曾朝珍，慕鈺文，袁 晶，宋 娟，張海燕，康三江*

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果酒是一種由蘋果汁發(fā)酵而成的酒精飲料，以其低酒精度和適口性廣受歡迎，已成為世界第二大消費(fèi)量的果酒[1]。蘋果酒發(fā)酵是微生物代謝的生化過(guò)程，酵母把糖轉(zhuǎn)化為酒精、酯、酸和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物對(duì)蘋果酒的感官和品質(zhì)特性有重要影響[2]。蘋果酒發(fā)酵代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生受多種因素的影響，如發(fā)酵菌株[3-5]、蘋果果汁成分[6-7]以及可同化的氮[8]等。除了以上幾個(gè)因素以外，發(fā)酵溫度也可以影響微生物的代謝，進(jìn)而影響果酒風(fēng)味。近年來(lái)，采用低于釀酒酵母適宜溫度（25～32 ℃）的低溫發(fā)酵（10～15 ℃）成了果酒發(fā)酵的一種新趨勢(shì)[9]。低溫可使釀酒酵母能夠通過(guò)除Ehrlich途徑之外的其他補(bǔ)償途徑，使氧化還原平衡多樣化，從而產(chǎn)生更多樣化的風(fēng)味活性酯[10]。馬懿等[11]研究認(rèn)為，較低溫度發(fā)酵的梨果酒酸度更低，褐變度和色澤飽和度低，澄清度更高；鄧開野等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低溫既能有效保留荔枝酒的香氣成分，還能控制高級(jí)醇的生成；肖作兵等[13]的研究結(jié)果表明，櫻桃酒的香氣物質(zhì)和有機(jī)酸在不同的發(fā)酵溫度下的種類和含量各不同。另外，一些學(xué)者也對(duì)臍橙果酒[14]、枸杞果酒[15]和香蕉酒[16]的低溫發(fā)酵工藝及揮發(fā)性香氣成分的變化也進(jìn)行了研究。由此可見，發(fā)酵溫度對(duì)果酒的質(zhì)量影響顯著，但目前關(guān)于發(fā)酵溫度對(duì)蘋果酒的理化成分和揮發(fā)性香氣成分的影響研究相對(duì)較少。

本研究以富士蘋果為原料，以15 ℃和25 ℃兩種不同溫度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，研究發(fā)酵溫度對(duì)蘋果酒的發(fā)酵性能、理化成分和揮發(fā)性香氣成分的影響，探究不同溫度發(fā)酵蘋果酒品質(zhì)特性的差異，旨在為低溫發(fā)酵蘋果酒的研發(fā)與品質(zhì)提升提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母1023：由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；富士蘋果：采自甘肅天水市；丁酸、丙酸、琥珀酸、乙酸、乳酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸（純度均＞98%）：上海麥克林生化科技有限公司；17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品：日本W(wǎng)ako公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE ISQ型三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（gas chromatography-triple four-stage mass spectrometry，GC-MS）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Waters 2695型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)沃特斯公司；ATAGO PAL-3 型糖度計(jì)：日本愛拓公司；PB-10型精密pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；S433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀：德國(guó)賽卡姆Sykam公司；LRH-70型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-75SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHJH-C11128型超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

富士蘋果→清洗→破碎→蘋果汁→酵母接種→酒精發(fā)酵→蘋果酒

操作要點(diǎn)：將富士蘋果分選、洗滌、去核后進(jìn)行破碎、壓榨，在壓榨好的果汁中加入偏重亞硫酸鉀（以SO2計(jì)，終質(zhì)量濃度為75 mg/L），將釀酒酵母從保存的斜面培養(yǎng)基中用接種環(huán)挑取6環(huán)菌苔接種于裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h；然后將活化好的釀酒酵母接種于裝有500 mL蘋果汁的三角瓶中，接種量為6%，接種濃度為106CFU/mL，然后分別在15 ℃和25 ℃條件下厭氧靜置發(fā)酵至質(zhì)量恒定。

1.3.2 理化指標(biāo)分析方法

有機(jī)酸含量測(cè)定：參考胡陸軍等[17]的方法并加以改進(jìn)。取2 mL樣品，10 000 r/min離心5 min后取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)有機(jī)酸的含量。Waters Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.5 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動(dòng)相：0.05 mmol/L H3PO4∶甲醇=95∶5（V/V）混合；流速：0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。進(jìn)樣量：10 μL。

氨基酸含量測(cè)定：參考唐柯等[18]的方法并加以改進(jìn)。取1 mL樣品，用100 g/L的三氯乙酸等體積稀釋后靜置1 h，雙層濾紙過(guò)濾后10 000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于液相樣品瓶?jī)?nèi)，通過(guò)HPLC檢測(cè)氨基酸的含量。檢測(cè)條件為流動(dòng)相A（pH=7.2）：27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（500∶0.11∶2.5，V/V）；流動(dòng)相B（pH=7.2）：80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）。Agilent Hypersil ODS色譜柱（4.0 mm×250 mm，5 μm），采用梯度洗脫，洗脫程序：0 min，8% B；17 min，50% B；20.1 min，100% B；24.0 min，0% B；流動(dòng)相流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm（脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)262nm）。

可溶性固形物、可滴定酸及pH：可溶性固形物采用糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可滴定酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]測(cè)定；pH值：采用pH計(jì)測(cè)定。

酵母酒精發(fā)酵力測(cè)定[20]：采用失重法，以二氧化碳揮發(fā)產(chǎn)生的質(zhì)量損失來(lái)衡量酵母發(fā)酵力的大小，每隔24 h稱質(zhì)量一次，直至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.3 蘋果酒揮發(fā)性香氣成分分析

蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法：參考曾朝珍等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用IBM SPSS Statistics 24.0和Origin 2021等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵溫度條件下酵母發(fā)酵力及蘋果酒基本理化成分變化

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵過(guò)程中酵母發(fā)酵力及蘋果酒可溶性固形物、可滴定酸、pH等基本理化成分含量的變化影響情況見圖1。

圖1 不同發(fā)酵溫度條件下酵母發(fā)酵力（A）及蘋果酒可溶性固形物（B）、可滴定酸（C）和pH值（D）的變化Fig.1 Changes of yeast fermentation capacity (A), soluble solids (B),titratable acid (C) and pH (D) in cider under different fermentation temperature

由圖1A可知，不同發(fā)酵溫度條件下的發(fā)酵均已完成，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的結(jié)束時(shí)間由25 ℃發(fā)酵的8 d延長(zhǎng)至12 d。另外，酵母發(fā)酵力第4天達(dá)到最大值，且15 ℃發(fā)酵條件下的二氧化碳質(zhì)量損失（30.87 g）低于25 ℃發(fā)酵（39.32 g），表明低溫對(duì)酵母的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有影響，酵母發(fā)酵力因溫度的升高而變強(qiáng)，這與GAMERO A等[22]的研究結(jié)果一致。由圖1B可知，15 ℃發(fā)酵條件下的可溶性固形物消耗量比25 ℃發(fā)酵條件下的低，在25 ℃發(fā)酵條件下，蘋果酒的可溶性固形物含量0～6 d時(shí)迅速下降，而15 ℃發(fā)酵條件下，蘋果酒的可溶性固形物含量2～8 d時(shí)迅速下降，然后下降緩慢。發(fā)酵結(jié)束后，不同發(fā)酵溫度條件的下蘋果酒中可溶性固形物含量變化趨勢(shì)趨于一致，但從前期發(fā)酵過(guò)程變化趨勢(shì)可以看出，可溶性固形物消耗量隨著發(fā)酵溫度的升高而變大。由圖1C可知，在不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒的可滴定酸含量均呈先升高后降低的趨勢(shì)，最高含量均達(dá)到了4.57 g/L，發(fā)酵結(jié)束后可滴定酸含量較未發(fā)酵時(shí)略有增加，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終可滴定酸含量為4.41 g/L，而25 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終可滴定酸含量為4.53 g/L，最終可滴定酸含量因溫度的升高其含量也增加。由圖1D可知，蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中pH值在3.97～4.19之間變化，15 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終pH值為4.09，而25 ℃發(fā)酵蘋果酒的最終pH值為4.04，最終pH因溫度的升高其含量降低。以上結(jié)果表明，酵母發(fā)酵力、可溶性固形物消耗量及可滴定酸與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，而pH與發(fā)酵溫度呈負(fù)相關(guān)。

2.2 不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中有機(jī)酸含量分析

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中蘋果酸、檸檬酸、丁酸、乳酸、富馬酸、琥珀酸、乙酸及丙酸含量見圖2。

圖2 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒有機(jī)酸含量分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of organic acid contents in cider under different fermentation temperature

由圖2可知，不同溫度發(fā)酵蘋果酒中有機(jī)酸的種類和含量都不同。15 ℃發(fā)酵的蘋果酒中蘋果酸、檸檬酸、丁酸和富馬酸含量較高，分別為3.61 g/L、0.15 g/L、0.07 g/L和0.02 g/L；而25 ℃發(fā)酵的蘋果酒含有較高的乳酸、琥珀酸、乙酸及丙酸，其含量分別為3.02 g/L、1.36 g/L、0.30 g/L和0.07 g/L。由以上結(jié)果可知，酵母菌會(huì)因發(fā)酵溫度的影響而使其代謝發(fā)生變化。蘋果酸在蘋果汁中始終站主導(dǎo)地位[23-24]，在蘋果汁發(fā)酵蘋果酒時(shí)，發(fā)酵溫度越低，蘋果酸的含量降低不顯著，而發(fā)酵溫度越高，其含量降低越顯著。在發(fā)酵過(guò)程中，蘋果酸作為一種碳源可被酵母菌分解利用并轉(zhuǎn)化為其他有機(jī)酸[25]。在不同種類的有機(jī)酸中，乳酸對(duì)蘋果酒的柔軟感有積極的影響，而琥珀酸則有咸味和苦味[26]。檸檬酸雖然不是有機(jī)酸中最酸的，但是一些研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸對(duì)水果酸性的貢獻(xiàn)率高于蘋果酸[27]。琥珀酸可以由蘋果酸在厭氧條件下轉(zhuǎn)化和一些氨基酸的分解而形成，是酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中形成的一種常見代謝物[27]。乙酸是酒類中的主要揮發(fā)酸，其特有的味道會(huì)對(duì)人的舌后部產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激；丙酸、丁酸及富馬酸在果酒中的含量極低，對(duì)果酒的酸味影響很小。另外，由于這些酸類化合物均具有極高的閾值，它們不會(huì)給蘋果酒帶來(lái)不良影響[28]。

2.3 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中氨基酸含量的變化

不同發(fā)酵溫度條件下發(fā)酵的蘋果酒中氨基酸含量見圖3。

圖3 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中氨基酸含量分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of amino acid contents in cider under different fermentation temperature

由圖3可知，蘋果酒中含17種氨基酸15 ℃發(fā)酵蘋果酒中半胱氨酸（Cys-s）、苯丙氨酸（Phe）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、異亮氨酸（Ile）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、蛋氨酸（Met）和脯氨酸（Pro）含量相對(duì)較高，其中甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）含量相對(duì)較高，分別為7.37 mg/L、6.48 mg/L和5.11 mg/L；25 ℃發(fā)酵蘋果酒中絡(luò)氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和組氨酸（His）含量相對(duì)較高，其中纈氨酸（Val）、組氨酸（His）和蘇氨酸（Thr）含量相對(duì)較高，分別為10.99 mg/L、4.82 mg/L和2.84 mg/L。

一些研究認(rèn)為游離態(tài)氨基酸是具有味覺活性的物質(zhì)，谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸呈現(xiàn)鮮味，蘇氨酸、組氨酸、絲氨酸、丙氨酸和脯氨酸呈現(xiàn)甜味，蛋氨酸、精氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸呈現(xiàn)苦味，苯丙氨酸和酪氨酸呈現(xiàn)芳香味[29]。氨基酸作為蘋果酒中風(fēng)味成分之一，其含量高低將會(huì)對(duì)蘋果酒口感及風(fēng)味的縱深度與復(fù)雜性產(chǎn)生直接的影響。氨基酸本身除了呈現(xiàn)出鮮、甜、苦、鮮等多種味感，給蘋果酒提供豐富飽滿的味覺層外，還與酒中的醇類、酯類、有機(jī)酸、羰基化合物和萜烯化合物等協(xié)同構(gòu)成了蘋果酒的特有風(fēng)味，賦予了蘋果酒較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。綜上，不同品種發(fā)酵蘋果酒之間氨基酸存在差異，可以用氨基酸的種類和含量作為判別蘋果酒產(chǎn)品的指標(biāo)。

2.4 不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分的變化

不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒揮發(fā)性香氣成分含量見表1。

由表1可知，在15 ℃和25 ℃條件下發(fā)酵的蘋果酒在每種香氣類別（酯類＞醇類＞酸類）的揮發(fā)性化合物總含量上表現(xiàn)出基本相同的行為，但各組之間的香氣特征有所不同。蘋果酒所有類別的揮發(fā)性化合物中，酯類物質(zhì)的含量占主導(dǎo)地位，15 ℃、25 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的總酯含量分別為4 576.62 μg/L、2 664.06 μg/L?？傰ジ鶕?jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪酸乙酯（癸酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯和月桂酸乙酯）、乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯、乙酸丁酯和乙酸己酯）和高級(jí)醇酯（辛酸異戊酯）。具體而言，在15 ℃發(fā)酵的蘋果酒中脂肪酸乙酯比25 ℃發(fā)酵的蘋果酒中脂肪酸乙酯更豐富，其中含量相對(duì)較高的是癸酸乙酯和辛酸乙酯。癸酸乙酯和辛酸乙酯屬于中鏈脂肪酸乙酯，是最豐富的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，占蘋果酒總芳香族化合物含量的50%以上，這與XU J N等[30]的研究結(jié)果一致。另外，醇是蘋果酒中含量豐富的另一類主要揮發(fā)性物質(zhì)。高級(jí)醇被認(rèn)為是酯的最重要的前體之一，但過(guò)量的高級(jí)醇可能會(huì)對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[9]。本試驗(yàn)中發(fā)酵蘋果酒中總的高級(jí)醇含量隨著發(fā)酵溫度的降低而降低，由25 ℃發(fā)酵蘋果酒的3 428.95 μg/L降低為15 ℃發(fā)酵蘋果酒3 297.05 μg/L，其中3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、1-己醇在發(fā)酵后的蘋果酒中含量相對(duì)較高。大多數(shù)高級(jí)醇是在酵母發(fā)酵過(guò)程中由氨基酸降解而來(lái)的[31]，高級(jí)醇根據(jù)其濃度的不同會(huì)對(duì)果酒的感官特性有正面或負(fù)面的影響。已有學(xué)者研究證明，低溫發(fā)酵會(huì)在果酒中產(chǎn)生低濃度的高級(jí)醇[32]。在本研究中，該酵母在蘋果酒發(fā)酵中也表現(xiàn)出了相同的行為。羧酸是蘋果酒發(fā)酵中形成的一類揮發(fā)性化合物。15 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的脂肪酸總含量（703.53 μg/L）高于在25 ℃條件下發(fā)酵蘋果酒的脂肪酸總含量（226.15 μg/L）。其中，己酸、辛酸和癸酸是蘋果酒中檢測(cè)到的主要脂肪酸，它們是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，對(duì)此可能的解釋來(lái)自于釀酒酵母的脂質(zhì)代謝。中鏈脂肪酸是酒精發(fā)酵過(guò)程中脂質(zhì)合成的副產(chǎn)物，與其他弱酸一起影響酵母質(zhì)膜的組織和穩(wěn)定性。這種現(xiàn)象會(huì)使釀酒酵母將親脂性酸排泄到外部介質(zhì)中。事實(shí)上，在某些脅迫條件下，如發(fā)酵溫度低，釀酒酵母可以產(chǎn)生更高含量的中鏈脂肪酸[33]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了釀酒酵母在不同發(fā)酵溫度下對(duì)蘋果酒品質(zhì)的影響，理化成分和揮發(fā)性香氣成分檢測(cè)結(jié)果表明，15 ℃發(fā)酵對(duì)酵母發(fā)酵動(dòng)力學(xué)有顯著影響，發(fā)酵周期較25 ℃發(fā)酵延長(zhǎng)了4 d；可滴定酸與pH的變化呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，可滴定酸最終含量由25 ℃發(fā)酵的4.53 g/L下降為4.41 g/L，而pH則由4.04增加為4.09；不同發(fā)酵溫度條件下蘋果酒中有機(jī)酸和氨基酸的種類及含量都差異顯著；發(fā)酵溫度對(duì)主要揮發(fā)性化合物的類別產(chǎn)生了不同的影響，與25 ℃發(fā)酵蘋果酒相比，在低溫發(fā)酵的蘋果酒中顯示出較高的總酯含量、脂肪酸含量和較低的高級(jí)醇含量，其含量分別為4 576.62 μg/L、703.53 μg/L、3 297.05 μg/L。因此，發(fā)酵溫度的變化會(huì)顯著影響關(guān)鍵香氣化合物的產(chǎn)生和蘋果酒的理化成分，這些結(jié)果可以幫助蘋果酒生產(chǎn)商在最佳發(fā)酵溫度下為消費(fèi)者生產(chǎn)出質(zhì)量更好的產(chǎn)品。