肖沐紫，王思齊，賈壯壯，王志剛

高血壓是以體循環(huán)動脈壓升高為主要臨床表現(xiàn)的心血管綜合征，是我國危害嚴重的慢性疾病之一，是多種心腦血管疾病的重要病因及危險因素[1]。雖然對高血壓病診治取得了很多進展，藥物不斷更新?lián)Q代，但高血壓藥物也有諸多不足之處，依然存在用藥持續(xù)性和血壓控制率不良等問題[2]。高血壓病發(fā)病機制復雜，涉及遺傳因素、環(huán)境因素，并與神經(jīng)機制、腎臟機制、激素機制、血管機制及胰島素抵抗等密切相關(guān)，中藥具有的多組分、多靶點、多機制作用特點，在其治療中具有獨特優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，從多角度闡釋藥物-靶點-疾病間的復雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，與中醫(yī)學整體觀念的基本特點相吻合，為研究多組分、多靶點的中藥機制提供可靠的方法[3-5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合動物實驗驗證，初步揭示補腎定眩湯對高血壓病的治療作用及調(diào)控途徑，為后續(xù)基礎(chǔ)研究及臨床推廣提供理論及實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 補腎定眩湯活性化合物篩選 通過計算系統(tǒng)生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(TCMSP：http：//tcmsp-e.com/tcmsp.php)，設(shè)置ADME 參數(shù)為OB≥30%、DL≥0.18、Caco-2≥-0.4、BBB≥-0.3、HL≥4 h，對補腎定眩湯方藥組成中包含的天麻、附子、茯苓、黨參、白芍、白術(shù)所含化合物進行篩選分析，構(gòu)建補腎定眩湯活性化合物調(diào)控靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的補腎定眩湯藥物靶點通過UniProt平臺(https：//www.uniprot.org/)將蛋白靶點轉(zhuǎn)化為基因，并采用Cytospase 3.6.1軟件將補腎定眩湯化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)化。

1.3 潛在核心靶點篩選 基于OMIM 數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org/)、TTD 數(shù)據(jù)庫(https：//db.idrblab.net/ttd/) 與DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(http：//www.disgenet.org/)并結(jié)合文獻報道篩選高血壓疾病靶點，并與藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)進行融合，篩選出補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點。

1.4 潛在核心靶點之間蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 基于STRING 數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，將補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)，將靶點關(guān)系可視化。

1.5 GO/KEGG 信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，對生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component)、分子功能(molecular function)進行GO/KEGG 調(diào)控通路富集分析，綜合預測補腎定眩湯改善高血壓的調(diào)控機制。

1.6 實驗動物 選取SPF 級雄性10 周齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)及Wistar 大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006；飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學動物實驗中心，自由進食進水，室溫20～25 ℃，相對濕度56%～60%；實驗動物所有操作均嚴格按照天津中醫(yī)藥大學動物倫理委員會標準執(zhí)行(TCM-LAEC2015028)。

1.7 分組與干預 將50 只SHR 大鼠隨機分為模型組(Model 組)、卡托普利組(Captopril 組)、補腎定眩湯低劑量組(BSDX-L 組)、中劑量組(BSDX-M組)及高劑量組(BSDX-H 組)；另設(shè)10 只Wistar 大鼠為正常對照組(NC 組)，每組各10 只。Captopril組每日給予卡托普利片12.5 mg/kg，補腎定眩湯低、中、高劑量組每天分別按6.3 g/kg、12.6 g/kg、18.9 g/kg 生藥劑量，各組灌胃給藥，NC 組和Model組給予等容積的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥6 周。

1.8 血壓測定 各組大鼠分別于給藥6 周后，于大鼠清醒狀態(tài)下檢測尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒 張 壓 (diastolic blood pressure，DBP) 及平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，每只大鼠測量3 次，取平均值。

1.9 HIF-1/TGF-β 信號通路檢測 各組大鼠末次測壓之后，3%異氟烷吸入麻醉后，開胸并小心分離胸主動脈，剪取主動脈弓下一段，輕輕將血管周邊殘留的結(jié)締組織剝離干凈，再將其放入生理鹽水中進行漂洗，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。采用Western-Blot 法檢測HIF-1α 蛋白表達水平，采用ELISA 法檢測TGF-β 表達水平。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計分析軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較若滿足正態(tài)分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較若方差齊采用LSD 法，不滿足方差齊性采用Tamhane's T2 法；不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗；最小顯著差異水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 補腎定眩湯活性化合物信息 通過統(tǒng)計篩選并刪除重復或無靶點的補腎定眩湯6 味中藥所含組分，最終得到23 個活性成分，其中天麻4個，附子4 個，黨參5 個，白芍3 個，白術(shù)3 個，茯苓4 個，見表1。

表1 補腎定眩湯活性化合物信息

2.2 化合物調(diào)控靶點 通過對補腎定眩湯所含23 個化合物的調(diào)控靶點進行統(tǒng)計篩選，共獲得天麻調(diào)控靶點17 個，附子調(diào)控靶點28 個，黨參調(diào)控靶點71 個，白芍調(diào)控靶點61 個，白術(shù)調(diào)控靶點35 個，茯苓調(diào)控靶點44 個。

2.3 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點基于OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻報道篩選高血壓疾病靶點444個；與補腎定眩湯對應(yīng)的化合物-靶點進行比對，篩選出15 個補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點，見表2。

表2 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點

2.4 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò) 將補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點導入STRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含15個節(jié)點、65 條邊，平均度值為8.67，其中節(jié)點代表靶點蛋白，邊代表各個蛋白之間的互作關(guān)系，節(jié)點連接邊數(shù)表明靶點蛋白在PPI 網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系中的關(guān)鍵程度。

2.5 GO/KEGG 調(diào)控通路富集分析 補腎定眩湯治療高血壓病的潛在核心靶點GO/KEGG 功能富集分析表明，補腎定眩湯可通過調(diào)節(jié)血管收縮及舒張的生物過程、腎素-血管緊張素生物過程、松弛素信號通路、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、轉(zhuǎn)化生長因子-β 信號通路(TGF-β signaling pathway)等途徑改善高血壓，見圖1～2。

圖1 核心靶點GO 功能富集分析

圖2 潛在核心靶點KEGG 信號通路富集分析

2.6 補腎定眩湯對大鼠血壓的影響 與NC 組比較，Model 組大鼠SBP、DBP、MAP 均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯各劑量干預組SBP、DBP、MAP 均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組血壓下降程度優(yōu)于低、中劑量組(P＜0.01)，見圖3。

圖3 補腎定眩湯對大鼠血壓的影響

2.7 補腎定眩湯對大鼠HIF-1/TGF-β 信號通路的影響

2.7.1 補腎定眩湯對HIF-1α 蛋白表達水平的影響 與NC 組比較，Model 組大鼠HIF-1α 蛋白相對表達量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯低劑量干預后，HIF-1α 蛋白相對表達量無差異，中、高劑量干預后，HIF-1α 蛋白相對表達量均下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組下降程度優(yōu)于中劑量組(P＜0.01)，見圖4。

圖4 補腎定眩湯對大鼠HIF-1α 蛋白表達的影響

2.7.2 補腎定眩湯對TGF-β 表達水平的影響與NC 組比較，Model 組大鼠TGF-β 表達水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；與Model 組比較，補腎定眩湯低劑量干預對TGF-β表達量無影響；中、高劑量干預后，TGF-β 表達水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)；其中高劑量組改善程度優(yōu)于中劑量組(P＜0.05)，見圖5。

圖5 補腎定眩湯對大鼠TGF-β 表達水平的影響

3 討論

高血壓發(fā)病涉及神經(jīng)遞質(zhì)異常、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活及大小動脈結(jié)構(gòu)功能失衡等機制，中醫(yī)學常將其歸屬于“眩暈”“頭痛”等范疇，認為本病的病機為本虛標實，肝陽上亢為標，腎陽虧虛為本[6-8]。中藥多組分、多靶點、多機制的作用特點與網(wǎng)絡(luò)藥理學復雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系特點吻合，可系統(tǒng)揭示中藥調(diào)控疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用途徑[9-11]。補腎定眩湯由天麻、附子、白芍、黨參、白術(shù)、茯苓組成。網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果表明，補腎定眩湯含有23 個活性成分，改善高血壓病的潛在核心靶點15 個，包括ECE1、AGT、BMPR2、HIF1A、ACE2、TGFB1 等；可通過調(diào)節(jié)血管收縮及舒張的生物過程、腎素-血管緊張素生物過程、松弛素信號通路、HIF-1信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β 信號通路等途徑改善高血壓。進一步通過補腎定眩湯干預SHR 大鼠模型的實驗結(jié)果表明，補腎定眩湯可顯著降低大鼠收縮壓、舒張壓及平均動脈壓，顯著抑制HIF-1/TGF-β 信號通路激活。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對補腎定眩湯治療高血壓病作用機制研究提示，松弛素作為來源于妊娠黃體的多肽類激素，其心腦血管保護作用主要包括保護內(nèi)皮、抗纖維化、抗炎癥、抗氧化、舒張血管、抑制內(nèi)皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[12-13]，可顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，減低鹽誘導高血壓大鼠的收縮壓[14]。RAAS 調(diào)控機制是關(guān)鍵的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制之一，高血壓及其心血管靶細胞損傷均與該系統(tǒng)失調(diào)有關(guān)[15-18]。HIF-1 的穩(wěn)定表達是維持心血管細胞對缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵條件，其調(diào)控作用涉及紅細胞生成、葡萄糖轉(zhuǎn)運、血管生成、糖酵解代謝、活性氧處理和細胞增殖等[19]。HIF-1α 表達量顯著增加，導致其與調(diào)節(jié)血液濃度和血管內(nèi)皮相關(guān)的基因異常表達，促進高血壓病的發(fā)生，并且腎臟髓質(zhì)HIF-1表達異常，可通過調(diào)節(jié)水鹽電解質(zhì)平衡參與血壓調(diào)節(jié)[20]。HIF-1 直接激活血管緊張素Ⅱ受體，調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ的活性，參與血壓調(diào)節(jié)[21]。TGF-β 介導的信號通路參與多種生理病理調(diào)節(jié)過程，研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smads 信號通路從而抵抗高血壓大鼠心肌纖維化過程[22]，對高血壓及相關(guān)的心肌損傷具有顯著的改善作用。內(nèi)皮功能障礙是高血壓發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，其中內(nèi)皮炎癥反應(yīng)為重要特征之一[23]，TNF-α 作為主要的促炎因子參與多種疾病引起的血管內(nèi)皮細胞功能障礙和損傷，TNF-α 可抑制eNOS 轉(zhuǎn)錄增加氧自由基表達，與高血壓引起的血管內(nèi)皮細胞功能障礙密切相關(guān)[24]。在高血壓早期，機體啟動炎癥狀態(tài)，于血管壁釋放大量炎性因子，進而導致血管平滑肌增生，最終發(fā)展為動脈粥樣硬化[25]。VEGF 在血管生成、血管緊張度及內(nèi)皮增殖遷移等方面均有重要作用，對于高血壓治療及相關(guān)靶器官損害的預防都具有重要意義[26]。NO 減少可導致血管收縮和外周阻力增加，同時可引起水鈉潴留，進而導致血壓升高；另外，ET-1 增加，NO 減少會進一步引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致血管氧化細胞損傷而升高血壓，VEGF 促進NO 生成，減緩血容量擴張，從而保護血管損害，降低血管緊張度，改善高血壓及靶器官損害[27-28]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，系統(tǒng)分析了補腎定眩湯“多組分-多靶點-多機制”治療高血壓的靶點及作用機制，并基于自發(fā)性高血壓大鼠模型驗證了治療效果，為其進一步臨床應(yīng)用提供了科學依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為基于數(shù)據(jù)庫的虛擬研究模式，并不能確切地揭示藥物在生物體內(nèi)的調(diào)控作用及途經(jīng)，因此尚需進一步明確有效成分及靶點的分子作用機制。