朱義保，謝 彤，楊亮亮，萬(wàn) 磊

(江西省婦幼保健院，江西南昌330006)

HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變及物理狀態(tài)的研究

朱義保，謝 彤，楊亮亮，萬(wàn) 磊

(江西省婦幼保健院，江西南昌330006)

目的研究HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變及物理狀態(tài)的關(guān)系，探討反應(yīng)宮頸病變的指標(biāo)。方法收集感染HPV16患者的宮頸病變標(biāo)本，對(duì)不同PML2d HPV-16質(zhì)粒濃度的E2和E7基因進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出HPV16物理狀態(tài)的臨界值，描述標(biāo)本HPV16的病毒負(fù)荷量，并根據(jù)臨界值，分析HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變及物理狀態(tài)的關(guān)系。結(jié)果不同宮頸病變的HPV16中位數(shù)病毒負(fù)荷量隨宮頸病變的級(jí)別升高而增加，但病毒負(fù)荷量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0. 22），整合型HPV16在低級(jí)別宮頸病變也有較高分布，HPV16物理狀態(tài)在不同宮頸的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.55），不同物理狀態(tài)間的病毒負(fù)荷量差異亦不顯著（P=0.34）。結(jié)論HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變關(guān)系不明顯，病毒整合是宮頸病變的早期事件，高的病毒負(fù)荷量不會(huì)導(dǎo)致整合增加。

HPV16；病毒負(fù)荷量；宮頸病變；病毒整合

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤。流行病學(xué)資料表明，患者感染高危型HPV并整合入基因組是宮頸癌發(fā)生的必要因素，因此高危性HPV的病毒負(fù)荷量及物理狀態(tài)可能與宮頸病變的進(jìn)展有關(guān)。有研究認(rèn)為[1，2]，病毒負(fù)荷量高，免疫清除率低，病毒整合率高，容易導(dǎo)致宮頸病變，病毒負(fù)荷量與宮頸病變、病毒整合相關(guān)，但也有相反方向的報(bào)道[3]，認(rèn)為病毒負(fù)荷量與宮頸病變、病毒整合無(wú)關(guān)。在本研究中，通過(guò)收集住院患者資料，對(duì)人乳頭瘤病毒HPV16進(jìn)行分析，探討HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變、物理狀態(tài)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取HPV分型檢查HPV16陽(yáng)性的患者，其中慢性宮頸炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ23例，宮頸癌28例。所有宮頸細(xì)胞標(biāo)本用塑料毛刷取樣。選取的這些患者均無(wú)與宮頸病變相關(guān)的疾病。

1.2 主要試劑及儀器PML2d HPV-16質(zhì)粒（P1203）由美國(guó)Addgene公司惠贈(zèng)。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR試劑、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑等購(gòu)自為北京天為時(shí)代公司，ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems產(chǎn)品。

1.3 樣本DNA提取從宮頸管采樣，樣品分兩份，一份做人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)，另一份備用，對(duì)于人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)HPV16陽(yáng)性的標(biāo)本，取相應(yīng)的備用樣品提取DNA，相關(guān)步驟參見(jiàn)北京天為DNA提取試劑盒。為確認(rèn)樣品HPV16的感染，對(duì)提取后的DNA進(jìn)行HPV16 E7基因擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)樣品存在HPV16感染。

1.4 HPV16 E2基因、E7基因、β-actin定量PCR擴(kuò)增條件引物由華大基因公司合成，具體引物見(jiàn)表1。

表1 引物的序列及擴(kuò)增條件

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制提取PML2d HPV-16質(zhì)粒，以103-107copies/μl的HPV16質(zhì)粒為模板，對(duì)E2基因、E7基因進(jìn)行定量擴(kuò)增，每個(gè)濃度檢測(cè)6次，取不同批次不同濃度下E2和E7基因的CT均數(shù)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-actin以人的基因組為模板，分別對(duì)500ng/μl、100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl的基因組進(jìn)行β-actin擴(kuò)增，取不同濃度下的CT值，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 病毒負(fù)荷量的認(rèn)定及游離型和混合型HPV16的判定因樣本取樣的不同，樣本組織會(huì)呈現(xiàn)誤差，取樣好的標(biāo)本病毒負(fù)荷量會(huì)高，取樣差的標(biāo)本病毒負(fù)荷量會(huì)低，為剔除這種影響，引入β-actin內(nèi)參（每個(gè)細(xì)胞的基因組含量為6.89pg），每個(gè)標(biāo)本細(xì)胞的病毒負(fù)荷量為E7copy/β-actincopy；對(duì)于游離型與混合型HPV16的臨界值，取同批次不同濃度下E2/E7比值95%參考值的下限，作為區(qū)分游離型和混合型HPV16的臨界值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用卡方分析和Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 HPV16物理狀態(tài)的判定HPV16在游離狀態(tài)下，E2和E7的基因數(shù)相同，因此可認(rèn)為E2/E7＝1是游離型，但在實(shí)際過(guò)程中，基因擴(kuò)增存在一定誤差，游離狀態(tài)下的E2/E7比值會(huì)在1上下浮動(dòng)，因此為剔除這種影響，我們對(duì)103~107copies/μl質(zhì)粒濃度的的E2和E7基因進(jìn)行6次擴(kuò)增，以E2/E7比值的95%參考值的下限為臨界值，來(lái)作為判定HPV16是否為游離狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，我們得到30個(gè)E2/E7比值，所得值在0.76～1.24之間，95%參考值下限為0.77，因此我們以E2/E7比值0.77為界限，認(rèn)為大于0.77為游離型HPV16，0和0.77之間為混合型HPV16，等于0為整合型HPV16。

2.2 病毒負(fù)荷量與宮頸病變的關(guān)系以β-actin做參比，剔除組織取樣的影響發(fā)現(xiàn)，隨著宮頸病變級(jí)別的增高，病毒負(fù)荷量隨之增加，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的中位數(shù)病毒負(fù)荷量分別為6.17 copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31 copies/μl，但是分析顯示不同宮頸病變的病毒負(fù)荷量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.22），宮頸病變級(jí)別高并不表示病毒負(fù)荷量高，表明病毒負(fù)荷量與宮頸病變的關(guān)系不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 病毒負(fù)荷量與宮頸病變的關(guān)系

2.3 HPV16物理狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系根據(jù)HPV16物理狀態(tài)的判定標(biāo)準(zhǔn)，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的HPV16整合率隨著宮頸病變級(jí)別升高而有所增高，分別為4.00%、9.09%、13.04%、10.71%，分析顯示HPV16整合率在不同宮頸病變間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.55），表明HPV16整合與宮頸病變的關(guān)系不明顯；因混合狀態(tài)的HPV16也存在HPV16的整合，因此把混合型和整合型的HPV16合并，數(shù)據(jù)顯示慢性宮頸炎/ CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的HPV16總整合率分別為48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，結(jié)果顯示HPV16總整合率在不同宮頸病變間分布也不顯著（P=0.23），表明HPV16總整合與宮頸病變的關(guān)系也不明顯。見(jiàn)表2。

表2 HPV16物理狀態(tài)與宮頸病變的關(guān)系

2.4 病毒負(fù)荷量與物理狀態(tài)的關(guān)系以往研究認(rèn)為，病毒負(fù)荷量越高，病毒整合發(fā)生越多，因此本研究把病毒的物理狀態(tài)進(jìn)行區(qū)別，分析不同狀態(tài)下的病毒負(fù)荷量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整合型、混合型、游離型HPV16的中位數(shù)病毒負(fù)荷量分別為17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，統(tǒng)計(jì)顯示不同物理狀態(tài)下的病毒負(fù)荷量差異無(wú)顯著性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.34），表明病毒負(fù)荷量的高低與病毒整合率大小關(guān)系不明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 病毒負(fù)荷量與物理狀態(tài)的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦女生殖系統(tǒng)腫瘤之一。在我國(guó)，每年新發(fā)病例約14萬(wàn)，占全世界宮頸癌新發(fā)病例的29%，死亡率位居?jì)D科腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健康。目前研究發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒的感染(human papillomavirus，HPV)，尤其是高危型HPV的感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。高危型HPV通過(guò)整合入基因組，造成基因組不穩(wěn)定，抑癌基因下降，癌基因過(guò)來(lái)表達(dá)而致癌，因此研究高危型HPV的病毒負(fù)荷量和物理狀態(tài)，可能與宮頸病變的發(fā)展有關(guān)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與β-actin參比后，慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的中位數(shù)病毒負(fù)荷量分別為6.17copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31copies/μl，分析顯示不同宮頸病變間的病毒負(fù)荷量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們的結(jié)果與國(guó)內(nèi)的某些報(bào)道不同[4，5]，但與國(guó)外的多數(shù)報(bào)道一致[6-8]，認(rèn)為病毒負(fù)荷量與宮頸病變的關(guān)系不明顯，高級(jí)別的宮頸病變不一定表示病毒負(fù)荷量高。國(guó)內(nèi)的報(bào)道認(rèn)為，病毒負(fù)荷量與宮頸病變相關(guān)，但查閱其報(bào)道，病毒負(fù)荷量與宮頸病變的相關(guān)系數(shù)較小，相關(guān)系數(shù)的平方?jīng)Q定系數(shù)更小，都在10%~20%以下，表明病毒負(fù)荷量在宮頸病變的貢獻(xiàn)率在10%~20%以下，所起的作用不足，容易被樣本誤差或抽樣誤差掩蓋。相反，國(guó)外報(bào)道認(rèn)為，病毒負(fù)荷量與宮頸病變關(guān)系不明顯，HPV病毒負(fù)荷量的取樣只在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，時(shí)間點(diǎn)取樣后的病毒負(fù)荷量變化并不能知道，缺乏動(dòng)態(tài)觀察，因此一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒負(fù)荷量不能反應(yīng)其與宮頸病變的關(guān)系。而且即使動(dòng)態(tài)觀察，研究發(fā)現(xiàn)病毒負(fù)荷量與宮頸病變之間的關(guān)系也偏低或不明顯，如Constandinou報(bào)道[9]，HPV16和HPV18動(dòng)態(tài)的病毒負(fù)荷量與宮頸病變的危險(xiǎn)度只有1.76（95%CI 1.38~2.25）和1.59（95%CI 1.25~2.03），或如Manawapat報(bào)道[10]，HPV16感染觀察一段時(shí)間后，不管是感染后清除的患者、持續(xù)進(jìn)展的患者、還是CINⅢ以上的患者，病毒負(fù)荷量之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，動(dòng)態(tài)的病毒負(fù)荷量不能反應(yīng)宮頸病變的程度。

HPV病毒整合入基因組，導(dǎo)致宿主基因的不穩(wěn)定，激活癌基因，因此病毒的物理狀態(tài)也是考量宮頸病變的指標(biāo)。但在我們的報(bào)道中，不管是HPV16純整合率還是整合型與混合型合并后的HPV16總整合率，在慢性宮頸炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌的分布中均無(wú)差異，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病毒整合率和宮頸病變關(guān)系不明顯，病毒整合率沒(méi)有隨宮頸病變的級(jí)別升高而升高。在慢性宮頸炎/CINⅠ組中，HPV16就有48.00%的病毒整合率，宮頸病變?cè)缙诰陀蠬PV16整合，表明病毒整合是宮頸病變的早期事件[10-12]。

此外，亦有報(bào)道認(rèn)為，病毒負(fù)荷量越多，病毒整合入基因組愈多。在我們的報(bào)道中，不同物理狀態(tài)下，整合型、混合型、游離型HPV16的中位數(shù)病毒負(fù)荷量分別為17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，分析顯示不同物理狀態(tài)下的病毒負(fù)荷量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Cheung報(bào)道一致[13，14]，表明病毒負(fù)荷量高不一定會(huì)導(dǎo)致病毒整合率高。

綜上所述，我們認(rèn)為HPV16病毒負(fù)荷量與宮頸病變關(guān)系不明顯，病毒負(fù)荷量高，病毒整合率不一定高，高病毒負(fù)荷量不增加病毒整合率，病毒整合率高，宮頸病變程度不一定嚴(yán)重，病毒整合是宮頸病變的早期事件。

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Analysis of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states

ZHU Yibao，XIE Tong，YANG Liangliang，WAN Lei. Jiangxi Maternal and Child Care Service Centre，Nanchang 330006，China.

Objective To study the correlations of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states，and investigate the index of cervical lesions.Methods HPV16 infected samples were collected，standard curves were made，then we analysed the HPV16 viral load，found the threshold distinguished episomal and mixed HPV16，and check the infected HPV16 states according the threshold.ResultsThe median of HPV16 viral load increased with the degree of cervical lesions，but statistical analysis showed no difference，the integration type of HPV16 also happened in low grade cervical lesions with a high frequency，HPV16 integration rates among the different cervical lesions showed no significance，and HPV16 viral load among the different physical states showed no significance too.Conclusions There was no obvious relationship between HPV16 viral load and cervical lesions，viral integration is an early event，and high viral load would not increase intergration rate.

HPV16；Viral load；Cervical lesions；Viral integration

R737.33，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0017-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.005

2016－07－01；

2016－11－16)

1、江西省衛(wèi)計(jì)委科技計(jì)劃課題（20165443）；2、江西省自然科學(xué)基金（20132BAB205003）

朱義保，男，1980年生，碩士，婦產(chǎn)科主治醫(yī)師，婦科腫瘤方向。

萬(wàn)磊，女，1974年生，博士，婦產(chǎn)科主任醫(yī)師，婦科腫瘤方向，E-mail:18070393566@163.com