龔虎程，王 宇，羅 靜，張家旭，田樹林，邊名鴻，高 健，韓保林*

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.成都蜀之源酒業(yè)有限公司，四川 成都 611335）

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，不僅在國內(nèi)聞名，同時在國外也享有一定的地位[1-2]。其中濃香型白酒具有綿甜甘冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈香長等風味特點，年產(chǎn)量占據(jù)我國白酒市場的70%以上，在國內(nèi)白酒行業(yè)處于領先地位，深受人們的喜愛[3]。泥窖發(fā)酵是濃香型白酒最典型的特征，是區(qū)別于其他香型白酒的關鍵所在，窖泥的質量也成為決定其品質的關鍵因素之一[4-5]。窖泥由特殊土質、麩曲粉、黃水、己酸菌液、酒尾等構成，含有豐富的細菌、古菌和真菌微生物資源，是濃香型白酒生產(chǎn)釀造的基礎[6-8]。窖泥內(nèi)部的酯化菌能夠代謝產(chǎn)生酯化酶，從而將乙醇與小分子有機酸如己酸、乙酸、乳酸、丁酸等酯化縮合生成相應的乙酯類化合物，增加濃香型白酒主體香成分，發(fā)揮生香的作用[9-10]。

微生物會根據(jù)自身的生長特性來選擇適宜的條件進行生長、代謝、繁殖，在窖泥的特殊環(huán)境下，大多數(shù)霉菌會被逐漸淘汰，而細菌則會逐漸成為窖泥微生態(tài)環(huán)境中的主體部分[11]。并且窖內(nèi)復雜的微生態(tài)環(huán)境表明，一系列的生香反應不是單個菌株作用的結果，而是多種微生物協(xié)同作用完成的。當前已有一些學者對窖泥中酯化菌和協(xié)同發(fā)酵進行了研究，并且表明細菌是窖泥中主要的酯化菌[12-13]。趙志軍等[14]優(yōu)化酯化菌的產(chǎn)酶條件，最終獲得最優(yōu)的工藝，并且酯化酶活力明顯提升。衛(wèi)春會等[15]研究發(fā)現(xiàn)，傳代富集能夠增加酯類物質的含量和數(shù)量，并且利于厭氧酯化菌的篩選。黃治國等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將3株酯化菌復配發(fā)酵能顯著提升己酸乙酯和丁酸乙酯的含量。郭燕等[17]探究酵母菌和酯化菌的混菌協(xié)同發(fā)酵，最終獲得最優(yōu)的工藝條件，并且己酸乙酯和丁酸乙酯的含量明顯提升。

本研究以40年窖泥為研究對象，分離篩選酯化酶活力較高的細菌，利用形態(tài)學觀察和分子生物學技術對篩選菌株進行鑒定。將篩選菌株與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4協(xié)同發(fā)酵，以酯化酶活力為評價指標，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化協(xié)同發(fā)酵條件，并采用頂空固相微萃取結合氣質聯(lián)用（headspace solid phase microextraction gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技術分析發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物。以期為改良衰退窖泥、養(yǎng)護窖池和人工窖泥的培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌株

窖泥：無菌操作采集于宜賓、邛崍兩個知名酒企40年窖池上層（距窖口50 cm）、中層（窖池中部）、下層（距窖底50 cm）窖泥，無菌袋中立即混勻于干冰中貯存運回實驗室-20 ℃保存待用。

異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4：篩選自邛崍某知名酒企大曲，本實驗室-20 ℃保藏。

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：天津市致遠化學試劑有限責任公司；葡萄糖、氯化鈉、硫酸銨、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、無水乙醇、聚乙烯醇1788、革蘭氏染液、三丁酸甘油酯（均為分析純）、酵母粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：成都市科隆化學品有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基：水瓊脂20 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD液體培養(yǎng)基：YPD固體培養(yǎng)基不添加瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20 g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，七水硫酸亞鐵0.01 g/L，調(diào)pH至7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SPX-250BE生化培養(yǎng)箱：上海力辰邦西儀器科技有限公司；CP124C電子天平：美國OHAUS公司；Stab MiniL搖床：上海潤度生物科技有限公司；MX-S混勻儀：北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；DHG-9140A烘箱：上海一恒科學儀器有限公司；TG16.5高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TOUCH BGLN光學顯微鏡：寧波天宇光電科技有限公司；DGL-50B滅菌鍋：江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離與純化

分別稱取兩個窖泥樣品各10 g于100 mL無菌生理鹽水中充分振蕩混勻，取上清液以10倍梯度稀釋法逐級稀釋，得到10-1～10-7菌懸液。不同稀釋度的菌懸液于篩選培養(yǎng)基上涂布，35 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察選取具有透明圈的菌落，之后進行分離、純化和保藏。

1.3.2 菌種鑒定

形態(tài)學鑒定：待純化菌株長出后，按照《常見細菌鑒定手冊》對菌株進行形態(tài)學觀察和革蘭氏染色[18-19]。

分子生物學鑒定：將純化后的菌株送至成都擎科生物科技股份有限公司進行測序。測序結果提交至美國國家生物信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，與已知模式菌株的16S rDNA基因序列進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，選取同源性較高的菌株，采用MEGA X軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.3 種子液、發(fā)酵液及粗酶液的制備

將篩選菌株CY-1、CY-2、SY-3分別挑取一環(huán)接種于液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r/min條件下將活細胞培養(yǎng)至106CFU/mL，得到菌株CY-1、CY-2、SY-3種子液；將菌株JM-4挑一環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、100 r/min條件下將活細胞培養(yǎng)至106CFU/mL，得到菌株JM-4種子液。將菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1混合，制備得到混菌種子液[17]。

將菌株CY-1、CY-2、SY-3、JM-4種子液和混菌種子液分別以5%的接種量接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于35 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。

發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，除去沉淀，留取上清液即得粗酶液，4 ℃保存。

1.3.4 篩選菌株的透明圈直徑及酯化酶活力測定

將已滅菌的水瓊脂培養(yǎng)基倒至培養(yǎng)皿下層約10 mL，待其凝固；之后在凝固的培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙；再將篩選培養(yǎng)基倒在底層培養(yǎng)基上，待其凝固后，取出牛津杯，即形成孔洞。向孔洞內(nèi)接種0.1 mL酶液（種子液離心上清液），室溫擴散30 min，培養(yǎng)皿正面向上置于35 ℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)孔周圍透明圈大小。參照劉延波等[21]的測定方法測定篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌（菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1）協(xié)同發(fā)酵的粗酶液中酯化酶活力，每組3個平行，同時做空白對照。

1.3.5 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

探究混菌（菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4種子液按照體積比1∶1∶1∶1）協(xié)同發(fā)酵接種量（1%、3%、5%、7%、9%）；初始pH值（3、4、5、6、7）；發(fā)酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對酯化酶活力的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以接種量（A），初始pH值（B）及發(fā)酵時間（C）為影響因素，酯化酶活力為考察指標，通過L9（33）正交設計進行協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for conditions optimization of synergistic fermentation

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物測定

通過HS-SPME-GC-MS測定單菌發(fā)酵和混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物[22-23]。

樣品前處理：取5 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中，再加入2 g NaCl和10 μL 2-辛醇（82.2 μg/mL）。樣品先于50 ℃平衡15min，然后插入萃取針頂空萃取30min，之后進樣解吸3min。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序為：35 ℃保持4 min，然后以2 ℃/min升溫到60 ℃不保持，再以6 ℃/min升溫到180 ℃保持15 min；進樣口溫度230 ℃；高純氦氣（He）為載氣，不分流進樣，流速0.9 mL/min。

質譜條件：離子源溫度和連接線溫度均為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV；采集模式為全掃描，質譜范圍20～550 amu。

定性定量方法：采用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）05a.L標準譜庫的GenBank數(shù)據(jù)庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，選擇匹配度均≥80（最大值100）的特征離子進行定性分析，并鑒定結果。以體積分數(shù)60%乙醇配制成質量濃度為82.2 μg/mL的2-辛醇作為內(nèi)標，于5 mL發(fā)酵液中加入10 μL 2-辛醇，通過測定樣品中揮發(fā)性化合物峰面積與2-辛醇峰面積之比以及內(nèi)標在樣品中的最終濃度來計算揮發(fā)性化合物的含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件進行方差分析，采用Origin 2022軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酯化菌的分離篩選及鑒定結果

2.1.1 篩選菌株形態(tài)學鑒定

通過稀釋平板涂布法和透明圈法從40年窖泥中共篩選到3株酯化菌，分別編號為CY-1、CY-2和SY-3，其菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和特征描述結果見表2。

表2 篩選菌株的菌落、細胞形態(tài)及特征描述Table 2 Colony and cell morphology and characterization description of screened strains

2.1.2 篩選菌株分子生物學鑒定

篩選菌株委托成都擎科科技股份有限公司進行測序，測序結果提交至美國國家生物信息中心（NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性比對，結果表明，菌株CY-1與阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）同源性達到100%；菌株CY-2與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源性達到99%；菌株SY-3與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）同源性達到99%。因此，菌株CY-1被鑒定為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）；菌株CY-2被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株SY-3被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。同時對三株菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。

圖1 基于16S rDNA基因序列篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of screened strains based on 16S rDNA gene sequence

2.2 篩選菌株產(chǎn)酯化酶活力測定結果

篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵的粗酶液酯化酶活力測定結果見圖2。

圖2 篩選菌株單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力測定結果Fig.2 Determination results of esterification enzyme activity of single and synergistic fermentation of screened strains

由圖2可知，單菌中酵母菌JM-4的酯化酶活力最大，為36.44 U/mL，而篩選得到的3株酯化菌粗酶液中菌株CY-1的酯化酶活力最大，為35.44 U/mL，菌株SY-3和CY-2的粗酶液中酯化酶活力稍低于CY-1，分別為32.78 U/mL和31.22 U/mL，酯化酶活力結果與透明圈結果相一致，說明實驗結果可靠。此外，混菌協(xié)同發(fā)酵的酯化酶活力為42.89 U/mL，明顯高于單菌發(fā)酵。

2.3 混菌協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 接種量對酯化酶活力的影響

由圖3可知，酯化酶活力隨混菌接種量的增加呈先上升后下降的趨勢。當接種量為1%～5%時，酯化酶活力隨之增高；當接種量為5%時，混菌協(xié)同發(fā)酵液的酯化酶活力達到最大，為44.22 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當接種量＞5%之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適的接種量為5%。

圖3 不同混菌接種量對酯化酶活力的影響Fig.3 Effect of different mixed strains inoculum on esterification enzyme activity

2.3.2 初始pH值對酯化酶活力的影響

由圖4可知，酯化酶活力隨初始pH值的增加呈先上升后下降的趨勢。當初始pH值為3～5時，酯化酶活力隨之增高；當初始pH值為5時，混菌協(xié)同發(fā)酵液的酯化酶活力達到最大，為50.78 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當初始pH值＞5之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適的初始pH值為5。

圖4 不同初始pH值對酯化酶活力的影響Fig.4 Effect of different initial pH value on esterification enzyme activity

2.3.3 發(fā)酵時間對酯化酶活力的影響

由圖5可知，酯化酶活力隨發(fā)酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢。當發(fā)酵時間為24～48 h時，酯化酶活力隨之增高；當發(fā)酵時間為48 h時，混菌發(fā)酵液的酯化酶活力達到最大，為52.11 U/mL，并且顯著高于其他水平（P＜0.05）；當發(fā)酵時間＞48 h之后，酯化酶活力有所下降。因此，確定最適發(fā)酵時間為48 h。

圖5 不同發(fā)酵時間對酯化酶活力的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on esterification enzyme activity

2.4 混菌協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以接種量（A），初始pH值（B）及發(fā)酵時間（C）為考察因素，酯化酶活力為考察指標，通過3因素3水平L9（33）正交設計進行協(xié)同發(fā)酵條件正交試驗，正交試驗結果與分析見表3，方差分析結果見表4。

表3 協(xié)同發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions optimization of synergistic fermentation

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，對混菌協(xié)同發(fā)酵粗酶液酯化酶活力影響最大的因素是初始pH值，其次是發(fā)酵時間和接種量。通過極差分析得到最優(yōu)協(xié)同發(fā)酵組合為A3B1C2，即接種量6%、初始pH值為4.5、發(fā)酵時間48 h。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，酯化酶活力為52.67 U/mL。

由表4方差分析結果可知，影響混菌協(xié)同發(fā)酵液酯化酶活力因素順序為初始pH（B）＞發(fā)酵時間（C）＞接種量（A），與極差分析結果一致。此外，3個因素對酯化酶活力均具有顯著影響（P＜0.05）。

2.5 揮發(fā)性化合物測定結果

采用HS-SPME-GC-MS技術對菌株CY-1、CY-2、SY-3、JM-4單菌發(fā)酵和混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性化合物進行測定，結果見表5。由表5可知，所有樣品共檢出37種揮發(fā)性化合物，菌株CY-1、CY-2、SY-3和JM-4單菌發(fā)酵粗酶液中分別共檢出11種、10種、9種和17種揮發(fā)性化合物，混菌協(xié)同發(fā)酵最優(yōu)條件下粗酶液中共檢出17種揮發(fā)性化合物。結果表明，混菌協(xié)同發(fā)酵揮發(fā)性化合物含量有所提升，在酸類物質中尤為明顯，同時生成單菌發(fā)酵不具備的對白酒起助香作用的化合物，其中己酸乙酯含量最高，并且其是濃香型白酒的主體揮發(fā)性化合物[24]。此外，己酸乙酯和辛酸乙酯的前體物質己酸和辛酸在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)生，說明混菌協(xié)同發(fā)酵能夠促進己酸和辛酸的生成?；炀鷧f(xié)同發(fā)酵同樣能夠提升2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮的含量，有研究表明這兩種化合物在白酒中能夠發(fā)揮促進產(chǎn)生濃厚、優(yōu)良風味的作用[25-27]。

表5 單菌發(fā)酵及混菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性化合物測定結果Table 5 Determination results of volatile compounds fermentation products by single strain fermentation and mixed strains synergistic fermentation

3 結論

本試驗從窖泥中篩選到3株具有產(chǎn)酯化酶能力的細菌，經(jīng)形態(tài)學觀察及分子生物學鑒定，菌株CY-1被鑒定為阿氏芽孢桿菌（Priestia aryabhattai）；菌株CY-2被鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株SY-3被鑒定為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。將這3株篩選菌株與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）JM-4進行等比例混菌協(xié)同發(fā)酵，以酯化酶活力為評價指標，通過單因素及正交試驗確定最優(yōu)協(xié)同發(fā)酵條件為接種量6%、初始pH值為4.5、發(fā)酵時間48 h。在此優(yōu)化條件下，混菌協(xié)同發(fā)酵液酯化酶活力為52.67 U/mL，相較于優(yōu)化前提升了22.80%。此外，混菌協(xié)同發(fā)酵后揮發(fā)性化合物含量明顯增加，說明協(xié)同發(fā)酵對風味物質的形成具有積極作用。