陳 碧，李爐娟，郭 松，3，陳思柳，王小明*

（1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學(xué)院 糖料蔗綠色高效生產(chǎn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來賓 546199；3.廣西科技師范學(xué)院 壯瑤藥品質(zhì)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來賓 546199）

甜茶是集糖、茶、藥于一體的食藥同源類植物，也是壯族、瑤族等少數(shù)民族地區(qū)的常用藥物[1]，含有豐富的甜茶素、茶多酚和多種礦物質(zhì)元素等物質(zhì)，其中甜茶素和茶多酚具有降血壓、降血糖、促進(jìn)代謝等作用[1-2]。甜茶素具有甜度高、熱量低、甜味舒適和風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)，作為一種低熱量的天然非糖甜味劑被廣泛應(yīng)用于各種食品的加工中[3-4]。甘蔗含糖量高并含有豐富的維生素、有機(jī)酸、多酚類及礦物質(zhì)元素[5-6]和風(fēng)味物質(zhì)[7]。

發(fā)酵性茶酒因富含多糖、茶色素、茶多酚、氨基酸和咖啡堿等成分而具有保健醫(yī)療[8-10]等功能，其是以茶葉和茶湯為原料，但由于咖啡堿含量不易控制或原材料選擇不當(dāng)而造成多數(shù)產(chǎn)品存在滋味不協(xié)調(diào)、苦澀味、香氣不豐富等現(xiàn)象[11-12]，亟需通過原材料或生產(chǎn)工藝改善其品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)選用富含甜茶素的甜茶和高糖分的甘蔗汁作為原材料，通過甜茶中的甜味素調(diào)和由茶堿產(chǎn)生的苦澀味，以甘蔗汁中糖分為發(fā)酵提供能量，將兩種原材料的特性有機(jī)的融合和利用，在改善茶酒口感的基礎(chǔ)性上保留了甜茶和甘蔗的營養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味，有利于延長茶葉和甘蔗產(chǎn)業(yè)鏈，提高甜茶和甘蔗資源的利用率和效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗：廣西來賓市售；甜茶：采摘于廣西金秀瑤族自治縣蓮花山；果酒專用RW酵母：湖北省安琪酵母股份有限公司。

福林酚（1 mol/L）：上海源葉生物試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）、沒食子酸（純度≥95%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890B-5977型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；UV-2600紫外可見分光光度儀：島津企業(yè)管理有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；WYA阿貝折射儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；pHS-3E pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

甜茶汁制備[13]：甜茶葉用粉碎機(jī)粉碎1.0 min后過20目篩，采用超聲波結(jié)合水浴的方法進(jìn)行浸提，提取條件為料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度73 ℃、提取時(shí)間31 min，得到的甜茶提取液于高速離心機(jī)中3 600 r/min離心10 min。重復(fù)以上步驟兩次，合并甜茶提取液后于60 ℃恒溫濃縮。

甘蔗汁的制備：選用新鮮，無霉變和病蟲害的甘蔗，經(jīng)清洗、壓榨、過濾，采用蒸餾水將甘蔗汁初始糖度調(diào)整為18°Bx。

菌種活化：將3.5 g果酒專用RW酵母緩緩加入38 ℃的100 mL水中活化，靜置10 min后攪拌，冷卻后加入發(fā)酵液中。

成份調(diào)配與發(fā)酵：將18°Bx甘蔗清汁和茶濃縮汁按照質(zhì)量比為100∶3混合（以不添加茶濃縮汁的甘蔗清汁制備甘蔗酒），用檸檬酸溶液調(diào)整pH為3.8后滅菌，接種3.5%已活化酵母25 ℃發(fā)酵5 d。

離心、澄清：原酒置于高速離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，得到澄清的成品并裝瓶。裝瓶酒樣采用巴氏滅菌法（63 ℃殺菌30 min）滅菌，即得甜香型甘蔗甜茶酒。

1.3.2 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察甜茶汁添加量（相對(duì)于甘蔗汁的百分含量）、酵母接種量、發(fā)酵溫度3個(gè)因素對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0 °Bx、酵母添加量3.5%、發(fā)酵溫度25.0 ℃，發(fā)酵時(shí)間5 d的條件下，考察甜茶汁添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、發(fā)酵溫度25.0 ℃、發(fā)酵時(shí)間5 d的條件下，考察酵母接種量（1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%）對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響。

在甘蔗汁的糖度16.0°Bx、甜茶汁添加量3.0%、酵母添加量3.5%，發(fā)酵時(shí)間5 d的條件下，考察發(fā)酵溫度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇甜茶汁添加量（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken（BBD）響應(yīng)面設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝[14-16]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine

1.3.3 感官評(píng)價(jià)方法

甜香型甘蔗甜茶酒感官評(píng)價(jià)：參考已有茶酒的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[14-16]和GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[17]，并根據(jù)本產(chǎn)品特性做適當(dāng)調(diào)整，由10名受過感官評(píng)分培訓(xùn)的食品專業(yè)人員，從色澤、香氣、口感、風(fēng)格4項(xiàng)進(jìn)行感官評(píng)分，取10人平均分，滿分100分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 甜香型甘蔗甜茶酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of sweet sugarcane tea wine

1.3.4 理化指標(biāo)測定

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》的酒精計(jì)法進(jìn)行[17]；可溶性固形物：采用阿貝折光儀測定；總黃酮含量：采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法測定；總酚含量：采用Folin-Ciocalteau法測定[18]；pH、總酸：按照GB/T 13362—2018《黃酒》測定[19]。

1.3.5 揮發(fā)性香氣成分分析

香氣富集：參考譚敏華等[20]的方法并稍作修改。取8.0 mL甜香型甘蔗甜茶酒、甘蔗酒加入15.0 mL樣品瓶，隨后加入1.0 g NaCl，并在樣品瓶中加入攪拌子。用萃取頭（DVB/CAR/PDMS 57348-U）在40 ℃條件下萃取40 min，于氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；載氣為氦氣（He）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：35 ℃保持8 min，以2 ℃/min升至150 ℃，再以4 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；柱流量0.8 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍35～550 amu；離子源溫度230 ℃；電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃。

定性定量方法：選取匹配度≥80%的物質(zhì)，通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫與揮發(fā)性化合物譜圖進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合相關(guān)資料及文獻(xiàn)進(jìn)行分析和鑒定進(jìn)行定性；采用峰面積歸一法進(jìn)行定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用Origin pro 2018軟件進(jìn)行單因素及曲線回歸分析和制圖，單組別試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析、采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken（BBD）試驗(yàn)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 甜茶汁添加量對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響由圖1可知，隨著甜茶汁添加量的增加，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度呈先緩慢后較快速下降的趨勢，感官評(píng)分呈先快速升高后緩慢降低的趨勢；當(dāng)甜茶汁添加量為3%時(shí)，甜香型甘蔗甜茶酒茶味明顯，口感回甘綿延，呈淺棕黃澄清透明發(fā)亮，感官評(píng)分最高為85.10分，此時(shí)酒精度也較高為8.41%vol；當(dāng)甜茶汁添加量為4%和5%時(shí)甜香型甘蔗甜茶酒酒精度下降較明顯可能是因?yàn)殡S著甜茶汁添加量增加，茶濃縮汁中較高濃度的生物堿濃度從而抑制了酵母菌的生長，導(dǎo)致酒精度降低[21]。綜合考慮，選擇甜茶汁添加量為3%時(shí)較為合適。

圖1 甜茶汁添加量對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of different sweet tea juice addition on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.1.2 酵母接種量對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，感官評(píng)分和酒精度先升高后下降。當(dāng)酵母接種量為3.5%時(shí)，感官評(píng)分最高為85.90分，此時(shí)酒精度為8.87%vol；當(dāng)酵母接種量超過3.5%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分都呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)楫?dāng)酵母接種量過高，樣品起酵快，然而發(fā)酵液營養(yǎng)基質(zhì)有限，造成發(fā)酵液中糖分不足，導(dǎo)致果酒中乙醇下降[22-23]；同時(shí)發(fā)酵過快導(dǎo)致過多的酵母活力不足甚至死亡，造成酒體粗糙，香氣不足、酵母味較重，影響甜香型甘蔗甜茶酒的品質(zhì)和風(fēng)味[16]。因此，酵母接種量為3.5%時(shí)，甜香型甘蔗甜茶酒的發(fā)酵效果和品質(zhì)最好。

圖2 酵母接種量對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，發(fā)酵溫度由15 ℃升高至25 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度和感官評(píng)分逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高為90.50分，此時(shí)酒精度為8.89%vol；當(dāng)溫度超過25 ℃時(shí)，甜香型甘蔗甜茶酒的隨著發(fā)酵溫度升高酒精度和感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)楫?dāng)發(fā)酵溫度低于25 ℃時(shí)，酵母的活性較低和生長較慢，導(dǎo)致酒精度低和香氣不足[23]；當(dāng)發(fā)酵溫度高于25 ℃時(shí)，出芽率和發(fā)酵速度過快，使其發(fā)酵動(dòng)力不足，使其酒精度數(shù)降低，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致茶葉中香味成分的揮發(fā)，導(dǎo)致香味物質(zhì)的產(chǎn)生不充分，對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒的香味產(chǎn)生不利影響[15，23]。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)較為合適。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of sweet sugarcane tea wine

2.2 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)考察各因素水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到以甜香型甘蔗甜茶酒感官評(píng)分（Y）作為響應(yīng)值的回歸方程：Y=91.56-0.64A+1.07B+0.59C+0.092AB-0.28AC-0.4BC-2.57A2-3.50B2-4.01C2。

表3 甜香型甘蔗甜茶酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization of sweet sugarcane tea wine

表4 回歸模型果方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

根據(jù)表4可知，該模型具有極顯著性（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.348＞0.05，不顯著，說明二次多項(xiàng)回歸模型顯著。該模型決定系數(shù)R2=0.998 5，證明有99.85%響應(yīng)值的變化能用該模型來解釋，表明該模型適用分析相關(guān)因素與響應(yīng)值的關(guān)系。根據(jù)F值的大小，可以判斷各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響順序?yàn)榻湍柑砑恿浚˙）＞甜茶汁添加量（A）＞發(fā)酵溫度（C）。根據(jù)P值可知，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果具有極顯著性影響（P＜0.01），交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果具有顯著性影響（P＜0.05）。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

根據(jù)曲面的陡峭程度來分析任意兩個(gè)變量的交互關(guān)系。由圖4a可知，曲面斜率較平緩，A、B因素交互作用不顯著；由圖4b可知，曲面斜率較陡峭，表明A、C因素交互作用顯著，與表4試驗(yàn)結(jié)果相符；由圖4c可知，曲面斜率陡峭，表明B與C交互作用極顯著，與表4中試驗(yàn)結(jié)果相符，表明AC和BC對(duì)甜香型甘蔗甜茶酒感官評(píng)價(jià)影響較大。

圖4 各因素間交互作用對(duì)甘蔗糖茶酒品質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between various factors on the quality of sugarcane sweet tea wine

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)上述回歸模型進(jìn)行極值分析，得到預(yù)測最佳發(fā)酵工藝條件為甜茶汁添加量2.87%、酵母接種量3.79%、發(fā)酵溫度25.32 ℃，在此條件下甜香型甘蔗甜茶酒的感官評(píng)分預(yù)測值為91.70分?？紤]到實(shí)際可操作性，修正發(fā)酵工藝條件為甜茶添加量2.9%、酵母接種量3.8%、發(fā)酵溫度25.3 ℃，在此條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度為（8.9±0.08）%vol，感官評(píng)分平均實(shí)際值為92.5分，所得結(jié)果與預(yù)測結(jié)果值接近，表明該模型所得的優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠。

2.3 產(chǎn)品指標(biāo)分析

2.3.1 基本理化指標(biāo)

由表5可知，甜香型甘蔗甜茶酒的酒精度為（8.94±0.08）%vol、pH為3.74±0.01、總酸含量為（4.74±0.05）g/L，甜茶中豐富的無機(jī)酸和有機(jī)酸類保證了甜香型甘蔗甜茶酒獨(dú)特醇厚的風(fēng)味。甜香型甘蔗甜茶酒具有較高的清澈度，亮度L*值為84.17±0.23；亮度較高，a*值為2.92±0.17，相對(duì)于甘蔗酒增加3.79，偏向紅色調(diào)；b*值為51.17±0.72，相對(duì)于甘蔗酒增加34.25，偏向黃色調(diào)；酒體通透有光澤且呈現(xiàn)落日般的微紅黃色，其結(jié)果與感官評(píng)價(jià)吻合。

表5 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical indexes of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine

2.3.2 抗氧化成分和能力分析

由表6可知，甜香型甘蔗甜茶酒總黃酮、總酚含量分別為120.99 mg/100 g、67.10 mg/100 g，較甘蔗酒總黃酮和總酚分別高75.01 mg/100 g、49.63 mg/100 g；甜香型甘蔗甜茶酒的總黃酮和總酚有助于增強(qiáng)其抗氧化能力，經(jīng)測定，其DPPH自由基清除率為87.34%，這是由于甜茶含有豐富的茶多酚[9，12]等活性成分，有效提高了甜香型甘蔗甜茶酒的抗氧化能力[4，13]。

表6 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒抗氧化成分及能力結(jié)果Table 6 Determination results of antioxidant components and capacity of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine

2.3.3 甜香型甘蔗甜茶酒揮發(fā)性香氣成分分析

利用GC-MS從甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒中共檢測出24種揮發(fā)性香氣成分（見表7），其中甜香型甘蔗甜茶酒中檢出20種揮發(fā)性香氣成分，包括酯類7種、醇類6種、有機(jī)酸類3種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種；甘蔗汁酒中檢出18種揮發(fā)性香氣成分，包括酯類4種、醇類5種、有機(jī)酸類4種、酚類1種、酮類1種、烷烴類2種、胺類1種。添加甜茶后，甜香型甘蔗甜茶酒酯類化合物和醇類化合物的數(shù)量增多，分別比甘蔗酒增加了4和1種。甜香型甘蔗甜茶酒中檢測出來的酯類化合物有乙酸- 2-叔丁基-4-（二氟甲基）-1,3-惡唑-5-羧酸-2-苯基酯、甲酸己酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸酯、肉桂醇丙酸酯7種，其中辛酸乙酯相對(duì)含量為9.39%，賦予甘蔗茶酒果香和甜香[25]，癸酸乙酯相對(duì)含量為2.94%，賦予甘蔗茶酒菠蘿香、花香[26]，甜香型甘蔗甜茶酒特有四種酯類賦予其蘋果和未成熟梅子似甜香氣、果香和甜香及葡萄、草莓香[27]，甜香型甘蔗甜茶酒豐富的香氣是由于甜茶汁和甘蔗汁在酵母厭氧代謝過程中產(chǎn)生，使其呈現(xiàn)馥郁、迷人、獨(dú)特的甜香和茶香。

表7 甜香型甘蔗甜茶酒與甘蔗酒揮發(fā)性香氣成分GC-MS測定結(jié)果Table 7 Determination results of volatile aroma compounds of sweet sugarcane tea wine and sugarcane wine by GC-MS

3 結(jié)論

以甜茶和甘蔗汁為主要原料制備甜香型甘蔗甜茶酒，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定甜香型甘蔗甜茶酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為甜茶汁添加量2.9%、酵母接種量3.8%、發(fā)酵溫度為25.3 ℃，此時(shí)甜香型甘蔗甜茶酒感官評(píng)分為92.5分、酒精度為8.9%vol。不僅豐富茶酒口感和香氣，同時(shí)保留了甜茶和甘蔗的天然營養(yǎng)活性成分。研究表明在最佳發(fā)酵工藝下制作甜香型甘蔗甜茶酒，具有茶清香、甘蔗果香和回甘綿長等特點(diǎn)，在調(diào)和茶酒苦澀味和豐富酒香的基礎(chǔ)上，增加茶酒中總酚、總黃酮的含量及提高抗氧化能力，總酚和總黃酮含量分別為67.10 mg/100 g、120.99 mg/100 g，DPPH自由基清除率為87.34%。