張 帥,江海洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100193)

沙門菌是自然界中普遍存在的一種食源性致病菌,是重要的人獸共患病原菌之一[1]。因飲食習(xí)慣等因素,西方人感染的食源性致病菌中以沙門菌最為常見,其中50%～75%的媒介是加工不完全的肉、蛋等動(dòng)物源性食品產(chǎn)品[2]。沙門菌血清型眾多,Chen等[3]的報(bào)道顯示,與人類、動(dòng)物、鳥類、嚙齒動(dòng)物和爬行動(dòng)物相關(guān)的沙門菌的血清型已經(jīng)超過2 500種。明確常見的禽沙門菌血清型對于檢測來說至關(guān)重要。禽源食品中報(bào)道較為頻繁的沙門菌血清型有鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌,近期報(bào)道的還有海德堡沙門菌、肯塔基沙門菌、嬰兒沙門菌和印第安納沙門菌[4]。

據(jù)測算,我國每年因食用雞肉導(dǎo)致的沙門菌食物中毒的發(fā)病人數(shù)達(dá)300多萬人次,其中近半數(shù)與生雞肉的交叉污染有關(guān);我國居民廚房案板生熟分開的比例低(不足三成),未生熟分開的居民僅有半數(shù)用消毒劑清洗案板;用消毒劑清洗案板,發(fā)病人數(shù)可降低120萬人次[5]。同樣,使用清洗劑和消毒劑可以降低蛋殼表面細(xì)菌污染水平,但是消毒劑會(huì)造成另外的食品安全問題,或者使生產(chǎn)成本增加[6]。目前,我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,肉制品和即食用蛋制品中不允許檢出沙門菌[7]。沙門菌檢測方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”是傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法,檢測步驟為預(yù)增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清型鑒定5個(gè)步驟,此法是所有檢測方法所得結(jié)果是否準(zhǔn)確的參照,但從采樣到出結(jié)果需要36 h甚至更長時(shí)間,不能滿足食品安全快速檢測的需求[8,9]。

要達(dá)到防止污染擴(kuò)大化的目的,需要進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測,及時(shí)確定被沙門菌污染的食品和批次并采取相關(guān)措施。本文就近年來新發(fā)展的適用于現(xiàn)場檢測禽源食品中沙門菌的方法和技術(shù)進(jìn)行綜述,并探討食源性致病菌動(dòng)態(tài)監(jiān)測體系的建設(shè)和發(fā)展。

1 禽源食品感染沙門菌現(xiàn)狀

近年來,沙門菌引起的人類群體感染事件依舊頻發(fā)。在美國,僅2021年就發(fā)生多起沙門菌感染事件,其中因冷凍裹雞粉中存在腸炎沙門菌,導(dǎo)致36人感染,11人住院;因使用被沙門菌污染的火雞粉導(dǎo)致33人感染,4人住院[10]。2015年以來,我國每年因沙門菌導(dǎo)致的食物中毒發(fā)病人數(shù)約達(dá)300萬人次,其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)[11]。

相對于其他食物種類,家禽導(dǎo)致的沙門菌感染病例約占19.0%,雞蛋約占14.8%[12]。因?yàn)轱曫B(yǎng)成本低且可以供食新鮮的蛋和肉,散養(yǎng)家禽普遍存在,其帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)不能忽視。沙門菌可通過多種媒介污染家禽,包括嚙齒動(dòng)物、貓和昆蟲以及受污染的垃圾[13,14],散養(yǎng)雞因缺乏管理,會(huì)接觸到這些媒介,處理不當(dāng)就會(huì)感染人類。除了養(yǎng)殖源頭,在家禽屠宰和運(yùn)輸過程中,沙門菌也會(huì)感染肉和蛋。

2 可用于現(xiàn)場檢測禽源食品中沙門菌的方法

2.1 基于分子生物學(xué)的快速檢測 以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR),通過對不同血清型沙門菌的DNA保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳,可根據(jù)電泳條帶進(jìn)行結(jié)果判定。在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展形成了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),其不僅具備PCR技術(shù)的高靈敏度和高特異性,而且反應(yīng)條件溫和,可以相對減少沙門菌增菌培養(yǎng)時(shí)間,更易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

Priya等[15]研究了一種基于LAMP的產(chǎn)物顯色測定法,可以用于目視檢測沙門菌擴(kuò)增產(chǎn)物,在沒有任何富集的情況下檢測限為 0.9 CFU/g。Hu等[16]開發(fā)了一種針對腸炎沙門菌特異性基因的擴(kuò)增檢測方法,使用 Genie Ⅲ小型儀器約35 min即可獲得擴(kuò)增曲線和結(jié)果。Zhang等[17]研究了通用接頭PCR觸發(fā)的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng),建立了一種靈敏度高且可視化的鼠傷寒沙門菌檢測方法,恒溫?cái)U(kuò)增后直接顯色,肉眼即可判定結(jié)果,無需電泳,節(jié)省時(shí)間。因分子生物學(xué)檢測方法靈敏度高,若能結(jié)合有效的DNA提取方法,即可進(jìn)行現(xiàn)場檢測。Antonia等[18]建立了一種簡化的 DNA 分離方法,適用于在現(xiàn)場快速提取細(xì)菌DNA,可與上述方法結(jié)合使用,實(shí)現(xiàn)沙門菌的現(xiàn)場檢測。

2.2 基于免疫學(xué)的快速檢測 在食源性微生物的檢測中,通過抗原和抗體特異性結(jié)合的快速檢測方法被廣泛研究和應(yīng)用,主要的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和側(cè)流免疫層析(Lateral flow immunoassay,LFIA),因其操作簡單、不使用復(fù)雜儀器的特點(diǎn),更適用于快速檢測。但是,傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測方法對食源性致病菌的靈敏度低,為了保持良好的特異性和穩(wěn)定性,需要不斷提高和優(yōu)化抗體的質(zhì)量和試驗(yàn)溶液體系。近年來,也有很多在此基礎(chǔ)上對沙門菌進(jìn)行快速檢測的研究,主要目的是提高檢測的靈敏度。

Gao等[19]應(yīng)用脲酶的誘導(dǎo)作用形成銀殼沉積在金納米粒子表面,以改進(jìn)ELISA的比色速率,快速靈敏地檢測沙門菌,檢測限達(dá)到1.21×102CFU/mL。Wu等[20]制備了鼠傷寒沙門菌單克隆抗體1B4,以此為基礎(chǔ)開發(fā)的膠體金免疫層析試紙條對鼠傷寒沙門菌檢測的視覺靈敏度達(dá)4×105CFU/mL。Ren等[21]研發(fā)了一種可用于現(xiàn)場快速檢測腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的測流層析方法,其中鹽誘導(dǎo)聚集的金納米粒子作為信號(hào)探針用于信號(hào)放大,以改善T線的敏感性和特異性,可在 14 min內(nèi)完成檢測,其視覺靈敏度為1×103CFU/mL。

2.3 基于生物傳感器的快速檢測 近年來,生物傳感器被廣泛應(yīng)用于快速檢測食源性致病菌。生物傳感器是將生物信號(hào)和物理或化學(xué)換能器結(jié)合并轉(zhuǎn)化為可以監(jiān)測信號(hào)的一類裝置,其靈敏度高,體積小。對于沙門菌的檢測主要是以抗原抗體或核酸適配體的特異性識(shí)別為基礎(chǔ),將生物信號(hào)放大并轉(zhuǎn)化為光、電信號(hào),通過建立信號(hào)強(qiáng)度與沙門菌濃度之間的關(guān)系判斷檢測結(jié)果,達(dá)到檢測的目的[22]。

Jiang等[23]開發(fā)了一種帶有自驅(qū)動(dòng)聚對苯二甲酸乙二醇酯芯片的便攜式印跡電化學(xué)傳感器,用于快速檢測沙門菌,帶有虹吸管入口的芯片與反應(yīng)室連接,經(jīng)過創(chuàng)新設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)自驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣和檢測,檢測限為100 CFU/mL,可在 20 min內(nèi)檢測出沙門菌,可應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)測食品加工過程和食品流通過程中的沙門菌污染。Qi等[24]開發(fā)了一種微流體生物傳感器,將混合、分離、標(biāo)記和檢測集成到單個(gè)微流控芯片上,使用具有酶活性的金屬有機(jī)框架和樹莓派(Raspberry Pi,RPi)來放大并分析生物信號(hào),檢測雞肉中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為 14 CFU/mL,這種生物傳感器有自動(dòng)化程度高、反應(yīng)速度快、所用試劑少和體積小等優(yōu)點(diǎn),有望用于食源性細(xì)菌的現(xiàn)場檢測。Yin等[25]的研究將沙門菌特異性invA基因在規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)-核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas12a,CRISPR-Cas12a)系統(tǒng)作用下形成脫氧核酶,可以在氯化血紅素存在下催化四甲基聯(lián)苯胺氧(Trimethylbenzene,TMB)反應(yīng),產(chǎn)物在 454 nm 處的吸光度增加而發(fā)生顏色變化,該生物傳感器結(jié)合智能手機(jī)比色測定,可對沙門菌進(jìn)行超靈敏檢測,檢測限為1 CFU/mL,是用于病原菌即時(shí)檢測的新設(shè)計(jì)。

3 總結(jié)與展望

對于禽源食品中沙門菌的檢測,在注重快速的同時(shí),還要強(qiáng)調(diào)現(xiàn)場檢測技術(shù)。無論是養(yǎng)殖場還是商場超市,只要能現(xiàn)場取樣進(jìn)行快速檢測并出具結(jié)果,就可以在感染早期控制擴(kuò)散,降低損失。而且,現(xiàn)場檢測可以最大限度保持樣本的原始性,可以從食品源頭控制沙門菌污染,減小運(yùn)輸過程中帶來的不可控感染,使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

極少量的食源性致病菌經(jīng)過繁殖后才會(huì)引起相關(guān)疾病,為快速準(zhǔn)確地檢測活菌,檢測前的增菌是必要的,其也是整個(gè)檢測過程中最耗時(shí)的一步?，F(xiàn)場檢測時(shí),沙門菌存在于復(fù)雜的基質(zhì)中,增菌后將其從蛋白質(zhì)、脂肪和非目標(biāo)菌中準(zhǔn)確的甄別和捕獲頗有難度。高效率的富集和捕獲樣品前處理方法可以縮短增菌時(shí)間。若沒有樣本前處理方法可以有效解決增菌或者富集問題,下游的檢測技術(shù)將無法更好地發(fā)揮作用。Wang 等[26]研究發(fā)現(xiàn),碳點(diǎn)-適配體復(fù)合物可作為一種新型熒光探針,用于定量檢測雞蛋樣品和自來水樣品中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為50 CFU/mL,無需任何樣品富集過程,適用于現(xiàn)場檢測。Du[27]等開發(fā)了一種基于原位富集培養(yǎng)的有效預(yù)處理方法,大大減少了增菌時(shí)間,結(jié)合液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速檢測痕量沙門菌,可檢測出低至 10-1CFU/mL 水平的沙門菌,用8 h完成包括前處理在內(nèi)的整個(gè)檢測過程。

Aliakbar Ahovan等[28]總結(jié)了微生物檢測的理想化狀態(tài),即需要較短的分析時(shí)間(最好小于1 h),最少的操作技能,較高的穩(wěn)定性,可檢測單個(gè)細(xì)菌,可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,沒有非特異性,不需要任何富集過程,若應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境檢測,還需控制檢測成本。目前,我國對于禽肉原料中沙門菌的限量沒有明確規(guī)定,但是,禽肉在禽養(yǎng)殖場、運(yùn)輸、加工、儲(chǔ)存和售賣等環(huán)節(jié)都有被沙門菌污染的風(fēng)險(xiǎn),而且這些過程相當(dāng)復(fù)雜,需要在每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場檢測和監(jiān)控,以防控代替治療,大大降低養(yǎng)殖成本并減小損失。目前來看,需要整合各方面的研究成果,獲得更高效的樣品前處理方法,結(jié)合具有良好性能的生物傳感器,形成靈敏且智能的檢測終端,結(jié)合大數(shù)據(jù)的分析系統(tǒng)和預(yù)警系統(tǒng)形成智能化檢測體系,從養(yǎng)殖源頭到餐桌全鏈條的每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,對沙門菌在禽源食品中的污染進(jìn)行有效的防控。