馮慶春，盧丙艷，宋軼

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多系統(tǒng)損害的臨床代謝綜合征，其臨床特征表現(xiàn)為慢性血糖升高，多由胰島素分泌及作用缺陷導(dǎo)致[1]。作為慢性糖脂代謝異常型疾病，DM 近幾年發(fā)病率居高不下，2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是DM 的主要類型[2]，目前常規(guī)治療藥物可較好地控制T2DM 及其各種并發(fā)癥，尤其對難治性T2DM 患者，其較強的臨床依賴性及副作用仍對患者的生存質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[3]。氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是指機體氧化與抗氧化防御系統(tǒng)失衡的一種狀態(tài)，在衰老及疾病調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4]，當T2DM 患者血糖升高時，活性氧(reactive oxygen species，ROS)會受高糖信號刺激，導(dǎo)致生成水平過高并超出抗氧化防御系統(tǒng)的自我調(diào)控范圍，導(dǎo)致OS，并進一步調(diào)控相關(guān)信號通路使胰島β 細胞功能受損，最終造成T2DM[5]。因此，探討OS 在T2DM 的發(fā)病機制及以O(shè)S 作為潛在靶點的調(diào)控治療方案具有重要臨床意義。

DM 屬于中醫(yī)“消渴”范疇，陰虛燥熱是其關(guān)鍵病機，其中燥熱為標、陰虛為本，陰津虧虛則燥熱內(nèi)生，燥熱亢盛則陰津益虛，其主要病位涉及上焦肺燥陰虛，中焦胃失濡潤、脾不健運，下焦腎失滋養(yǎng)，故津液運化失調(diào)，則生消渴[6-8]。中醫(yī)藥防治T2DM 具有多組分、多靶點、多機制的作用優(yōu)勢。參芪地黃湯由人參、黃芪、熟地黃、山藥、茯苓、牡丹皮、山茱萸構(gòu)成，可益氣養(yǎng)陰清熱，健脾滋腎固澀，在改善T2DM 患者的臨床表現(xiàn)中具有較好效果[9-11]。司美格魯肽作為新型長效胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)類似物，對血糖具有良好的調(diào)控作用。本研究采用T2DM 大鼠模型，探究參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽對T2DM 糖脂代謝及OS的改善作用機制，以期為臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性清潔級SD 大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)2021-0006，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心，相對濕度保持56%～60%，飼養(yǎng)溫度保持20～25 ℃，保持12 h 光照和12 h 黑暗的光照周期。

1.1.2 主要試劑及儀器 鹽酸二甲雙胍片(默克，貨號ACH5727)；司美格魯肽(諾和諾德，貨號202211BEL1)，三酰甘油(triglyceride，TG)含量檢測試劑盒(索萊寶，貨號BC0620)，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)含量檢測試劑盒(索萊寶，貨號BC1980)，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)含量生化試劑盒(索萊寶，貨號BC5330)，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)免疫酶聯(lián)試劑盒(江萊生物，貨號JL12389)，ROS 試劑盒(上海酶聯(lián)，貨號ML926281)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒(上海酶聯(lián)，貨號ML092620)，過氧化氫酶(catalase，CAT)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)，貨號ML095171)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(南京建成，貨號A003-1-2)，多功能酶標儀(美谷分子儀器公司，ZX21)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型復(fù)制及分組 采用隨機數(shù)字表將40 只清潔級雄性SD 大鼠分為正常對照組(Control group)10 只及T2DM 動物模型復(fù)制組30只，Control 組大鼠喂養(yǎng)普通飼料，T2DM 動物模型復(fù)制組喂養(yǎng)高糖、高脂飼料，連續(xù)飼養(yǎng)4 周后，采用1 次鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)腹腔注射25 mg/kg，STZ 注射3 d 后測定大鼠血糖，將空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)PG)≥11.0 mmol/L，餐后2 h 血糖(2 h PG)≥16.7 mmol/L 的大鼠隨機再分為T2DM 模型組(T2DM group)、二甲雙胍干預(yù)組(Metformin group)、參芪地黃湯及司美格魯肽聯(lián)合干預(yù)組(Combination group)，每組各10 只，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 干預(yù)方案 Combination 組大鼠采用參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽干預(yù)，根據(jù)人與動物等效劑量折算，按參芪地黃湯水煎液生藥7 g/(kg·d)灌胃給藥，1 次/d；司美格魯肽3.6 μg/kg 腹腔注射給藥，1 次/周。Metformin 組大鼠給予鹽酸二甲雙胍200 mg/(kg·d)，Control 組及T2DM 組大鼠給予等容積蒸餾水，灌胃1 次/d，連續(xù)干預(yù)4 周。

1.2.3 糖脂代謝水平檢測 各組大鼠待干預(yù)結(jié)束后24 h，抽取尾靜脈血測定FPG 含量；將血液樣本低溫離心，離心條件設(shè)置為4 ℃溫度下以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min 離心10 min，采用分光光度法測定上層清液的GHb 含量，考察各組大鼠血糖代謝情況；微量法測定血清TG、TC、LDL 含量，考察各組大鼠血脂代謝情況，所有操作參照試劑盒說明進行。

1.2.4 氧化應(yīng)激水平測定 大鼠血清ROS 水平采用ELISA 法測定；采用水溶性四唑鹽(Watersoluble tetrazolium salt-8，WST-8)法檢測SOD 活性；采用紫外法檢測CAT 含量；采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法檢測MDA 含量，具體操作按試劑盒說明進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，以均數(shù)±標準差(±s)表示，檢驗正態(tài)性分布及方差齊性，滿足則采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，則采用非參數(shù)Kruskal-walisH檢驗，P＜0.05 作為顯著性水平標準。

2 實驗結(jié)果

2.1 對血糖水平的影響 與Control 組相比，T2DM 組大鼠FPG 含量顯著升高(P＜0.01)，CHb 水平顯著升高(P＜0.01)，糖代謝水平異常升高；與Model 組相比，Metformin 組大鼠FPG 及CHb 水平均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，參芪地黃湯及司美格魯肽聯(lián)合干預(yù)組后，大鼠FPG 及CHb 水平不僅較Model 組顯著降低(P＜0.01)，且聯(lián)合干預(yù)組大鼠CHb 水平顯著低于Metformin 組(P＜0.05)，表明參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽干預(yù)可有效改善T2DM 大鼠血糖水平，且對GHb 改善程度優(yōu)于二甲雙胍，見表1。

表1 各組大鼠FPG、GHb 水平比較(±s)

表1 各組大鼠FPG、GHb 水平比較(±s)

注：FPG=空腹血糖，GHb=糖化血紅蛋白；與Control 組比較，**P＜0.01；與Model 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與Metformin組比較，#P＜0.05。

GHb/(nmol·L-1)854.69±43.46 952.73±66.21**887.53±56.65△879.46±53.03△△＃組別Control 組Model 組Metformin 組Combination 組例數(shù)10 10 10 10 FPG/(mmol·L-1)5.72±1.28 14.32±1.67**9.95±0.75△△8.74±1.03△△

2.2 對血脂水平的影響 與Control 組相比，Model組大鼠TG、TC、LDL 含量均顯著升高(P＜0.01)，脂代謝水平異常升高；與Model 組相比，二甲雙胍干預(yù)后，大鼠TG、TC、LDL 含量均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，脂代謝水平顯著改善；參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽干預(yù)后，大鼠TG、TC、LDL 含量均明顯降低(P＜0.01)，且下降程度優(yōu)于Metformin 組(P＜0.05)，表明參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽干預(yù)可有效改善T2DM 大鼠血脂水平，且改善程度優(yōu)于二甲雙胍，見圖1。

圖1 各組大鼠血脂水平檢測

2.3 對氧化應(yīng)激水平的影響 與Control 組相比，Model 組大鼠ROS 及MDA 含量均顯著升高(P＜0.01)，SOD 及CAT 含量均明顯降低(P＜0.01)，氧化應(yīng)激水平異常增高；與Model 組相比，二甲雙胍干預(yù)后，大鼠ROS、MDA 含量顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，SOD 含量明顯上調(diào)(P＜0.05)；Combination組大鼠ROS 及MDA 表達水平顯著下調(diào)(P＜0.01)，SOD 及CAT 含量顯著上調(diào)(P＜0.01)，且ROS 及CAT 改善程度優(yōu)于Metformin 組(P＜0.05，P＜0.01)，表明參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽干預(yù)可有效改善T2DM 大鼠氧化應(yīng)激水平，見圖2。

圖2 各組大鼠氧化應(yīng)激水平檢測

3 討論

DM 作為一種慢性糖脂代謝異常性疾病，多飲、多食、多尿及體質(zhì)量減少的“三多一少”癥狀是其典型臨床表現(xiàn)，胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗被認為是主要的發(fā)病機制[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)血清TC、TG 及LDL 水平，上調(diào)HDL 含量，改善糖脂代謝障礙，可有效改善DM的病理改變[13]，表明脂代謝異常作為DM 的重要發(fā)病因素，可引起糖代謝水平異常[14-16]，而T2DM 患者多同時伴有OS 水平的異常改變，其血清MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)等OS 標志物含量會呈現(xiàn)顯著升高趨勢，而作為抗氧化酶的SOD、CAT 及谷胱甘肽(glutathione，GSH)還原酶等的活性則表現(xiàn)為顯著下降，通過治療后OS 水平會出現(xiàn)相應(yīng)下調(diào)，基于上述證據(jù)表明OS 與T2DM 發(fā)病關(guān)系密切[17]。

OS 作為氧化水平與抗氧化水平失衡的異常狀態(tài)，可導(dǎo)致大量氧化中間產(chǎn)物生成[18]，其產(chǎn)生的活性氧自由基主要包括ROS 和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)，ROS 和RNS 過量生成則加劇細胞內(nèi)氧化及抗氧化的失衡，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子變性，對機體造成氧化應(yīng)激損傷，而在高血糖環(huán)境刺激下，蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化，產(chǎn)生不可逆的高級糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)，最終誘導(dǎo)機體產(chǎn)生ROS，消耗我們體內(nèi)的SOD、CAT 等抗氧化系統(tǒng)組分[19]，并參與胰島素分泌，影響糖元生成及葡萄糖攝取相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，影響胰腺β 細胞的數(shù)量和功能，加劇葡萄糖攝取和利用障礙，進而就會導(dǎo)致DM。OS 還參與T2DM 的炎癥病理過程，是T2DM 多系統(tǒng)并發(fā)癥的重要驅(qū)動因素[20]。鹽酸二甲雙胍作為重要的一種口服降糖藥物，有助于機體提高對胰島素敏感性及外周葡萄糖的攝取利用，但臨床上僅采用鹽酸二甲雙胍治療效果存在局限性，難以獲得理想的治療效果[21]。司美格魯肽注射液主要以天然GLP-1 分子為基礎(chǔ)，通過藥物分子的改造顯著延長了體內(nèi)半衰期，臨床應(yīng)用就有較好的降糖效果，但部分不良反應(yīng)也較為顯著[22]。中藥多組分、多靶點、多機制作用優(yōu)勢，聯(lián)合應(yīng)用可顯著彌補當前用藥方案的不足。

中醫(yī)認為T2DM 多因先天稟賦不足、長期飲食不節(jié)、情志失調(diào)等因素，導(dǎo)致三焦陰虛火旺，故患者出現(xiàn)口渴欲飲、食欲亢進、乏力消瘦等臨床表現(xiàn)，陰虛則燥熱，燥熱則津虧益甚。肺燥陰虛，胃失濡潤，脾失健運，腎失滋源，陰虛火旺，則生消渴，《素問》曰：“病有口干者……轉(zhuǎn)為消渴”[23-25]。清代醫(yī)家沈金鰲在其《雜病源流犀燭》中創(chuàng)制參芪地黃湯，方中君藥人參，大補元氣，益氣生津；黃芪、山藥可助人參益中焦而升清降濁，益肺胃之津；茯苓健脾滲濕助運；山茱萸補腎澀精益氣；生地黃、牡丹皮涼血生津，全方共奏益氣養(yǎng)陰清熱，健脾滋腎固澀之效[26-28]。現(xiàn)代藥理研究表明，參芪地黃湯可顯著改善T2DM 患者血糖水平，上調(diào)IgG、IgA 水平，改善TNF-α、CRP、IL-6 炎癥因子水平[29]，通過調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH 水平，對糖尿病腎病具有顯著的改善作用[30-32]。

本研究基于T2DM 大鼠模型探究參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽的干預(yù)效果，研究結(jié)果表明，參芪地黃湯聯(lián)合司美格魯肽可顯著降低T2DM大鼠FPG、CHb、TG、TC 及LDL 含量，調(diào)控糖脂代謝異常，下調(diào)ROS 及MDA 生成，抑制機體氧化水平，上調(diào)SOD 及CAT 生成，促進抗氧化水平，其對T2DM 糖脂代謝異常的改善作用機制可能與調(diào)控氧化應(yīng)激水平有關(guān)。