張濟(jì)培，韋慶蘭，譚華龍，陳建紅

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

禽大腸桿菌病是由大腸埃希菌的某些致病性菌株或某些致病血清型引起的一種非接觸性傳染病。表現(xiàn)為大腸桿菌性敗血癥、腸炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、肝周炎、眼炎和大腸桿菌性肉芽腫等多種癥狀。防治大腸桿菌病的主要措施是應(yīng)用疫苗及抗生素。制備疫苗的最大困難是大腸桿菌血清型眾多，僅國(guó)內(nèi)報(bào)道就有80余種，并且不同動(dòng)物及不同地區(qū)流行的主要血清型不完全一樣。O抗原又稱菌體抗原，是大腸桿菌重要的抗原，調(diào)查本地區(qū)水禽源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)O血清型對(duì)制備疫苗有著重要的意義。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)廣東不同地區(qū)水禽源大腸桿菌鑒定O血清型，獲得了本地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型,為水禽源大腸桿菌病的防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 251株水禽源大腸桿菌分離自廣東不同地區(qū)臨床發(fā)病水禽，肇慶地區(qū)采集121株，佛山地區(qū)采集44株，廣州地區(qū)采集22株，江門地區(qū)采集44株，清遠(yuǎn)地區(qū)采集20株。其中從以卵黃性腹膜炎為主要發(fā)病特征的水禽上分離到169株大腸桿菌，從以肝周炎為主要發(fā)病特征的水禽上分離到82株大腸桿菌，全部菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 血清及主要材料 23種常見的大腸桿菌O抗原單價(jià)血清（O1、O2、O3、O6、O20、O33、O36、O43、O45、O53、O65、O71、O73、O74、O78、O86、O88、O93、O103、O106、O107、O143和O145）為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。96孔U型板為廣州健陽(yáng)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 血清型鑒定 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的微量凝集法[1]和中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所推薦的玻片凝集法進(jìn)行大腸桿菌血清型鑒定。

（1）抗原的制備：從麥康凱培養(yǎng)基上挑取磚紅色單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24 h，將LB液體培養(yǎng)基涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)24 h后，用0.5%石炭酸生理鹽水洗下營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)物，121℃高壓2 h，制成菌體抗原。再以4000 r/min離心15 min，并用0.5%石炭酸生理鹽水洗滌離心2次，用0.5%石炭酸生理鹽水重懸沉淀物，并進(jìn)行比濁，以確定菌體抗原的濃度。

（2）微量凝集法：將大腸埃希菌單因子血清溶解于5 mL 0.5%石炭酸生理鹽水中，取3 mL血清作10倍稀釋，標(biāo)記待用。取96孔U型板從每行第2孔開始加50μL 0.5%石炭酸生理鹽水至第8孔。然后向第1孔和第2孔分別加入50μL 10倍稀釋血清，從第2孔中吸取50μL加入第3孔，依次進(jìn)行倍比稀釋，稀釋到第7孔后，棄掉50μL，每行加入不同血清。除了每行第7孔外，都加入制備好的菌體抗原。用保鮮膜將96孔U型板密封，37℃孵育1.5 h～2 h后，觀察并記錄結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：在黑色背景下，以是否有片狀凝集，同時(shí)以上清液清澈為凝集反應(yīng)完全標(biāo)準(zhǔn)。

（3）玻板凝集反應(yīng)：通過(guò)微量凝集法鑒定，可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)抗原有幾個(gè)與之反應(yīng)的血清，此時(shí)就需要將菌體抗原和疑似未稀釋血清各取10μL在潔凈的玻板上混勻，同時(shí)以菌體抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，反應(yīng)組半分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集，而對(duì)照組無(wú)凝集者，則判斷為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 血清型地區(qū)分布比較 251株水禽源大腸桿菌中，有244株已確定血清型，占分離株的97.2%，而7株未能定型，占分離株的2.8%。優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O20、O65、O78和O86，占分離株的54.7%（見表1）。其中O78血清型菌株有35株，占分離株的13.9%。肇慶地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O20、O65、O78和O86，占肇慶分離株的44.7%；佛山地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O65和O78，占佛山分離株的54.5%；廣州地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O78，占廣州分離株的40.9%；江門地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O2和O86，占江門分離株的45.4%；清遠(yuǎn)地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O86，占清遠(yuǎn)分離株的30.0%。

2.2 發(fā)病特征不同大腸桿菌血清型分布比較251株水禽源大腸桿菌中，97%（164/169）的以卵黃性腹膜炎為發(fā)病特征的菌株確定了血清型，97.5%（80/82）的以肝周炎為發(fā)病特征的菌株也確定了血清型（見表1）。以卵黃性腹膜炎為發(fā)病特征的菌株優(yōu)勢(shì)血清型為 O2、O20、O65、O78和 O86，占以卵黃性腹膜炎為發(fā)病特征的菌株的45.6%。以肝周炎為發(fā)病特征的菌株優(yōu)勢(shì)血清型為 O2、O65、O78和O86，占以肝周炎為發(fā)病特征的菌株的68.3%。

表1 251株廣東地區(qū)水禽源大腸桿菌血清型分布情況

3 小結(jié)與討論

用23種常見的大腸埃希菌O因子血清鑒定251株水禽源大腸桿菌。結(jié)果表明，97.2%（244/251）的分離株已確定血清型，尚有2.8%（7/251）的分離株未能定型。優(yōu)勢(shì)血清型為 O2、O20、O65、O78和 O86，占分離株的54.7%。其中O78血清型菌株有35株，占分離株的比率最高，鑒定率為13.9%，O86、O65、O2和O20次之。肇慶地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O20、O65、O78和O86；佛山地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O65和O78；廣州地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O78；江門地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O2和O86；清遠(yuǎn)地區(qū)優(yōu)勢(shì)血清型為O86，表明同一省內(nèi)不同地區(qū)的水禽源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型不盡相同。

王傳禹[2]等報(bào)道，云南地區(qū)鴨源致病性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78和O132；黎杰虹[3]等報(bào)道，佛山禽源大腸桿菌以O(shè)78血清型為主；于學(xué)輝[4]等報(bào)道，四川、重慶和云南地區(qū)的鴨源致病性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O93、O78、O92和 O76；李玉文[5]等報(bào)道，遼寧省禽大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78和O109；劉遠(yuǎn)飛[6]等報(bào)道，遼寧省禽大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O1、O8和O143。由此說(shuō)明O78不僅是雞源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型，而且是水禽源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型，O78血清型禽大腸桿菌流行范圍廣泛。王秀梅[7]等報(bào)道，廣東地區(qū)豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O8和O64；姜衛(wèi)東[8]等報(bào)道，廣東省仔豬腹瀉大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O119、O60、O75和 O141、O20、O8和 O101；王文豪[9]等報(bào)道，華南地區(qū)致病大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O107、O101、O9、O60和 O26；文英[10]報(bào)道，西寧市寵物源致病性大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型為O157、O64、O10、O119、O24、O137、O147和O149。以上數(shù)據(jù)表明，不同地區(qū)、不同動(dòng)物來(lái)源的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型差異明顯；相同地區(qū)、不同動(dòng)物來(lái)源的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型也有明顯差異；不同地區(qū)、相同動(dòng)物來(lái)源的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，但也存在相同的血清型。說(shuō)明我國(guó)大腸桿菌血清型種類眾多、分布廣泛，其分布可能與動(dòng)物種類有關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，血清型與臨床發(fā)病型有直接關(guān)系，認(rèn)為敗血癥常為O2、O78、O1和O50血清型所致；肉芽腫常為O4、O8、O9和O6；出血性腸炎常為O111、O5和O88；關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、輸卵管炎常為O2；眼炎常為O88、O18等。本試驗(yàn)以卵黃性腹膜炎為發(fā)病特征的菌株優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O20、O65、O78和 O86；以肝周炎為發(fā)病特征的菌株優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O65、O78和O86。說(shuō)明O2、O65、O78和O86血清型大腸桿菌可能是臨床發(fā)生卵黃性腹膜炎癥和肝周炎癥的重要原因。引起臨床發(fā)生腹膜炎的大腸桿菌血清型不再是單一的以O(shè)2為主，現(xiàn)在是多個(gè)血清型都能引起腹膜炎，臨床大腸桿菌血清型呈現(xiàn)越來(lái)越復(fù)雜的趨勢(shì)。

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