化法原理是利用TET蛋白將5mC先轉(zhuǎn)化為5hmC,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為5-羧基胞嘧啶(5caC),隨后5caC經(jīng)吡啶硼烷處理和PCR擴(kuò)增等過程轉(zhuǎn)化為T,再進(jìn)行下一步分析;基于該預(yù)處理法的技術(shù)有TET輔助吡啶硼烷測序和酶法甲基化測序等。上述基于4種預(yù)處理方法的甲基化檢測技術(shù)中,重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法是最常用和高效的方法;限制性內(nèi)切酶法簡單、省時(shí)且特異度強(qiáng),但游離DNA的高度碎片化特征導(dǎo)致的基因組覆蓋率低和限制位點(diǎn)丟失,會對結(jié)果造成一定的干擾;親和富集法適合CpG密度較高的序列;TET酶轉(zhuǎn)化法較為溫和,并且可以降低成本[16-24]。

隨著第三代測序技術(shù)的興起,目前還出現(xiàn)了無須預(yù)處理,直接檢測游離DNA甲基化的技術(shù),即PacBio單分子實(shí)時(shí)測序(SMRT)法和Nanopore測序法[25-26]。PacBio SMRT法測序原理是通過熒光信號時(shí)間延遲效應(yīng)檢測DNA甲基化修飾,在測序過程中,聚合酶遇到堿基上帶有甲基化修飾的堿基時(shí),合成速度變慢導(dǎo)致光譜發(fā)生改變,從而檢出堿基甲基化修飾;而Nanopore測序法原理是4種堿基(A、T、C、G)及帶有甲基化修飾的堿基通過單納米孔時(shí),孔兩側(cè)產(chǎn)生電信號差異不同,從而實(shí)現(xiàn)甲基化修飾的檢測。這兩種方法均可實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率,避免游離DNA預(yù)處理過程對游離DNA的損耗;同時(shí)二者無需PCR擴(kuò)增過程,極大減少了因擴(kuò)增導(dǎo)致的誤差。另外,Nanopore測序法對于長堿基測序具有獨(dú)特優(yōu)勢,因此也受到了越來越多的關(guān)注。以上的游離DNA甲基化檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn),由于血漿或其他體液中游離DNA水平極低,應(yīng)根據(jù)游離DNA樣本起始量及實(shí)際的分析目的,選擇合適的方法進(jìn)行檢測[21,27]。

2 游離DNA甲基化在非腫瘤疾病中的研究現(xiàn)狀

游離DNA的甲基化可以進(jìn)行器官和組織溯源,發(fā)生病變的器官會增大釋放到血液中的游離DNA的量,同時(shí)一些慢性病還有特殊的甲基化信號。這些信息為DNA甲基化進(jìn)行器官和組織的衰老和疾病評估提供了基礎(chǔ)。通過比較非腫瘤疾病患者與健康者的游離DNA甲基化模式,可以鑒別出疾病相關(guān)的特征,從而實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷。非腫瘤疾病進(jìn)展和治療過程中,相關(guān)細(xì)胞的死亡和損傷程度的變化也會反映在游離DNA甲基化模式的改變上,因此游離DNA甲基化還可用于評估疾病進(jìn)展或治療效果。目前,對于游離DNA甲基化在一些非腫瘤性疾病診療中的運(yùn)用已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。

2.1游離DNA甲基化與神經(jīng)退行性疾病

2.1.1阿爾茨海默病(AD) AD的早診對于治療有很高的價(jià)值,CHEN等[28]對于在阿爾茲海默癥不同階段的雙胞胎的血液游離DNA的甲基化進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因位點(diǎn)的甲基化水平有差異。BAHADO-SINGH等[29]通過對26名AD患者和26名健康對照組的血液游離DNA的全基因組DNA甲基化分析,篩選獲得3 684個(gè)有顯著差異的CpG甲基化位點(diǎn),然后使用6種人工智能算法構(gòu)建了AD的診斷模型,曲線下面積(AUC)可達(dá)0.949～0.998,提示游離DNA甲基化可用于AD的診斷。

2.1.2早發(fā)性帕金森病(EOPD) EOPD是一種罕見的帕金森病亞型,有研究者通過分析EOPD患者和對照人群的腦脊液中游離DNA的全甲基化譜,在EOPD中鑒定出2 220個(gè)差異甲基化基因,結(jié)果顯示EOPD患者中高甲基化的基因數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了低甲基化,這些基因與神經(jīng)元功能和免疫反應(yīng)相關(guān),提示腦脊液游離DNA甲基化有作為EOPD診斷標(biāo)志物的潛力[30]。

2.1.3癲癇 顳葉內(nèi)側(cè)面癲癇伴海馬硬化(MTLE-HS)是常見的癲癇綜合征,MTLE-HS患者的腦組織中存在顯著的DNA甲基化差異[31],在此基礎(chǔ)上,研究人員分析了內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者的血清游離DNA樣本的DNA甲基化譜,并將其與從健康對照中獲得的樣本進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示MTLE-HS患者的游離DNA甲基化組分析可以作為癲癇患者神經(jīng)元細(xì)胞死亡的預(yù)測、診斷或預(yù)后工具[32]。

2.1.4肌萎縮側(cè)索硬化(ALS) ALS是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病,可導(dǎo)致肌肉無力、語言和吞咽障礙,最終導(dǎo)致呼吸衰竭和死亡的癱瘓。對20名診斷患有ALS的患者的血漿游離DNA分析結(jié)果顯示,與健康者相比,ALS患者RHBDF2基因的啟動子增強(qiáng)子區(qū)有2個(gè)CpG的甲基化狀態(tài)升高[33]。另外有研究分析了96名ALS患者的血液游離DNA甲基化水平的分析,結(jié)果也顯示了血液游離DNA甲基化模式對ALS患者的診斷潛力[34-35]。

2.2游離DNA甲基化與精神性疾病

2.2.1精神分裂癥 精神分裂癥目前還沒有可以幫助其診斷和病程預(yù)測的生物標(biāo)記物。LUBOTZKY等[36]開發(fā)了一種大腦特異性DNA甲基化標(biāo)記物檢測方法,用于評估首次精神病發(fā)作患者血漿中是否存在腦源性游離DNA,結(jié)果顯示該方法對首次精神分裂癥發(fā)作的患者診斷的AUC為0.770,對精神病發(fā)作患者的靈敏度為65%,特異度為90%。表明腦特異性游離DNA甲基化標(biāo)記物可能有助于精神分裂癥的早期檢測和監(jiān)測,從而實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)和充分治療。

2.2.2雙相情感障礙(BD) 快速循環(huán)型BD患者是指1年內(nèi)有4次以上的躁狂和抑郁發(fā)作,此類患者有更嚴(yán)重的自殘和自殺傾向。目前的研究發(fā)現(xiàn)游離DNA甲基化對于快速循環(huán)型BD患者的鑒別診斷也具有重要價(jià)值,HO等[37]的一項(xiàng)研究分析了46名快速循環(huán)型BD患者和47名非快速循環(huán)型BD患者的血漿游離DNA,并使用850K Infinium MethylationEPIC芯片檢測游離DNA甲基化水平,從中篩選獲得了4個(gè)對快速循環(huán)型BD患者有診斷價(jià)值的CpG甲基化位點(diǎn),表明游離DNA甲基化具有作為快速循環(huán)型BD患者生物標(biāo)志物的潛力。

2.3游離DNA甲基化與心血管疾病

2.3.1胸主動脈夾層(TAD) TAD是致命的主動脈疾病之一,目前對其發(fā)病機(jī)制的了解有限。有研究使用全基因組亞硫酸氫鹽分析了TAD患者中游離DNA中甲基化譜的變化,結(jié)果顯示TAD患者游離DNA中存在許多差異甲基化區(qū)域,相關(guān)基因在脈管系統(tǒng)和心臟發(fā)育功能富集,基于此構(gòu)建的預(yù)測模型可以實(shí)現(xiàn)TAD患者的分類診斷[38]。

2.3.2心肌梗死和體外循環(huán)(CPB)損傷 心肌梗死過程中,有大量的心肌細(xì)胞死亡并釋放游離DNA到血漿中。ZEMMOUR等[39]發(fā)現(xiàn)心臟特異性的血漿游離DNA非甲基化FAM101A,在ST段抬高性心肌梗死患者中高于健康對照者,可用于診斷心梗。LIU等[40]通過甲基化CpG短串聯(lián)擴(kuò)增與測序技術(shù)(MCTA-Seq)鑒定了6個(gè)心臟特異性高甲基化模式的CGCGCGG位點(diǎn),并開發(fā)了一種檢測CORO6甲基化位點(diǎn)的ddPCR檢測方法,用于心肌梗死的診斷,診斷靈敏度為46%,特異度為80%。

CPB是將患者的血液從心肺流轉(zhuǎn)到體外構(gòu)建新循環(huán)的治療手段,CPB被認(rèn)為會導(dǎo)致延遲性的心臟損傷。有研究分析42名接受開胸手術(shù)的嬰兒血漿中的心臟游離DNA甲基化標(biāo)志物,結(jié)果顯示游離DNA甲基化可以提示與CPB相關(guān)的心臟損傷,監(jiān)測心臟細(xì)胞死亡,從而達(dá)到預(yù)測手術(shù)的臨床結(jié)果和評估心臟保護(hù)性干預(yù)措施的效果[41]。

2.3.3妊娠期高血壓(HDP) 妊娠期高血壓(HDP)對圍生期發(fā)病率和病死率有很大影響。SPINELLI等[42]通過分析妊娠11～14周的HDP患者的游離DNA甲基化譜,發(fā)現(xiàn)差異甲基化區(qū)域和注釋基因的評估可以預(yù)測妊娠早期先兆子癇和心血管疾病易感性。

2.4游離DNA甲基化與糖尿病 甲基化修飾在糖尿病進(jìn)展中起著重要的作用,高甲基化和低甲基化都會影響身體代謝[43]。研究發(fā)現(xiàn)差異甲基化的前胰島素原基因的游離DNA在檢測β細(xì)胞死亡方面具有良好的靈敏度和特異度[44-45]。此外,檢測血清中β細(xì)胞來源的差異甲基化胰島素DNA可用于預(yù)測高危人群患1型糖尿病的可能性,以及評估2型糖尿病、妊娠糖尿病、胰島移植和胰島特異性免疫治療中的β細(xì)胞死亡,表明游離DNA甲基化對于糖尿病的診斷和治療檢測具有潛在的運(yùn)用價(jià)值[10,46-49]。

2.5游離DNA甲基化與出生缺陷 胎兒和母體基因組的甲基化狀態(tài)不同,基于此,LUN等[50]在妊娠早期、晚期及分娩后收集的母體血液樣本,測序分析胎兒、胎盤和母體血漿游離DNA甲基化譜,發(fā)現(xiàn)21三體胎兒的游離DNA的21號染色體甲基化密度顯著降低;YU等[51]使用 PacBio SMRT法分析母體血漿當(dāng)中的長片段游離DNA甲基化,發(fā)現(xiàn)該方法可應(yīng)用于脆性X綜合征風(fēng)險(xiǎn)的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測;GORDEVIIUS等[52]通過uCG 特異性束縛寡核苷酸引物測序和5hmC 特異性束縛寡核苷酸引物測序方法檢測到胎兒絨毛膜組織樣本中5hmC,在檢測胎兒唐氏綜合征可以達(dá)到100%的準(zhǔn)確性。說明游離DNA甲基化是進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測良好的標(biāo)志物。

2.6游離DNA甲基化與其他疾病 除了上述疾病,還有一些研究發(fā)現(xiàn)游離DNA甲基化在異體移植不良反應(yīng)、重癥急性胰腺炎和新型冠狀病毒肺炎組織損傷中也具有較好的診斷和預(yù)測價(jià)值[53-56]。對于非腫瘤疾病,游離DNA甲基化相關(guān)研究還相對較少,并且現(xiàn)有的人類DNA甲基化數(shù)據(jù)庫還存在著很大的局限性,缺乏組織常駐免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞等的甲基化圖譜,給游離DNA甲基化細(xì)胞溯源帶來了困難,限制了游離DNA的臨床應(yīng)用場景。在未來還需要更多的研究,篩選特定疾病相關(guān)細(xì)胞的特異性游離DNA甲基化圖譜,為開發(fā)覆蓋更大甲基化譜系信息和更多疾病的游離DNA甲基化檢測奠定基礎(chǔ)。

3 小結(jié)與展望

本綜述小結(jié)了游離DNA甲基化檢測技術(shù)及其在各類非腫瘤性疾病中的研究進(jìn)展?？偟膩碚f,目前隨著游離DNA甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展,檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度在不斷提升,成本也越來越低,為未來的臨床運(yùn)用奠定了良好的基礎(chǔ)。對于非腫瘤疾病,目前的游離DNA甲基化的相關(guān)研究還處于早期階段,但已經(jīng)可以看出,基于其特有的組織細(xì)胞特異性,游離DNA甲基化的檢測在神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和出生缺陷等相關(guān)疾病的診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢,其在其他疾病中的運(yùn)用也得到了越來越多的重視。

在實(shí)際應(yīng)用層面,目前有部分腫瘤相關(guān)游離DNA甲基化檢測產(chǎn)品進(jìn)入商品化和臨床使用,如第一個(gè)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局和我國國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌的篩查和早期診斷的mSEPT9檢測試劑盒,以及國內(nèi)一些已獲NMPA批準(zhǔn)的血漿腫瘤基因甲基化檢測試劑盒等[57]。但已有的這些產(chǎn)品均是針對腫瘤檢測,對于非腫瘤性疾病的商品化試劑的開發(fā)和臨床驗(yàn)證還處在起步階段,后續(xù)還更進(jìn)一步的研究來拓寬游離DNA甲基化的臨床運(yùn)用場景。但可以預(yù)計(jì),游離DNA甲基化未來可能成為非腫瘤性疾病腫瘤液體活檢中一個(gè)極具價(jià)值的標(biāo)志物。