賈嬡，黃燕，宋丹靚敏，蘇群超，梁雅琪，李譽(yù)，鄭亞平，楊鑫焱，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

0 引言

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）曾被稱為阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)，是腸桿菌科下多存于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一個(gè)多樣化的屬，該屬由7 個(gè)種組成，分別為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)、丙二酸鹽克羅諾桿菌(C.malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis)、莫金斯克羅諾桿菌 (C.muytjensii)、都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(C.universalis)和康帝蒙提克羅諾桿菌(C.condimenti)[1]，其中3 個(gè)種已從感染的新生兒中分離出來，分別為C.sakazakii、C.malonaticus和C.turicensis[2]。克羅諾桿菌是一種有周身鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、革蘭氏陰性、氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性、兼性厭氧的食源性致病菌，廣泛存在于食品和環(huán)境，尤其是嬰幼兒配方乳粉(powdered infant formula,PIF)及其加工環(huán)境中。目前，感染克羅諾桿菌的大多數(shù)病例來自于攝入受污染PIF 的早產(chǎn)兒和低出生體重兒以及4周齡新生兒[3]，少數(shù)為免疫功能低下的老年人[4]?？肆_諾桿菌感染主要引起壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，致死率可高達(dá)40%～80%，存活者也會出現(xiàn)長期后遺癥，包括神經(jīng)發(fā)育遲緩、腦積水和永久性神經(jīng)損傷和精神殘疾等[5]。近年來，我國每年約有1600萬新生兒出生，其中約85 %使用PIF 喂養(yǎng)[6]，因攝入受污染PIF 引起嬰兒感染問題卻時(shí)有發(fā)生，使PIF 安全問題成為社會熱點(diǎn)問題。2021 年，Yaylor 等[7]報(bào)告了兩名因攝入受阪崎克羅諾桿菌污染的PIF 而患腦膜炎住院的嬰兒，其中一名嬰兒存活后聽力受損。2022 年，4 名嬰兒因攝入奶粉感染阪崎克羅諾桿菌，其中2 名已被證實(shí)死亡[8]。克羅諾桿菌感染事件不僅引起了廣泛關(guān)注，也再次敲響了克羅諾桿菌污染的PIF 對嬰幼兒造成嚴(yán)重生命威脅的警鐘，因此提高對克羅諾桿菌的防控水平是十分必要的。

2020 年，Parra 等[9]從來自荷蘭、墨西哥等4 個(gè)國家的128 個(gè)PIF 樣本中分離得到6 株克羅諾桿菌。2021 年，Gan 等[10]從中國陜西嬰幼兒配方奶粉及工廠環(huán)境采集的617 份樣品中分離出15 株克羅諾桿菌。Gicova[11]、Zhang[12]和Brandao 等[13]分別從嬰兒配方奶粉、奶粉工廠及巴西零售食品中分離出克羅諾桿菌，分離率分別為92.31 %、73.68 %和82.22 %。除PIF 外克羅諾桿菌還存在其他污染源[14]，一系列食物中曾分離出克羅諾桿菌，如面粉，堅(jiān)果，蔬菜，水果，大米，干肉，調(diào)味品和海鮮[15-17]，大大增加了克羅諾桿菌的感染風(fēng)險(xiǎn)。2018 年，Moravkova 等[18]在一年時(shí)間里收集了175 份蔬菜樣品，并對其進(jìn)行克羅諾桿菌的分離，最終分離率為22.3 %。除食物外克羅諾桿菌在環(huán)境中的分布也很普遍，涉及土壤，水和家居環(huán)境[17,19]。2019 年，Hu 等[20]從來自土壤和水樣的141 份環(huán)境樣品中分離得到22 株克羅諾桿菌，其中包括6 株阪崎克羅諾桿菌。2021 年Costa 等[21]從來自美洲的465 份樣品中分離出232 株克羅諾桿菌，其中102 個(gè)來自環(huán)境樣品，27 株從PIF 中分離出來，1 株來自水樣品?？梢娍肆_諾桿菌在自然界中很普遍，要實(shí)現(xiàn)控制克羅諾桿菌的污染與危害，不僅需要開發(fā)相應(yīng)的檢測技術(shù)以達(dá)到溯源目的，同時(shí)也需要相應(yīng)的分型技術(shù)通過對克羅諾桿菌相似性研究，來確定引起感染的菌株類型、來源與致病能力，因?yàn)椴⒉皇撬械目肆_諾桿菌都具有致病性[22]。因此，了解不同來源菌株的類型對于追蹤污染源和降低危害非常重要，因此本文從分型方法的原理入手，對不同分型方法的分型能力及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行比較與分析，以期為克羅諾桿菌溯源分型方法的選擇提供依據(jù)。

1 分型技術(shù)概括

分型技術(shù)是根據(jù)微生物的生化或基因特征，對不同來源微生物間的種屬關(guān)系進(jìn)行判定的一項(xiàng)技術(shù)。現(xiàn)知的克羅諾桿菌屬的分類很復(fù)雜，因?yàn)槠淦毡榕c腸桿菌科其他成員的遺傳關(guān)系密切。因此，對其進(jìn)行正確的分型一直是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，且克羅諾桿菌不同型別菌種之間具有一定的生物學(xué)差異[23]，所以采用更加可靠的分型方法很重要?？肆_諾桿菌的分型方法可分為表型分型和分子分型兩種，其中應(yīng)用較早的表型分型包括生化分型、蛋白分型和血清分型等，但是克羅諾桿菌屬的分型仍然需要更快速、更具成本效益和更可靠的方法。因此，這些方法目前正被基于DNA 指紋識別的技術(shù)，如脈沖場凝膠電泳（PFGE）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、多位點(diǎn)序列分型（MLST）、多位點(diǎn)VNTR 分析（MLVA）、核糖體分型、全基因組分型等分子分型方法所取代，因?yàn)樗鼈兙哂懈叩目煽啃砸约凹械拈_放存取數(shù)據(jù)庫方法。分型結(jié)果不僅能準(zhǔn)確反映出克羅諾桿菌的形態(tài)特征、蛋白結(jié)構(gòu)、血清型等表型特征，也可以對克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定。近年來隨著分子技術(shù)的進(jìn)步，有多種方法可用于對不同來源的克羅諾桿菌菌株進(jìn)行分型[24]，克羅諾桿菌屬的分型取得了重大進(jìn)展。

2 克羅諾桿菌表型分型技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)血清型分型

血清型分型是最早發(fā)展起來的細(xì)菌分型方法，為細(xì)菌菌株的分類提供了基礎(chǔ)，是流行病學(xué)監(jiān)測的重要工具。傳統(tǒng)血清分型技術(shù)的原理是基于抗體抗原相互作用來確定與革蘭氏陰性病原體相關(guān)的O-抗原之間的差異[25]。O-抗原是克羅諾桿菌外膜的重要組分，O-抗原結(jié)構(gòu)的多樣性為血清分型提供了基礎(chǔ)。

基于PCR 的阪崎克羅諾桿菌O-型血清分型方案首次在2011 年由Sun 等[26]提出，他們將從各國食品中分離出的114 株阪崎克羅諾桿菌分為7 個(gè)血清型。2015 年，Yan 等[27]對此血清分型方法進(jìn)行了擴(kuò)展，通過PCR 限制性片段長度多態(tài)性分析，確定了阪崎克羅諾桿菌O-抗原編碼位點(diǎn)rfb 的核苷酸多態(tài)性，基于對這些DNA 圖譜的分析，在不同來源的62 株阪崎克羅諾桿菌中檢測到12 種獨(dú)特的帶型，并確定了兩種常見的血清型（O:1 和O:2）。2013 年，Jarvis 等[28]采用MboII限制性片段長度多態(tài)性模式和O-抗原基因簇的DNA 序列鑒定了克羅諾桿菌屬的新型血清型（C.turicensisO3，C.muytjensiiO2，C.dublinensisO1，C.dublinensisO2 和C.universalis O1）。2015 年，Blaková 等[29]共檢測不同來源的82 株克羅諾桿菌，通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析確定O-抗原基因簇的核苷酸變異性，結(jié)果將其分為17 個(gè)血清型。2021 年，姜華等[30]對分離自156 份學(xué)校環(huán)境樣品的11 株克羅諾桿菌進(jìn)行血清型分析，結(jié)果得到的5 種不同的血清型中有3種血清型屬于阪崎克羅諾桿菌，目前在克羅諾桿菌中已經(jīng)鑒定出24 種O 血清型。將血清型與數(shù)據(jù)庫菌株構(gòu)成對比存在差異，結(jié)果證明樣品來源不同或各血清型分布不同存在著地區(qū)差異。

血清分型有助于我們正確識別克羅諾桿菌，雖然其操作存在一定繁瑣、耗時(shí)等問題，但O-抗原基因簇的多樣性一定程度上反映其結(jié)構(gòu)的多樣性，對克羅諾桿菌O-抗原基因簇的研究為明確血清學(xué)分類與基因之間的關(guān)系提供了可靠線索。其結(jié)果直觀、準(zhǔn)確，并且對食源性疾病的治療有益，因此目前仍然被廣泛應(yīng)用。

2.2 生化分型

生化方法是較早應(yīng)用于克羅諾桿菌的常規(guī)分型方法，主要是依據(jù)克羅諾桿菌不同的生理生化反應(yīng)來進(jìn)行判定。傳統(tǒng)的生化分型主要通過生理生化反應(yīng)：福格斯-普里斯考爾實(shí)驗(yàn)、甲基紅反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)、乳糖產(chǎn)酸反應(yīng)、D-葡萄糖的產(chǎn)氣反應(yīng)、丙二酸利用等[31]，來確定克羅諾桿菌的生化表型。但目前常用的是比傳統(tǒng)生化鑒定方法更準(zhǔn)確、更快速的API20E、ID32E 兩種生化鑒定系統(tǒng)。API20E 是通過酶促反應(yīng)及代謝產(chǎn)物檢測而研制的被國際公認(rèn)的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng)，也是腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng)[32]。ID32E 鑒定試條由32 個(gè)干燥的培養(yǎng)基測定小管組成，通過液體方式進(jìn)行接種、培養(yǎng)后使用鑒定軟件對結(jié)果進(jìn)行判定。LU 等[33]將分離自PIF 及加工環(huán)境的75 株克羅諾桿菌進(jìn)行API20E 生化分型鑒定，共分為8 種生物型。2008 年，李磊[34]對分離自嬰兒奶粉的23株野生克羅諾桿菌進(jìn)行生化分型，經(jīng)API20E 生化鑒定條將23 株菌分為7 個(gè)生化型。2014 年LU 等[33]利用API20E 生化分型系統(tǒng)將來自不同PIF 加工環(huán)境的75 株克羅諾桿菌分為8 種生化表型。2020 年，Chen等[35]利用API20E 生化系統(tǒng)對從貴州350 個(gè)PIF 樣本分離出的21 株克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果共分為6種生化表型。傳統(tǒng)生化反應(yīng)的方法雖應(yīng)用較早，但其存在耗時(shí)長、操作繁瑣、不易分辨結(jié)果，并且存在一定假陽性等問題，所以并沒有微生物自動(dòng)化檢測系統(tǒng)應(yīng)用廣泛。因API20E、ID32E 等生化鑒定方法能更加快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和鑒定病原體等特點(diǎn)，而越來越多地應(yīng)用于克羅諾桿菌分型領(lǐng)域。

2.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分型

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）已成為一種有效的分析工具，用于高效分型鑒定人類病原微生物的新興技術(shù)[36]，它使用來自完整細(xì)菌細(xì)胞的獨(dú)特蛋白質(zhì)或脂質(zhì)，分析從整個(gè)細(xì)菌中提取的蛋白質(zhì)的譜，類似于使用DNA 指紋的DNA 檢測方法，生成的數(shù)據(jù)具有可重復(fù)性，可用于在屬和種水平上區(qū)分細(xì)菌種類[37]。LU 等[33]將分離自PIF 及加工環(huán)境的75 株克羅諾桿菌進(jìn)MALDI-TOF MS 蛋白分型鑒定，共分為18 個(gè)MAL DITOF MS 型。LU 等[33]利用MALDI-TOF MS 對來自不同PIF 加工環(huán)境的75 株克羅諾桿菌進(jìn)行蛋白分型，可分為36 個(gè)MALDI-TOF MS 型。2019 年，劉銘等[38]利用MALDI-TOF MS 技術(shù)對分離自水、食品和糞便樣品的82 株克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，將其分為5個(gè)群體（MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5），分別與C.sakazakii、C.malonaticus、C.dublinensis、C.turicensis、C.muytjensi 等5 個(gè)種對應(yīng)。2021 年，Sulaiman 等[39]使用MALDI-TOF MS 系統(tǒng)完成對回收自環(huán)境的83 株克羅諾桿菌的鑒定，共鑒定出44 株阪崎克羅諾桿菌并且可信度高達(dá)99.99 %。

MALDI-TOF MS 雖儀器成本相對較高，但上述研究說明MALDI-TOF MS 具有較高的靈敏度，同時(shí)其樣品制備簡單、自動(dòng)化程度高、準(zhǔn)確高速、具有高通量和高效率等優(yōu)點(diǎn)[40]，因此MALDI-TOF MS 分型方法在克羅諾桿菌的分型鑒定中已經(jīng)應(yīng)用廣泛，并取得了非常理想的效果。

3 克羅諾桿菌分子分型技術(shù)

3.1 脈沖場凝膠電泳分型

脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是一種在1984 年開發(fā)的溯源分型方法，該技術(shù)主要是借助限制性核酸內(nèi)切酶對菌株DNA 稀有切點(diǎn)進(jìn)行特異性酶切，產(chǎn)生不同大小的DNA 片段，經(jīng)脈沖場凝膠電泳分離，形成特異性PFGE 圖譜，從而判斷菌株的親緣關(guān)系[41]。因此，它成為微生物污染來源追蹤的早期工具，是細(xì)菌分型中最為傳統(tǒng)并且應(yīng)用廣泛的方法之一，且常用于克羅諾桿菌分型的技術(shù)[42]。PFGE分型常用的限制性核酸內(nèi)切酶有2 種[43]，分別是XbaⅠ一級內(nèi)切酶和Sep Ⅰ二級內(nèi)切酶，2 種內(nèi)切酶可單獨(dú)使用，然而Cui 等[44]在2014 年對幾個(gè)菌株用Xba I消化時(shí)表現(xiàn)出相同的PFGE 模式，但在使用Spe I 時(shí)表現(xiàn)出不同的PFGE 模式。因此，2 種限制性內(nèi)切酶配合使用對克羅諾桿菌進(jìn)行酶切效果更好。

在Cui 等[44]的研究中，105 個(gè)克羅諾桿菌分離株顯示出85 種可區(qū)分的XbaI-SpeIPFGE 模式。PFGE揭示了基因組DNA 高度的遺傳多樣性，使用辛普森的多樣性指數(shù)計(jì)算的判別指數(shù)為0.9940。然而，當(dāng)分離物分別用XbaI 和SpeI 消化時(shí)，可分別分為83 和86 個(gè)PFGE 帶型。因此，使用SpeI 的識別率可能高于使用XbaI 的識別率。2018 年，張博等[43]選用4 種內(nèi)切酶對34 株克羅諾桿菌進(jìn)行PFGE 分型，其中4 種酶可將34 株菌株分為27 個(gè)基因型，而3 種酶結(jié)合使用僅能分為21 個(gè)基因型，可見選用酶種類越多，分型分辨率越高。2020 年，張彩霞等[45]對分離自嬰幼兒配方粉、巧克力等食品中的68 株阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行PFGE分子分型，結(jié)果68 株菌株形成58 個(gè)PFGE 帶型，其中同一帶型的菌株來源較集中，說明受同一來源克羅諾桿菌污染的可能性大。2021 年，蘇秀敏等[46]從工廠采集的1 246 份樣品中分離得到33 株克羅諾桿菌，經(jīng)PFGE 分型分為14 個(gè)PFGE 帶型，并結(jié)合PFGE 結(jié)果明確了員工鞋底、工廠周邊土壤、加工車間、凈化系統(tǒng)進(jìn)風(fēng)口等可能是克羅諾桿菌污染的關(guān)鍵點(diǎn)，達(dá)到溯源目的。2021 年，閆軍等[47]對分離自2 405 份黑龍江PIF企業(yè)加工環(huán)節(jié)樣品的16 株克羅諾桿菌進(jìn)行PFGE 分型，共分為10 個(gè)型別。其中來自同一生產(chǎn)線不同環(huán)節(jié)的分離菌株帶型相同，說明生產(chǎn)過程可能對產(chǎn)品造成污染。2022 年，李毅等[48]對檢自296 份食品香辛料和調(diào)味品中的66 株克羅諾桿菌進(jìn)行PFGE 與MLST 分析。經(jīng)PFGE 分析共分為51 個(gè)帶型，經(jīng)MLST 分析共分為25 個(gè)ST 型。結(jié)果顯示具有相同的MLST 型卻有不同的PFGE 型，顯示出PFGE 比MLST 更強(qiáng)的分辨能力和追蹤溯源分析能力。

多個(gè)研究可以看出PFGE 具有特異性高、可重復(fù)性好、結(jié)果高度可信等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于克羅諾桿菌分型溯源研究。但是PFGE 本身存在一些限制，克羅諾桿菌菌株具有內(nèi)在的DNA 酶活性[49]，不能對所有菌株進(jìn)行分型，不同菌株的PFGE 譜圖可能相同，且該方法仍不能鑒定菌株，不能給出菌株之間的關(guān)系，它不適用于所有克羅諾桿菌株。

3.2 多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分析 (multilocus sequence typing,MLST)是基于DNA 的高度靈敏的分型方法，是一種選用7 個(gè)看家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和ppsA）進(jìn)行序列分析的基因分型方法，在鑒定和聚類的細(xì)菌分離基礎(chǔ)上可以用來分析物種的遺傳多樣性[31]。2015 年，Joseph 等[50]對325 環(huán)境拭子樣本進(jìn)行MLST分型，已鑒定出包括克羅諾桿菌屬的115 種序列類型（ST）。其中，53 個(gè)STs 已被確定為阪崎克羅諾桿菌，與新生兒腦膜炎有關(guān)。2018 年，Guo 等[51]使用MLST 重新分析了2005 年至2006 年間從進(jìn)口PIF 中回收的52 株分離株，這些分離株被確定為阪崎克羅諾桿菌，共有8 個(gè)ST 型，包括致病性ST1、ST4 和ST12。2018年，Peng 等[52]在中國東北地區(qū)800 份飲用水、冷卻新鮮豬肉、PIF、方便面、餅干、水果、蔬菜和準(zhǔn)備好的菜肴中分離出34 株克羅諾桿菌。后經(jīng)MLST 分析，使用根據(jù)看家基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增克羅諾桿菌分離株的DNA 并測序，將34 個(gè)分離株分為15 個(gè)ST 型，其中ST4 最多占比29.4%。Chen 等[35]同樣對從貴州350 個(gè)PIF 樣本分離出的21 株克羅諾桿菌進(jìn)行MLST 分析，結(jié)果共分為11 種ST，其中，ST193 和ST157 是從市售PIF 中分離出的克羅諾桿菌的顯性ST。2021 年，Irshad等[39]利用MLST 數(shù)據(jù)庫分析來自美國12 個(gè)地理位置的785 個(gè)環(huán)境監(jiān)測樣本中回收的83 個(gè)克羅諾桿菌分離株時(shí)，清楚地揭示了12 個(gè)不同的克隆復(fù)合物。并基于克羅諾桿菌MLST 數(shù)據(jù)庫的臨床菌株的比較分析，顯示幾乎50 %菌株為臨床最常見的ST4，而其余菌株被鑒定為ST8。

雖然設(shè)計(jì)一個(gè)用于克羅諾桿菌MLST 方案需要設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測序等大量前期工作，但其對克羅諾桿菌的分析快速，可重復(fù)性強(qiáng)，分辨率較高，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。因此，該方法可以在未來的克羅諾桿菌屬物種研究中發(fā)揮重要作用。因此，MLST 已廣泛應(yīng)用于對PIF 及其生產(chǎn)設(shè)施和臨床克羅諾桿菌分離株的分析。

3.3 CRISPR-Cas 陣列分析

CRISPR-Cas 系統(tǒng)為細(xì)菌提供針對噬菌體和質(zhì)粒的序列特異性、獲得性防御，是細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[53]。CRISPR 位點(diǎn)用于細(xì)菌分型的原理是使用標(biāo)記的引物PCR 擴(kuò)增CRISPR 陣列，這些引物可識別定向重復(fù)序列，然后將PCR 產(chǎn)物使用正向和反向擴(kuò)增引物進(jìn)行測序。CRISPR-Cas 陣列分析是一種非常強(qiáng)大的微生物來源追蹤方法，因?yàn)樗梢詤^(qū)分同一MLST 克隆簇和PFGE 組中的菌株[54]。2017 年，Oodzki等[55]使用CRISPR-Cas 系統(tǒng)對經(jīng)MLST 確定的2 株都柏林克羅諾桿菌ST80 菌株進(jìn)行分析，結(jié)果顯示2株分離株的CRISPR-Cas 型（CT）不同。2018 年，Zeng 等[56]將他們的研究擴(kuò)展到克羅諾桿菌屬，并預(yù)測克羅諾桿菌祖先菌株可能同時(shí)具有I-E 亞型和I-F CRISPR-Cas 系統(tǒng)，但I(xiàn)-F 亞型選擇性退化并被大多數(shù)克羅諾桿菌致病菌丟失，且植物相關(guān)物種都柏林克羅諾桿菌具有更高的CRISPR 活性，進(jìn)一步擴(kuò)展了該方法在克羅諾桿菌分型中的作用。2019 年，Zeng 等[57]利用CRISPR-Cas 對257 株阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌和都柏林克羅諾桿菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示161 株阪崎克羅諾桿菌可分為129 種CT；65 株丙二酸鹽克羅諾桿菌分為42 個(gè)CT 型；31 株都柏林克羅諾桿菌分為31 個(gè)CT 型。2020 年，Zeng 等[58]分別對54 株分離自588 份肉類的克羅諾桿菌進(jìn)行MLST分型以及CRISPR-Cas 陣列分析，結(jié)果顯示出40 種ST 和60 種CT。這些結(jié)果表明，CRISPR 分型結(jié)果與MLST 具有良好的對應(yīng)關(guān)系，且與MLST 相比，CRIS PR-Cas 具有更大的區(qū)分相似菌株的能力，效果更好，結(jié)果也更加直觀，可用于克羅諾桿菌更精細(xì)的分型。

3.4 隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增DNA 基因分型

隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 技術(shù)采用隨機(jī)選擇的單一引物，通過PCR 即能產(chǎn)生復(fù)雜基因組。其是一種操作簡單、可行性高、高靈敏度的遺傳標(biāo)記技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于微生物的分子分型、物種親緣關(guān)系確定等領(lǐng)域[59]。2012 年，楊海榮等[60]采用RAPD 對8 株克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，并從產(chǎn)物中選取可以將克羅諾桿菌屬明確區(qū)分的特異性引物，以此對30 株食品克羅諾桿菌分離株進(jìn)行RAPD 分型。結(jié)果38 株可分為37 個(gè)不同的RAPD 帶型，而按照其遺傳差異可以分為8 個(gè)基因型類群，可見該技術(shù)可用于克羅諾桿菌不同種的鑒定。2013 年，陳萬義等[61]對由8 株模式菌株與35 株食品分離菌株組成的43 株克羅諾桿菌屬菌株基于gyr B 基因多態(tài)性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌屬之間的菌株聚成一類，5 株腸桿菌屬菌株聚在一起，并且阪崎克羅諾桿菌也被分成了7 個(gè)類群。結(jié)果可以看出gyr B 基因適合用于區(qū)分克羅諾桿菌屬菌株和其他腸桿菌屬菌株，以及gyr B 基因在克羅諾桿菌屬菌株種水平上的多態(tài)性。該方法技術(shù)簡單，不需要預(yù)先知道分離物的基因序列信息，具有普遍適用性，可為食品和環(huán)境中克羅諾桿菌的分型和溯源提供參考。

3.5 核糖體分型

核糖體分型通過將細(xì)菌分離株進(jìn)行酶切，并經(jīng)凝膠電泳將酶切結(jié)果顯示出來，最后對其圖譜進(jìn)行分析。該方法是一種適用于克羅諾桿菌的快速分子分型方法，基于核糖體分型方法在確定遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、區(qū)別不同來源阪崎克羅諾桿菌等方面非常有效[62]。2010 年，Pei 等[63]采用杜邦RiboprinterTM指紋圖譜分析儀對分離自食品的29 株克羅諾桿菌進(jìn)行核糖體分型，運(yùn)用BioNumerics 數(shù)據(jù)庫軟件建立相應(yīng)的核糖體指紋圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，結(jié)果核糖體分型將29 株克羅諾桿菌分離株分成26 種核糖體帶型。2016 年，陳萬義等[64]以分離自蔬菜的13 株阪崎克羅諾桿菌和乳粉的2 株阪崎克羅諾桿菌為研究對象進(jìn)行核糖體分型，并利用BioNumeicrus 軟件對其結(jié)果進(jìn)行聚類分析，按照相似性大于80 %計(jì)算后根據(jù)辛普森方程計(jì)算該分型方法的分辨率可達(dá)到0.808，且乳品分離株和其他實(shí)驗(yàn)菌株明顯不同，其他分離菌株聚成一列，并顯示出高基因相似性，成功將不同來源的菌株區(qū)別開來。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核糖體分型適用于不同來源的克羅諾桿菌分離菌株之間的鑒定與分型。它能夠?qū)⒉煌瑏碓吹姆蛛x菌株區(qū)別開來，盡管該方法費(fèi)用相對較高，但是其操作簡便，結(jié)果判斷快，重復(fù)性相對較高，省時(shí)省力，一次可同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行處理。因此，在緊急狀況下采用該技術(shù)對乳粉及其他食品來源的克羅諾桿菌進(jìn)行快速分子分型是非常有效的。

3.6 特殊基因分型

除上述提到幾種傳統(tǒng)的分型方法外，還有一些基于特殊基因的用于克羅諾桿菌分型鑒定的方法，例如基于16S rRNA 的單基因座序列分型(SLST)是用于細(xì)菌鑒定和建立系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最廣泛使用的技術(shù)。2015年，婁彬彬等[65]利用16S rDNA 基因測序的方法對分離自不同地區(qū)乳粉加工環(huán)境的37 株克羅諾桿菌進(jìn)行鑒定，所有菌株（除ES4）與阪崎克羅諾桿菌的同源性最高，相似性達(dá)99%，鑒定為阪崎克羅諾桿菌。另外，編碼細(xì)菌RNA 聚合酶β亞基的rpo B 基因也已用于克羅諾桿菌屬的鑒定。2009 年，Stoop 等[66]開發(fā)并評估了基于rpo B 的PCR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以區(qū)分克羅諾桿菌屬中的6 個(gè)物種。2017 年，Miranda 等[67]對分離自44 個(gè)國家不同食品的195 份樣中的51 個(gè)克羅諾桿菌分離株進(jìn)行rpo B 位點(diǎn)擴(kuò)增并進(jìn)行16S rRNA 測序，核苷酸測序揭示了在回收的克羅諾桿菌分離株中相當(dāng)大的種間和種內(nèi)遺傳變異性。2021 年，Sulaiman 等[39]在使用上述兩步PCR 方案時(shí)，所有來自各個(gè)環(huán)境樣本的83 個(gè)分離株在rpo B 位點(diǎn)均被鑒定為阪崎克羅諾桿菌。然而，基于16S rRNA 的SLST 和基于生物分型的表型分析有一些局限性，且與MLST 相比16S rDNA 的基因序列多樣性較低。該方法不可以一次性地將克羅諾桿菌的所有的“種”區(qū)分，還需要與其他方法結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。

3.7 全基因組分型

全基因組測序（whole genome sequencing,WGS）技術(shù)能夠在基因水平上全面分析其序列組成特征，是從整個(gè)基因組的角度分析菌株特性的有效方法，在食源性疾病爆發(fā)病原菌的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了重要作用[68]。2018 年，馮婧[69]對分離自PIF 及其加工環(huán)境的15 株不同ST 菌株與已完成測序的12 株參考克羅諾桿菌菌株進(jìn)行比較基因組分析。結(jié)果表明，測序菌株可分別歸屬于阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽克羅諾桿菌2 個(gè)種。同時(shí)利用Roary 軟件通過比較基因組學(xué)的泛基因組，并通過COG 數(shù)據(jù)庫對其結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)27 株克羅諾桿菌基因組劃分成11 262 個(gè)直系同源簇，其中特有基因占總基因簇的43 %，三類基因在26類功能分類中均有富集，表明克羅諾桿菌各項(xiàng)功能是由整體遺傳物質(zhì)統(tǒng)籌調(diào)控的。2019 年，WANG 等[70]對2006 至2015 年間輸入北京的奶粉中分離的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行WGS 分析，測得其主要的型別為ST1 和ST4 型。2021 年，Gan 等[10]對從617 份PIF 及其工廠環(huán)境樣品中分離出的15 株克羅諾桿菌進(jìn)行WGS 分析，結(jié)果15 株分離株均為阪崎克羅諾桿菌，且均分為7個(gè)ST 型，其中ST46 為顯性。2021 年，張紅芝等[71]對嬰幼兒食品中分離的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行WGS 分析，其研究中分離的9 株阪崎克羅諾桿菌共分為5 個(gè)ST型，ST1 和ST64 型為顯性，分別來自PIF 和嬰兒輔食，表明阪崎克羅諾桿菌污染對嬰幼兒存在潛在的危險(xiǎn)需提高重視。

全基因組測序技術(shù)要求高且測序時(shí)間較長。但隨著WGS 對克羅諾桿菌進(jìn)行高分辨率跟蹤、費(fèi)用逐步降低、測序時(shí)間逐步縮短等優(yōu)勢的顯現(xiàn)，該方法逐漸取代傳統(tǒng)克羅諾桿菌分型方法，廣泛用于克羅諾桿菌的分型及溯源中。

4 總結(jié)與展望

對常用于克羅諾桿菌的分型方法進(jìn)行了概述，其中血清分型結(jié)果對克羅諾桿菌血清型的確定有利于臨床疾病的溯源與治療，雖然此類方法存在操作繁瑣并且分辨率較低等問題，但目前技術(shù)的開發(fā)一定程度上彌補(bǔ)了這種不足。生化分析方法作為基于生理生化反應(yīng)的表型分型方法較其他方法應(yīng)用較早、方法更成熟、結(jié)果更直觀，但操作繁瑣導(dǎo)致鑒定耗時(shí)長。多位點(diǎn)序列分析方法在對目的菌株多態(tài)性和菌株間親緣關(guān)系的分辨上更有優(yōu)勢，但該方法分型過程中涉及7 個(gè)看家基因，因此成本較高。隨著研究的深入以及數(shù)據(jù)庫的不斷完善，MALDI TOF MS 作為一種新興的分型方法可配合其它分型方法實(shí)現(xiàn)對食源性致病菌的快速診斷。脈沖場凝膠電泳作為一種以酶切片段為依據(jù)的分子分型方法分辨率更高、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)，因此在克羅諾桿菌流行病學(xué)分析方面應(yīng)用很廣泛。隨著測序技術(shù)的發(fā)展基于全基因組序列的分型方法表現(xiàn)出對微生物的高分辨力及數(shù)據(jù)的可共享能力，在食源性致病菌溯源分析及流行病學(xué)監(jiān)控方面有著更加突出的優(yōu)勢。因此全基因組數(shù)據(jù)的分析與處理成為了溯源分型的關(guān)鍵，這就要求今后具有完備的生物信息學(xué)相關(guān)軟件及標(biāo)準(zhǔn)的分析流程，以更好地發(fā)揮全基因組分型技術(shù)的優(yōu)勢。

目前克羅諾桿菌造成的嬰兒配方乳粉污染已經(jīng)逐漸呈現(xiàn)出全球化趨勢，因此未來對克羅諾桿菌的分型溯源分析一定會趨于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化?？肆_諾桿菌的分型并不僅僅依賴于一種分型方法，而是多種傳統(tǒng)分型方法與新型分型方法的結(jié)合應(yīng)用來達(dá)到分型目的，在具有合適分型依據(jù)的基礎(chǔ)上，選擇最佳的分型方法可以幫助我們找到克羅諾桿菌的污染源，達(dá)到更好的防控效果。