田萬年,李 奇,寧宇春,杜秋明,鄭秀紅

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,吉林 吉林 132101 ; 2. 延邊州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,吉林 延吉 133000 ; 3. 龍井市德新鄉(xiāng)綜合服務(wù)中心,吉林 龍井 133400)

羊泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的原蟲寄生于羊的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞所引起的一種血液原蟲病[1]。本病對(duì)羔羊和外地引進(jìn)羊危害嚴(yán)重,病羊感染后臨床癥狀多表現(xiàn)為消瘦、貧血、黃疸和血紅蛋白尿,本地羊多表現(xiàn)為帶蟲免疫[2]。我國(guó)已報(bào)道的可感染羊的泰勒蟲主要有呂氏泰勒蟲(Theilerialuwenshuin)、尤氏泰勒蟲(Theileriauilenbergi)和綿羊泰勒蟲(Theileriaovis)[3]。呂氏泰勒蟲病病原檢測(cè)主要依靠血液涂片鏡檢,由于隱性感染羊的血液染蟲率較低,血液涂片檢測(cè)易漏診或誤診,PCR檢測(cè)方法具有更高的特異性和敏感性,對(duì)病原體的診斷更加可靠、準(zhǔn)確。

目前,用于呂氏泰勒蟲病PCR檢測(cè)的靶基因有核糖體小亞基RNA(Small subunit ribosome RNA,18S rRNA)基因、主要表面蛋白(Major piroplasm surface protein,MPSP)基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)基因和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶1(Cytochrome C oxidase subunit 1,Cox1)基因[4-8]。本試驗(yàn)選取以上4種靶基因?qū)问咸├障x進(jìn)行PCR檢測(cè),對(duì)比不同靶基因PCR檢測(cè)方法的特異性和敏感性,通過對(duì)45份臨床綿羊血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),篩選出呂氏泰勒蟲最佳PCR檢測(cè)方法用于該病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 綿羊血液樣本于2019年6月采自吉林省圖們市散養(yǎng)綿羊,共45份,同時(shí)制作血液涂片,吉姆薩染色鏡檢。呂氏泰勒蟲陽性DNA由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存[9]。中華泰勒蟲DNA、附紅細(xì)胞體DNA和卵形巴貝斯蟲DNA由延邊大學(xué)薛書江博士惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DL2 000 DNA Marker,均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;TaqPreMix,購自于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 主要儀器 高速低溫離心機(jī)(5810R),德國(guó)艾本德公司;PCR儀(9700),美國(guó)ABI公司;瓊脂糖水平電泳槽(DYCP-31C)和凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413B),均購自北京六一生物科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-8]合成呂氏泰勒蟲18S rRNA、MPSP、ITS和cox1基因引物,篩選出檢測(cè)呂氏泰勒蟲的最佳靶基因。根據(jù)GenBank上呂氏泰勒蟲18S rRNA序列(登錄號(hào):AY262119)設(shè)計(jì)5對(duì)引物(表1),篩選擴(kuò)增18S rRNA基因的最佳引物。所有引物均由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.5 血液DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒提取羊血液樣本基因組DNA,取5 μL提取的基因組DNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄。

1.6 PCR擴(kuò)增 基于18S rRNA、MPSP、ITS和cox1基因的PCR反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 9 μL,TaqPreMix 12.5 μL,基因組DNA 2.5 μL,上、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s,56～60 ℃ 退火45 s,72 ℃延伸30 s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。不同靶基因陽性PCR產(chǎn)物分別膠回收后,連接到pMD-19T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定,鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往吉林省庫美生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 特異性試驗(yàn) 以呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、卵形巴貝斯蟲和附紅細(xì)胞體DNA為模板,分別應(yīng)用4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析不同靶基因PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 分別對(duì)呂氏泰勒蟲4種靶基因重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行濃度測(cè)定,換算成拷貝濃度,將4種質(zhì)粒DNA按10倍倍比稀釋。分別進(jìn)行4種靶基因的PCR擴(kuò)增,對(duì)比不同靶基因PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.9 18S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物篩選 經(jīng)鑒定18S rRNA基因?yàn)閰问咸├障xPCR檢測(cè)最佳靶基因,對(duì)18S rRNA基因PCR擴(kuò)增最佳引物的特異性和敏感性進(jìn)行檢測(cè),篩選最佳引物。

1.10 臨床樣本檢測(cè) 應(yīng)用不同靶基因的4對(duì)引物,對(duì)45份綿羊血液樣本進(jìn)行PCR檢測(cè),比較4種靶基因PCR檢測(cè)方法的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 血液涂片鏡檢 羊血液涂片經(jīng)吉姆薩染色鏡檢,可見紅細(xì)胞內(nèi)有梨籽形、圓點(diǎn)形蟲體,初步鑒定為羊泰勒蟲(圖1)。

圖1 血液涂片吉姆薩染色鏡檢(1 000×)Fig.1 Giemsa staining microscopic examination of blood smears (1 000×)A:羊泰勒蟲; B:紅細(xì)胞A:Ovine Theileria; B:Red blood cell

2.2 血液DNA提取 提取的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶較清晰,可用于下一步試驗(yàn)(圖2)。

圖2 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 Agarose gel electrophoresis detection of genomic DNAM:DL2 000 DNA Marker; 1～4:血液樣本編號(hào)M:DL2 000 DNA Marker; 1-4:Blood sample numbers

2.3 特異性試驗(yàn) 以4種寄生蟲陽性DNA為模板,分別用呂氏泰勒蟲4種靶基因的PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示,4種靶基因引物均只可擴(kuò)增出呂氏泰勒蟲DNA,擴(kuò)增不出卵形巴貝斯蟲、中華泰勒蟲和附紅細(xì)胞體DNA,具有較好的特異性。

圖3 不同靶基因的4種PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of four PCR detection methods based on different target genesA:18S rRNA基因; B:MPSP基因; C:ITS基因; D:cox1基因(M:DL2 000 DNA Marker; 1:呂氏泰勒蟲; 2:附紅細(xì)胞體; 3:中華泰勒蟲; 4:卵形巴貝斯蟲)A:18S rRNA gene; B:MPSP gene; C:ITS gene; D:cox1 gene(M:DL2 000 DNA Marker; 1:Theileria luwenshuin; 2:Mycoplasma suis; 3:Theileria sinensis; 4:Babesia ovata)

2.4 敏感性試驗(yàn) 以18S rRNA、MPSP、ITS和cox1為靶基因的重組質(zhì)粒DNA濃度分別為41.17、14.74、1.36和0.69 ng/μL。調(diào)整重組質(zhì)粒DNA濃度并10倍倍比稀釋,使4種靶基因重組質(zhì)粒濃度均為9.82×102～9.82×109copies/μL。以相同拷貝數(shù)的不同靶基因的質(zhì)粒DNA為模板,分別進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,以cox1為靶基因最低檢測(cè)量為9.82×105copies/μL,敏感性最低;以18S rRNA為靶基因最低檢測(cè)量為9.82×103copies/μL,敏感性最高。

圖4 不同靶基因的4種PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensibility test of four PCR detection methods based on different target genesA:18S rRNA基因; B:MPSP基因; C:ITS基因; D:cox1基因(M:DL2 000 DNA Marker; 1～8:分別為9.82×109～9.82×102 copies/μL)A:18S rRNA gene; B:MPSP gene; C:ITS gene; D:cox1 gene(M:DL2 000 DNA Marker; 1-8:9.82×109-9.82×102 copies/μL,respectively)

2.5 18S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物篩選 以呂氏泰勒蟲陽性DNA為模板,將相同濃度的DNA分別用已設(shè)計(jì)的5對(duì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖5所示,以引物P3和P1特異性好,無雜帶,擴(kuò)增效果較好;引物P1、P2和P4出現(xiàn)雜帶,PCR擴(kuò)增效果不理想。

2.6 18S rRNA基因PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn) 分別以呂氏泰勒蟲、中華泰勒蟲、附紅細(xì)胞體和卵形巴貝斯蟲DNA為模板,用引物P3和P1進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖6所示,引物P3和P1均只可擴(kuò)增出呂氏泰勒蟲DNA,擴(kuò)增不出卵形巴貝斯蟲、中華泰勒蟲和附紅細(xì)胞體DNA,具有較好的特異性。

2.7 18S rRNA基因PCR擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn) 以呂氏泰勒蟲重組質(zhì)粒DNA為模板,經(jīng)10倍倍比稀釋重組質(zhì)粒濃度為9.82×10～9.82×109copies/μL。用引物P1和P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖7所示,引物P3最低檢測(cè)含量為9.82×102copies/μL;引物P1最低檢測(cè)含量為9.82×103copies/μL,引物P3敏感性是引物P1的10倍。

2.8 臨床樣本檢測(cè) 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果如表2所示,以18S rRNA為靶基因,引物P3的PCR檢測(cè)方法的陽性率最高,陽性率為33.33%(15/45);以cox1為靶基因的PCR檢測(cè)方法的陽性率最低,陽性率為22.22%(10/45);以MPSP和ITS為靶基因的PCR檢測(cè)方法的陽性率均為26.67%(12/45)。

表2 臨床樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR detection results of clinical samples

3 討論

在目前已建立的呂氏泰勒蟲檢測(cè)方法中,PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可對(duì)呂氏泰勒蟲病進(jìn)行早期診斷,更適合臨床檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),PCR方法選擇的靶基因不同,其敏感性和特異性存在較大差異[10-12]。本試驗(yàn)對(duì)以18S rRNA、MPSP、ITS和cox1為靶基因的4種呂氏泰勒蟲PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了特異性、敏感性和臨床樣本檢測(cè)對(duì)比,結(jié)果顯示,以18S rRNA為靶基因的PCR方法敏感性最高,比以MPSP為靶基因的PCR方法敏感10倍,比以cox1和ITS為靶基因的PCR方法敏感100倍。分析原因可能是18S rRNA為線粒體DNA,在生物體內(nèi)含量高于其他基因含量。MPSP是梨形蟲表面膜蛋白,是泰勒蟲感染紅細(xì)胞階段蟲體分泌的一種膜內(nèi)蛋白,在其他階段該蛋白含量較低,因此,其基因檢測(cè)的敏感性低于18S rRNA,與金超等研究結(jié)果相類似[13]。本試驗(yàn)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示,以18S rRNA為靶基因的PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床樣本的陽性檢測(cè)率最高,可能與該基因具有較高的保守性有關(guān)。本試驗(yàn)在篩選檢測(cè)呂氏泰勒蟲PCR方法最佳靶基因的基礎(chǔ)上,對(duì)最佳靶基因18S rRNA的檢測(cè)引物進(jìn)行了篩選,在設(shè)計(jì)引物時(shí)根據(jù)18S rRNA基因特點(diǎn),通過與其他蟲體序列進(jìn)行比對(duì),上、下引物序列選擇在可變區(qū),使其具有較高特異性。18S rRNA基因引物篩選結(jié)果顯示,引物P3在特異性和敏感性方面優(yōu)于其他引物,是檢測(cè)呂氏泰勒蟲的最佳引物。

羊呂氏泰勒蟲病在我國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅省、吉林省等19個(gè)省(直轄市)均有報(bào)道,感染率介于4.1%～80.0%[14-17]。隨著養(yǎng)羊業(yè)的迅速發(fā)展,不同品種羊和羊肉產(chǎn)品的交流日趨頻繁,羊泰勒蟲病的流行區(qū)域正日益擴(kuò)大,已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一,應(yīng)引起動(dòng)物檢疫部門重視,采取措施控制疾病的流行[18,19]。本試驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有的羊呂氏泰勒蟲靶基因序列,應(yīng)用PCR方法進(jìn)行了對(duì)比分析,篩選出18S rRNA基因?yàn)樽罴寻谢?在此基礎(chǔ)上對(duì)18S rRNA基因PCR檢測(cè)引物進(jìn)行篩選優(yōu)化,為羊呂氏泰勒蟲病的臨床診斷提供了特異、敏感的PCR檢測(cè)方法。