陳翠玲1,,鈕 冰1,楊捷琳,*,趙麗娜,蔣 原

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444;2.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心,上海 200135)

克羅諾桿菌是一種兼性厭氧、革蘭氏陰性的食源性致病腸桿菌。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將克羅諾桿菌列為嬰幼兒配方奶粉A類致病菌之一[1-2]。新生兒和嬰幼兒是克羅諾桿菌感染的高危人群,其中奶粉是克羅諾桿菌的主要污染渠道。該屬細(xì)菌與腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎等有關(guān),通過污染嬰兒配方粉等食品而使嬰幼兒感染,致死率高達(dá)40%～80%[3],即使治愈也存在患嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)性后遺癥的可能性。

自1961年在兩例患有腦膜炎的新生兒體內(nèi)分離出克羅諾桿菌后[4],由克羅諾桿菌感染引起的食品安全事件頻發(fā)[5]。目前關(guān)于克羅諾桿菌的致病機理和傳播途徑尚未清楚,相比于其他的乳粉污染菌,克羅諾桿菌由于其強耐受性以及抗藥性,在不適宜微生物生長的環(huán)境中能夠頑強存活下來,足見其根除的難度,因此克羅諾桿菌在嬰幼兒食品領(lǐng)域中備受關(guān)注。目前工業(yè)生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉仍然會存在克羅諾桿菌污染的現(xiàn)象,這也是奶粉生產(chǎn)的主要安全問題之一[6]。克羅諾桿菌能在奶粉等產(chǎn)品及其生產(chǎn)過程中存活,和它的干燥耐受性、耐熱性等特性密切相關(guān)。為更全面了解克羅諾桿菌在特殊環(huán)境中的耐受性以及在臨床治療上耐藥性的差異,降低人群尤其是新生兒以及嬰幼兒的感染率,本文將從該菌的各種耐受性以及耐藥性進行綜述。

1 耐干燥性

克羅諾桿菌可以從蔬菜粉、香料、谷物、奶酪等干燥食物中分離得到[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌不僅存在于水環(huán)境[10]中,也可以依附各類干制品,存在范圍廣泛。姚幫本等[11]通過對120種海產(chǎn)干制品克羅諾桿菌污染進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)檢出率為17. 83%?？梢娍肆_諾桿菌對生存環(huán)境的濕度、水分要求不高,初步顯示該屬菌具有一定的耐干燥性。經(jīng)過評估嬰兒配方奶粉和加工環(huán)境中分離得到的克諾羅桿菌抗干燥性,發(fā)現(xiàn)菌株存活時間可長達(dá)1 年[12]。Breeuwer等[13]研究了克羅諾桿菌對干燥脅迫的抗性,發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌比沙門氏菌、大腸桿菌等其他腸桿菌科菌株對干燥壓力的抵抗性強,是由于克羅諾桿菌通過產(chǎn)生海藻糖穩(wěn)定蛋白質(zhì)和磷脂膜結(jié)構(gòu),抵抗干燥脅迫,保護自身免于脫水,增進干燥耐受性。同時,Lang等[14]發(fā)現(xiàn)奶粉培養(yǎng)液中的克羅諾桿菌的耐干燥性比在緩沖溶液中強。牛奶中某些蛋白質(zhì)、乳脂和乳糖可以在干燥過程中對克羅諾桿菌起到保護作用[15]。

總結(jié)奶粉中細(xì)菌抗干燥研究[14,16],得知克羅諾桿菌的干燥耐受性明顯比沙門氏菌、李斯特菌與大腸桿菌高?？肆_諾桿菌在經(jīng)受干燥環(huán)境時,鉀離子、谷氨酸等電解質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積累提高內(nèi)滲透壓,以此適應(yīng)外部因干燥導(dǎo)致的高滲透壓[17]。另外,克羅諾桿菌會合成具有保護性的化合物,如海藻糖可以提高耐干燥性。另一種說法則是形成生物膜的克羅諾桿菌抗干燥性更強,相同情況且經(jīng)過實驗證實的有李斯特菌,沒有形成生物膜的李斯特菌在干燥環(huán)境中的存活率低[18]。以此類推,克羅諾桿菌可以形成生物膜,生物膜包裹著細(xì)菌細(xì)胞,在不利環(huán)境中以生物膜群落的形式生存,提高了克羅諾桿菌的干燥耐受性。雖然對克羅諾桿菌的研究長達(dá)數(shù)十年,但尚未進行全面的相關(guān)研究來明確克羅諾桿菌的抗干燥機制。而嬰幼兒的主要營養(yǎng)來源是奶粉,再加上免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全等不利條件,目前依然會成為克羅諾桿菌的主要感染人群。

2 耐熱性

常規(guī)的低溫巴氏消毒法雖能殺死大部分生長型致病菌,但對個別具有耐熱性的克羅諾桿菌菌株是無效的。Al-Holy等[19-20]得出克羅諾桿菌在54～64 ℃的范圍內(nèi)具有耐熱性的結(jié)論。王倩寧[21]將從羊奶粉中得到67株克羅諾桿菌在60 ℃加熱10 min,發(fā)現(xiàn)部分菌株仍有一定的活性。和沙門氏菌、乳酸片球菌相比,克羅諾桿菌耐熱性更高[22]。

耐熱島的存在是克羅諾桿菌在熱環(huán)境中持久存在的重要條件之一。成人患者身上分離的克羅諾桿菌都具有較強的耐熱性和相同基因組島[23],為深入探究該基因組島是否與克羅諾桿菌的耐熱性相關(guān),尋找耐熱基因,從基因?qū)用娼忉尶肆_諾桿菌的強耐熱性,經(jīng)比較克羅諾桿菌同個基因組島,發(fā)現(xiàn)基因島有兩種構(gòu)型:完整版本thrB-Q基因和縮短版本的thrBCDOP基因,有完整基因島菌株在熱環(huán)境存活率高,同時編碼應(yīng)激反應(yīng)σ因子rpoS基因表達(dá)水平的不同也是克羅諾桿菌耐熱性差異的原因之一[24]。Kaclikova等[25]的新實驗結(jié)果更進一步證明了克羅諾桿菌的強耐熱性。從微觀角度看,耐熱基因組島的存在是克羅諾桿菌耐熱的內(nèi)部原因之一,完整的耐熱基因組島thrB-Q能讓克羅諾桿菌在熱環(huán)境中比缺失或者沒有耐熱島的存活更長時間。此外,克羅諾桿菌對干燥的強耐受性提高了它在熱環(huán)境的持久性[26]。但是目前對克羅諾桿菌的耐熱機制以及與耐干燥性的相互作用的了解存在局限,兩者之間的影響有待進一步研究。

3 耐酸堿性

食品中經(jīng)常使用調(diào)節(jié)pH的方法達(dá)到殺菌或抑菌效果。成人胃液pH是0.9～1.5,嬰幼兒胃中酸環(huán)境偏高,以母乳喂養(yǎng)的為主的嬰幼兒胃酸pH約為2.7,以奶粉喂養(yǎng)為主的則為 pH3.6。當(dāng)消費者特別是嬰幼兒人群食用被克羅諾桿菌污染的食物時,克羅諾桿菌能通過人體胃酸保護屏障并致病,說明克羅諾桿菌屬于耐酸菌[27]。袁飛等[28]為驗證這一猜想,對22株克羅諾桿菌進行酸處理,在pH1.18處理1 min 情況下檢測到2株存活。同樣,廖明治等[29]則用3%硝酸溶液和1.5%氫氧化鈉溶液分別對克羅諾桿菌處理1和15 min,最終堿處理的菌株均死亡,而酸處理的菌株均有活性。可以發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌耐堿能力差,耐酸性強,分析得知克羅諾桿菌是革蘭氏陰性菌,其細(xì)胞壁含有大量的脂類物質(zhì),可能堿處理時脂類與堿發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破壞而死亡。因此,建議食品工廠尤其是奶粉工廠使用堿性消毒劑進行殺菌,同時工作人員可用肥皂液洗手消毒,防止交叉污染。

此外,在酸處理過程中發(fā)現(xiàn)了克羅諾桿菌生長滯后現(xiàn)象,pH4.2和4培養(yǎng)的克羅諾桿菌分別比其它pH下的延遲2和4 h進入生長指數(shù)期,雖然克羅諾桿菌的生長周期受到不同程度的延遲,但是仍顯示出高生長性能[30]。并且不同特殊環(huán)境也對克羅諾桿菌生長帶來不同的滯后影響。Margot等[31]測量熱、酸和干燥對克羅諾桿菌單細(xì)胞生長的滯后時間,發(fā)現(xiàn)菌株的酸脅迫滯后時間最長,在酸環(huán)境中細(xì)胞生長延緩可能是由于克羅諾桿菌存在酸適應(yīng)過程。因為在先前研究中發(fā)現(xiàn)李斯特菌和大腸桿菌在酸脅迫下,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化[32-34]。同理可得,克羅諾桿菌進入生長指數(shù)期遲滯,可能是因為酸性環(huán)境先導(dǎo)致細(xì)胞變形,無法正常生長,后期當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)了環(huán)境,先前變形的細(xì)菌細(xì)胞則恢復(fù)到可以生長的狀態(tài),開始進入指數(shù)生長期。因此克羅諾桿菌耐酸性的機制可能是通過細(xì)胞形態(tài)的動態(tài)變化來緩解酸脅迫,可能也是促使克羅諾桿菌在不利環(huán)境中存活,感染和致病的可能關(guān)鍵因素之一[35]。但是目前對克羅諾桿菌的酸脅迫反應(yīng)機制仍知之甚少,還需進行更深入的研究證實。

4 耐藥性

克羅諾桿菌廣泛存在于各種環(huán)境中,大到各種儀器設(shè)備,小到生活中常見食品[36],經(jīng)研究,并非所有克羅諾桿菌都帶有致病性,目前只發(fā)現(xiàn)從奶粉中分離的菌株與嬰幼兒患病有關(guān)[37]。為了解克羅諾桿菌的耐藥性,張翼等[38]分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)克羅諾桿菌對萬古霉素、四環(huán)素的耐受性較高。羅夢幽等[39]通過從農(nóng)貿(mào)市場和流動小販的食品得到43株克羅諾桿菌,經(jīng)過耐藥實驗檢測出菌株對利福平的耐藥率達(dá)97.7%,對萬古霉素、桿菌肽B、克林霉素、苯唑西林和青霉素的耐藥率為 100%。造成這種現(xiàn)象的可能原因是飼料中抗生素的濫用導(dǎo)致動物體內(nèi)抗生素的殘存,進而導(dǎo)致克羅諾桿菌抗藥性的增強。崔晶花等[40]不僅鑒定出對頭孢呋辛和阿莫西林耐藥的菌株外,還發(fā)現(xiàn)了4株對14種抗生素耐藥的多重耐藥菌株。Zeng等[41]在一例中國新生兒的腦膜炎病例中也發(fā)現(xiàn)一株新型的耐多種藥物的克羅諾桿菌。

近幾年的實驗都證明了克羅諾桿菌具有強耐藥性[42-45]。而黃玉蘭等[46]實驗說明克羅諾桿菌的抗藥性發(fā)生了變化,試驗菌株對氯霉素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的最低抑菌濃度逐年升高,且已對二代頭孢類藥物產(chǎn)生較高的耐受性。最初,有研究[47]指出食品來源的克羅諾桿菌耐藥性不顯著,但由上述可知,與克羅諾桿菌抗藥性相關(guān)報道或者實驗研究都表明克羅諾桿菌的抗藥性逐年增強,而且近幾年從食品中分離出的克羅諾桿菌的耐藥性都比較強,例如對四環(huán)素、萬古霉素的耐藥性,青霉素、一代與二代頭孢菌素等醫(yī)院常用抗生素已經(jīng)對克羅諾桿菌失去了抑制作用,如今更有多重抗藥性新型細(xì)菌出現(xiàn)。針對目前克羅諾桿菌的耐藥現(xiàn)狀,研究重點應(yīng)集中在新型抗生素、新藥物和新治療方法的開發(fā)。Obaidat等[48]發(fā)現(xiàn)香草醛可以抑制克羅諾桿菌的生長,Shi等[49-50]則研究阿魏酸和硫辛酸對克羅諾桿菌的抗菌活性,得知這兩種化學(xué)物質(zhì)都可以破壞克羅諾桿菌細(xì)胞膜的完整性?？肆_諾桿菌對新抑菌物質(zhì)敏感的發(fā)現(xiàn)為臨床治療克羅諾桿菌感染帶來了新的可能性。開發(fā)研究新型的抗菌物質(zhì)將會是解決克羅諾桿菌等細(xì)菌抗藥性難題的未來發(fā)展方向之一。

5 結(jié)語與展望

食品生產(chǎn)工廠的常見殺菌方法如高溫、高酸等以及用于臨床治療的抗生素一般均不利于微生物生長。但是面對這些特殊環(huán)境,克羅諾桿菌具有極強的耐受性。有研究[51]發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌等腸桿菌科菌在受到高溫等刺激時,會以特殊的休眠方式——“活的但不可培養(yǎng)”狀態(tài)來應(yīng)對外界壓力,等到環(huán)境條件合適時,克羅諾桿菌又會再次恢復(fù)活性。這可能是出廠檢驗時無克羅諾桿菌污染的嬰幼兒奶粉為什么在造成食品安全事件后卻又被檢出克羅諾桿菌污染呈陽性的現(xiàn)象的原因。經(jīng)過一些亞致死處理如熱休克和酸沖擊等,克羅諾桿菌會被誘導(dǎo)進入休眠狀態(tài)或代謝生成其他物質(zhì)來保護自己,這種機制無疑不利于食品中克羅諾桿菌的檢測和控制。此外,由于近年來抗生素濫用等原因,克羅諾桿菌抗藥性逐漸增強,甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株,這種現(xiàn)象對于臨床治療來說是一個巨大的挑戰(zhàn),更是對人類健康的一種威脅。

因此,在食品安全日益受到重視的情況下,明確克羅諾桿菌對特殊環(huán)境的耐受機制,將有助于進一步了解克羅諾桿菌的生物學(xué)特性、分布特征、污染食物的具體途徑和污染狀況,對由該菌引起的疾病暴發(fā)、流行病的預(yù)防及溯源提供理論依據(jù),更為建立食品尤其是乳制品的安全系統(tǒng)、檢測手段和控制措施提供科學(xué)依據(jù),從而為嬰幼兒食品提供安全保障。研究微生物的耐藥性和耐藥機制、加強對細(xì)菌的耐藥檢測、合理地選用抗菌藥物、開發(fā)新型的抗菌藥以減少細(xì)菌耐藥性發(fā)生,對于控制和治療由該食源性微生物引起的感染具有重要的公共衛(wèi)生意義。因此為防止該菌的大規(guī)模的傳播與暴發(fā),保障食品的安全衛(wèi)生和消費者的健康,相關(guān)部門需要嚴(yán)守食品安全檢測的門檻,定期抽檢市場銷售的食品,提高抽檢效率與檢測質(zhì)量,做好預(yù)防控制工作。