蘇鎮(zhèn)軍,趙艷春,李 娟,國方娜,溫麗莎

河北工程大學附屬醫(yī)院核醫(yī)學科,河北邯鄲 056002

甲狀腺癌平均年增長率約6.6%,現(xiàn)已躍居為發(fā)病率升高最快的實體腫瘤[1]。手術(shù)聯(lián)合131I是目前治療甲狀腺癌重要手段,可有效延緩病情進展,但其療效具有較明顯個體差異性,部分患者易出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移,甚至死亡?；蛲蛔?、異位及甲基化可刺激腫瘤相關(guān)信號通路,誘發(fā)甲狀腺癌細胞癌變[2-3]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(BRAF)可通過刺激BRAF/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路參與腫瘤形成,僅在甲狀腺癌與甲狀腺癌起源的未分化癌中發(fā)生突變[4]。腫瘤蛋白P53(TP53)突變影響細胞生長、凋亡、DNA修復,促進腫瘤形成,在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[5]。配對盒基因8-過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Pax8-PPARγ)是配對盒基因編碼區(qū)染色體2q13斷裂點與過氧化物酶體增殖物激活受體γ編碼區(qū)3q13斷裂處融合形成新基因,在甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)中均有表達,但關(guān)于其在甲狀腺癌鑒別及療效評估中研究報道較少[6]。本研究擬分析TP53、BRAF、Pax8-PPARγ在甲狀腺癌中的表達及131I治療中的價值,以期為臨床確定合理診治方案提供參考,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年4月至2022年4月本院收治的150例甲狀腺癌患者納入研究,男52例,女98例,年齡20～65歲,平均(49.92±4.41)歲。納入標準:(1)符合甲狀腺癌診斷標準[7],結(jié)合細胞病理學檢查證實為甲狀腺乳頭狀癌(甲狀腺惡性腫瘤中最常見的病理類型);(2)行甲狀腺癌根治術(shù)且于術(shù)后擬行首次131I治療。排除標準:(1)患其他惡性腫瘤;(2)有其他甲狀腺疾病;(3)有嚴重心腦血管疾病;(4)有凝血功能障礙;(5)臨床資料缺失?；颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ表達水平檢測 取甲狀腺癌組織及癌旁組織約30 mg,采用Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green Ⅰ染料行實時熒光定量PCR(qPCR)擴增反應。TP53引物序列為F:5′-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3′,R:5′-TCTGGGAAGGGACA GAAGATGAC-3′;擴增程序為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共35個循環(huán)。BRAF引物序列為F:5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′,R:5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′;擴增程序為95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃ 45 s,共38個循環(huán)。Pax8-PPARγ引物序列為F:5′-GTCCGGACTCAGATCTCGAGCTATGCCTCAACAACTCCATCAG-3′,R:5′-GATCCCGGG CCCGCGGTACCGTACAAGTCCTTGTAGATCTC CTG-3′;擴增程序為95 ℃ 10 min,94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s 共30個循環(huán)。U6為內(nèi)參基因,反轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR引物序列為F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,R:5′-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法計算TP53、BRAF、Pax8-PPARγ的相對表達水平。Trizol試劑盒由美國Invitrogen公司提供。qPCR檢測試劑盒及TP53、BRAF、Pax8-PPARγ引物由廣州復能基因有限公司提供。7500熒光定量PCR儀由美國ABI公司提供。

1.2.2采用放射性131Ⅰ清除術(shù)后殘留的正常甲狀腺組織(簡稱清甲) 治療前,停服甲狀腺激素、低碘飲食4周,待促甲狀腺激素(TSH)>30 μIU/mL接受首次131I治療。術(shù)后4周,口服131I(安盛科興藥業(yè)有限公司,國藥準字H20057721),劑量(350～650)×1010Bq,治療7 d后服用左甲狀腺素鈉片(德國默克公司,國藥準字H20090234),100 mg/d,結(jié)合血漿TSH調(diào)整服藥劑量,確保臨床分期Ⅰ期患者TSH始終低于0.10 mol/L,Ⅱ、Ⅲ期患者TSH維持在0.05～0.10 mol/L。

1.2.3首次清甲成功標準 首次131I治療后1周進行全身碘掃描及局部斷層融合顯像檢查,無甲狀腺殘留或放射性濃聚。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌及癌旁組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平比較 甲狀腺癌組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 甲狀腺癌及癌旁組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA相對表達水平比較

2.2甲狀腺癌患者臨床病理因素與TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平的關(guān)系 甲狀腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑、包膜浸潤均與TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 甲狀腺癌患者臨床病理因素與TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平的關(guān)系

2.3清甲成功和失敗患者TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平比較 甲狀腺癌患者經(jīng)首次131I治療后,61例清甲失敗,89例清甲成功。清甲失敗患者組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平均高于清甲成功患者(P<0.05)。見表3。

表3 清甲成功和失敗患者組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA相對表達水平比較

2.4ROC曲線分析 將甲狀腺癌患者131I治療的效果作為狀態(tài)變量(1=清甲失敗,0=清甲成功),組織TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRNA表達水平作為檢驗變量,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示TP53 mRNA、BRAF mRNA、Pax8-PPARγ mRNA、三者聯(lián)合預測甲狀腺癌患者清甲失敗的AUC分別為0.726(95%CI：0.647～0.796)、0.822(95%CI：0.752～0.880)、0.743(95%CI：0.666～0.811)、0.916(95%CI：0.860～0.955),其中三者聯(lián)合的預測價值最高(P<0.05)。見圖1。

圖1 TP53 mRNA、BRAF mRNA、Pax8-PPARγ mRNA單獨及聯(lián)合預測甲狀腺癌患者清甲失敗的ROC曲線

2.5決策曲線分析 以凈收益率為縱坐標,高風險閾值為橫坐標,繪制決策曲線,當高風險閾值為0.2～0.9時,三者聯(lián)合預測甲狀腺癌清甲失敗的凈收益率優(yōu)于TP53、BRAF、Pax8-PPARγ(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

甲狀腺腫瘤分子病理學研究取得較大進展,多分子聯(lián)合檢測可在超聲引導下細針穿刺細胞學基礎上準確劃分結(jié)節(jié)惡性風險,提高甲狀腺癌診斷效能,有助于患者預后的改善。Pax8-PPARγ、BRAF、TP53均為甲狀腺腫瘤分子病理學研究的熱點分子,但上述分子與甲狀腺癌療效的關(guān)系研究較少。

Pax8-PPARγ是配對盒基因8(Pax8)與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)基因重排融合結(jié)果,其中Pax8可通過調(diào)控甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶表達促進甲狀腺細胞分化。PPARγ可調(diào)控細胞增殖分化、促細胞凋亡及腫瘤形成,在甲狀腺細胞生長、分化、轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。盡管目前已有Pax8-PPARγ在甲狀腺癌中的研究[8],但關(guān)于其致癌作用機制尚未完全闡明,本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中Pax8-PPARγ mRNA表達水平高于癌旁組織,Pax8-PPARγ可抑制PPARγ被噻唑烷二酮激活,參與細胞周期調(diào)控,增強細胞增殖能力,干擾細胞正常分化,抑制甲狀腺特異性基因表達[9]。本研究發(fā)現(xiàn)Pax8-PPARγ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑、包膜浸潤有關(guān),說明該融合基因表達的患者甲狀腺癌惡性程度高,更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、包膜浸潤,但上述結(jié)果與陳慶毫等[10]的研究結(jié)果存在一定差異,考慮與患者異質(zhì)性、病例數(shù)量較少有關(guān),具體原因及機制有待后續(xù)研究。既往研究顯示,Pax8過表達可抑制甲狀腺癌細胞增殖,促進鈉/碘轉(zhuǎn)運(NIS)蛋白表達,增強攝碘能力,改善其預后[11]。然而本研究結(jié)果顯示,清甲失敗患者Pax8-PPARγ表達水平高于清甲成功患者,與上述觀點相悖,推測原因:Pax8-PPARγ融合基因可影響Pax8、PPARγ功能,隨著其表達增加,可促進腫瘤細胞增殖分化,抑制NIS蛋白表達,降低攝碘能力及131I治療效果。ROC曲線分析顯示,Pax8-PPARγ預測甲狀腺癌清甲失敗AUC為0.743,說明Pax8-PPARγ或許不能作為臨床實際工作中的單一預測因子,建議與其他指標聯(lián)合應用。

BRAF屬于特異性較強甲狀腺癌基因,BRAF基因突變是甲狀腺癌常見基因突變,以第15位外顯子上單個堿基因錯義突變?yōu)橹?可引起翻譯蛋白600位密碼子所對應的纈氨酸由谷氨酸代替,生成活化蛋白激酶,促進甲狀腺癌發(fā)病[12-13]。動物實驗表明,BRAF基因突變可介導小鼠甲狀腺細胞轉(zhuǎn)化,誘發(fā)甲狀腺癌[14]。本研究結(jié)果顯示,甲狀腺癌組織BRAF mRNA表達水平高于癌旁組織,而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑、包膜浸潤密切有關(guān),表明BRAF參與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展,其過表達可增加酶活性,刺激下游信號通路,促使腫瘤細胞過度增殖、分化,最終導致腫瘤癌變[15]。本研究還發(fā)現(xiàn),清甲失敗患者BRAF mRNA水平高于清甲成功患者,其預測甲狀腺癌患者清甲失敗的AUC為0.822,可為臨床學者評估甲狀腺癌131I治療效果提供有利參考依據(jù),有助于后續(xù)治療方案的調(diào)整。

TP53突變是指該基因第72位密碼存在G/C多態(tài)性。既往的研究探討了TP53基因突變與甲狀腺癌關(guān)系,但研究結(jié)果極具爭議性,有學者認為TP53基因突變與甲狀腺癌無關(guān)[16],有學者則認為TP53基因Arg72Pro位點突變與甲狀腺癌密切相關(guān)[17],特別是在亞洲人群中。在此背景下,本研究分析了TP53在甲狀腺癌患者中的表達,發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織TP53 mRNA表達水平高于癌旁組織,其表達水平與包膜浸潤、腫瘤最大徑等有關(guān)。分析原因:TP53基因突變可刺激Wnt-5α信號轉(zhuǎn)導通路,引起細胞增殖特征性變化,進而出現(xiàn)增殖失控,促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展,積極有效治療顯得十分重要[18]。有研究表明,甲狀腺癌患者預后大多良好,但仍有10%～15%患者復發(fā),約5%患者對131I治療無反應,最終死亡[19]。本研究探討了TP53與甲狀腺癌131I治療效果關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TP53 mRNA預測甲狀腺癌患者清甲失敗的AUC僅為0.726,可見TP53單獨預測甲狀腺癌131I治療效果的價值有限。

由于TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRAN單獨預測甲狀腺癌131I療效的價值不高,本研究采用三者聯(lián)合預測甲狀腺癌患者清甲失敗的價值,AUC高達0.916,接近于1,提示三者聯(lián)合預測效能好,可為本病療效評估提供參考。然而ROC曲線著重關(guān)注各檢測指標的靈敏度、特異度,針對低靈敏度、高特異度指標,雖具有較大AUC,但在早期篩查中可能會出現(xiàn)假陰性,無法直接代表臨床患者受益[20-21]。因此,本研究引入決策曲線,發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合預測甲狀腺癌清甲失敗發(fā)生的凈收益率優(yōu)于單獨預測,后續(xù)治療中可通過檢測TP53、BRAF、Pax8-PPARγ mRAN表達來預測清甲失敗風險,結(jié)合具體情況加強治療強度,提高131I治療效果。

綜上所述,TP53、BRAF、Pax8-PPARγ在甲狀腺癌組織中呈高表達,聯(lián)合檢測有助于預測131I治療效果,為臨床確定合理治療方案及時機提供參考。受限于臨床實際,本研究病例源自同一家醫(yī)院,病例數(shù)少,同時三者均突變是否會造成更差預后尚不得知,日后仍需開展多中心、大樣本的前瞻性研究。