張清平，張懿翔，劉洋

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(上海)，上海 200233)

0 引言

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是一種自然界中普遍存在的微生物，它能夠從多種介質(zhì)和環(huán)境中分離得到，包括食品、奶粉原料、廢水、食品生產(chǎn)線以及家庭和醫(yī)院等，奶粉和其生產(chǎn)加工環(huán)境是該菌傳播的主要媒介[1-4]。該菌是一種食源性條件致病菌，主要引起嬰幼兒，尤其是早產(chǎn)兒發(fā)生腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎的感染，死亡率高達(dá)50%～80%[5-7]，近些年來(lái)爆發(fā)了多起阪崎腸桿菌的重大感染事件[8-10]。2006年，針對(duì)嬰幼兒配方奶粉受阪崎腸桿菌污染的高風(fēng)險(xiǎn)和污染后的巨大危害，原國(guó)家質(zhì)檢總局頒布了嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌每批必檢的市場(chǎng)準(zhǔn)入要求。

GB4789.40-2016作為阪崎腸桿菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，一直被廣泛采用，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，滿足不了阪崎腸桿菌快速篩選的需求，因此，多年來(lái)針對(duì)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)技術(shù)也一直在不斷發(fā)展，其中以DNA為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展最為迅速[11-15]。而這些快速檢測(cè)方法的一個(gè)共同特征即是需要從待測(cè)樣本中獲取阪崎腸桿菌的基因組DNA。由于從待測(cè)樣本中提取阪崎腸桿菌DNA，需要一定數(shù)量的目標(biāo)菌，所以目前已發(fā)布的阪崎腸桿菌檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中，其首要步驟就是對(duì)待檢樣本進(jìn)行增菌培養(yǎng)[16-17]。

據(jù)調(diào)查，實(shí)際流通食品中致病菌的含量通常較低，多數(shù)奶粉中阪崎腸桿菌的污染水平小于1 CFU/100 g[18]，目前與阪崎腸桿菌相關(guān)的快速測(cè)方法都達(dá)不到如此低的檢出限。已報(bào)道的基于DNA檢測(cè)的阪崎腸桿菌快檢方法的檢出限達(dá)到103CFU/mL（g）[19-20]，因此，采用傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)方法對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行增殖，使其快速達(dá)到一定的數(shù)量是目前各快速檢測(cè)方法必不可少的關(guān)鍵步驟。據(jù)報(bào)道，阪崎腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為35～40℃，在36℃的培養(yǎng)條件下，該菌的生長(zhǎng)延滯期較短[21]。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中阪崎腸桿菌的前增菌時(shí)間為18±2 h，為了摸索出適合熒光PCR快速檢測(cè)方法的阪崎腸桿菌最佳前增菌時(shí)間，本研究對(duì)嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的前增菌培養(yǎng)條件及影響因素進(jìn)行全面研究，以期建立穩(wěn)定的阪崎腸桿菌快速檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：阪崎腸桿菌ATCC25944；干擾菌株：大腸桿菌ATCC8099，沙門氏菌ATCC 13311，金黃色葡萄球菌ATCC6538，陰溝腸桿菌ATCC 35030。選用的3種嬰幼兒奶粉均購(gòu)自市場(chǎng)，采用GB4789.40的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出阪崎腸桿菌。

培養(yǎng)基及試劑：緩沖蛋白胨水（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯，營(yíng)養(yǎng)瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂及阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒DP302-02來(lái)自天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)(Cat#RR 390A)購(gòu)自大連寶生物公司；熒光PCR引物及探針由上海生工合成：上游引物5’-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3’；下游引物5’-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3’；探針5’-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱(Shellab，G16-2)，美國(guó)Shellab公司；生物安全柜(labconcoB2)，美國(guó)Lanconco；麥?zhǔn)媳葷醿x，法國(guó)梅里埃；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5430R)，德國(guó)Eppendorf公司；超微量紫外可見分光光度計(jì)（DeNovix DS-11），美國(guó)DeNovix公司；熒光定量CR儀（ABI 7500 Fast），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Vortex Genie2漩渦振蕩器，德國(guó)Heidolph公司；移液器（2，10，100，1 000μL）（Eppendorf Research Plus），德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 阪崎腸桿菌平板計(jì)數(shù)

阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)采用兩種平板計(jì)數(shù)法（傾注培養(yǎng)法和阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基涂布法），傾注培養(yǎng)法按GB4789.2的操作進(jìn)行，阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基涂布法參照GB4789.2的要求進(jìn)行梯度稀釋后，取0.2 mL涂布兩塊阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基，倒置于36±1℃培養(yǎng)24±2 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)菌株菌懸液的制備

阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及干擾菌株經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)活后轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，36±1℃培養(yǎng)24±2 h，用生理鹽水將營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上的菌苔洗下，制成菌懸液，用比濁儀測(cè)定各菌懸液的麥?zhǔn)蠞舛?，并按GB4789.2和阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基涂布法進(jìn)行回收計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)證明平板計(jì)數(shù)法所回收的菌落數(shù)與比濁儀參考表推算出的初始菌液濃度基本吻合,如表1所示。在人工染菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，奶粉樣品中的人工加菌量將按照比濁儀測(cè)得的比值進(jìn)行估算。

表1 菌液濃度計(jì)算預(yù)實(shí)驗(yàn)

1.3.3 不同初始菌量下阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

稱取100 g奶粉加入到900 mL的BPW增菌液中，充分均勻后,分別加入菌液濃度為103、102、101CFU/mL及1～9 CFU/mL菌液各1 m L，每種加菌量重復(fù)3次。人工染菌后的BPW增菌液經(jīng)充分混勻后置36±1℃培養(yǎng)。

1.3.4 奶粉基質(zhì)對(duì)阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

分別以3種不同品牌奶粉做基質(zhì)，稱取100 g奶粉加入到900 mL的BPW中，每種奶粉重復(fù)3次，同時(shí)以不添加奶粉樣品的900 mL BPW增菌液做背景基質(zhì)對(duì)照。然后將制備好的阪崎腸桿菌菌懸液稀釋，選取1～9 CFU/mL濃度的菌液，取1 mL添加到已制備好的BPW增菌液中，充分混勻后，置36±1℃培養(yǎng)。

1.3.5 不同干擾菌背景下阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

在含有奶粉基質(zhì)的900 mLBPW增菌液中，按照表2的實(shí)驗(yàn)設(shè)置人工添加阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及陰溝腸桿菌的菌懸液（濃度約為1～9 CFU/m L），每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置進(jìn)行3次重復(fù)，充分混勻后置36±1℃培養(yǎng)。

表2 不同干擾菌背景下阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.3.6 阪崎腸桿菌的熒光PCR檢測(cè)方法

分別取1.3.4及1.3.5兩步前增菌培養(yǎng)后的BPW增菌液2 m L，3 000 rpm離心10 min后棄去上層的奶粉脂肪層，然后13 000 rpm離心10 min，棄去上清液，保留底部沉淀，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，將提取后的樣品DNA測(cè)定其濃度和質(zhì)量，然后采用熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始菌量條件下阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)情況

含有奶粉基質(zhì)的BPW增菌液的4種不同的起始菌量分別約為103、102、101及1～9 CFU/1 000 m L，經(jīng)過(guò)4、6、8、10、12、14、16 h增菌培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)結(jié)果見圖1，可以發(fā)現(xiàn)，初始菌量不同，阪崎腸桿菌生長(zhǎng)的延滯期長(zhǎng)短不同，隨著初始菌量逐漸減少，阪崎腸桿菌生長(zhǎng)的延滯期變長(zhǎng)。初始菌量在1～9 CFU/1 000 m L數(shù)量級(jí)時(shí)，培養(yǎng)4 h時(shí)阪崎腸桿菌計(jì)數(shù)＜1 CFU/mL，增菌培養(yǎng)10 h時(shí)，阪崎腸桿菌的數(shù)量才能達(dá)到103CFU/mL。樣品中初始菌含量是影響阪崎腸桿菌快速增殖到一定數(shù)量的關(guān)鍵因素。目前我國(guó)市場(chǎng)上嬰幼兒配方奶粉的整體衛(wèi)生狀況較好，即便有阪崎腸桿菌的污染，其污染量極低，因此，采用阪崎腸桿菌快速檢測(cè)方法所需要的增菌培養(yǎng)時(shí)間至少在10 h以上。

圖1 不同初始菌量下阪崎腸桿菌生長(zhǎng)變化

2.2 奶粉基質(zhì)對(duì)阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)影響

含有奶粉基質(zhì)的BPW增菌液與未含有奶粉基質(zhì)的BPW增菌液，在預(yù)設(shè)的增菌時(shí)間培養(yǎng)后，取增菌液采用熒光PCR法檢測(cè)阪崎腸桿菌，不含奶粉基質(zhì)的BPW增菌液與含有奶粉基質(zhì)的BPW增菌液所獲取的擴(kuò)增Ct值均存在顯著性差異。增菌培養(yǎng)8 h時(shí)，熒光PCR擴(kuò)增的Ct值大于40，未檢出阪崎腸桿菌；增菌培養(yǎng)10 h時(shí)，熒光PCR擴(kuò)增的Ct值小于35，能夠有效地檢出阪崎腸桿菌。此外，隨著增菌時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光PCR擴(kuò)增的Ct值逐漸減小,如圖2所示。值得注意的是，未添加奶粉基質(zhì)的BPW增菌液與添加3種不同品牌奶粉基質(zhì)的BPW增菌液的生長(zhǎng)增殖有明顯的差異，相同初始菌量在增菌時(shí)間相同的情況下，未添加奶粉基質(zhì)的BPW增菌液中目標(biāo)菌的生長(zhǎng)明顯多于添加奶粉基質(zhì)的，如圖3所示。這可能是奶粉中含有一定量的雜菌，在培養(yǎng)的過(guò)程中由奶粉帶入的非目標(biāo)菌一定程度上抑制了阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)，使阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)速度減緩，當(dāng)阪崎腸桿菌增殖到一定數(shù)量后，抑制效果不明顯。

圖2 不同基質(zhì)對(duì)阪崎腸桿菌熒光PCR檢測(cè)的影響

圖3 不同基質(zhì)對(duì)阪崎腸桿菌增殖數(shù)量的影響

2.3 不同干擾菌條件下阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)情況

以奶粉為基質(zhì)的BPW增菌液中添加相同數(shù)量級(jí)的目標(biāo)菌和干擾菌,在經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的增菌培養(yǎng)后，增菌液中目標(biāo)菌的增殖數(shù)量及熒光PCR檢測(cè)所獲取的Ct均存在顯著差異，如圖4所示，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，奶粉中大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的存在數(shù)量與阪崎腸桿菌的數(shù)量在同一數(shù)量級(jí)別時(shí)，這3種食品中常見的致病菌對(duì)阪崎腸桿菌基本沒(méi)有抑制作用。但以奶粉為基質(zhì)的BPW增菌液中添加相同數(shù)量級(jí)的阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌時(shí)，阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)增殖將受到一定程度的抑制，增菌液中目標(biāo)菌的增殖數(shù)量明顯減少，增菌培養(yǎng)12 h后熒光PCR檢測(cè)的Ct值才小于35，采用快速檢測(cè)方法能夠有效檢出阪崎腸桿菌的培養(yǎng)時(shí)間被延長(zhǎng)。

圖4不同干擾菌對(duì)阪崎腸桿菌增殖生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論

目前嬰幼兒乳粉中阪崎克羅諾桿菌的快速檢測(cè)均需要增菌培養(yǎng)，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.40的增菌培養(yǎng)條件，通常需要1～2 d的培養(yǎng)時(shí)間，考慮到PCR檢測(cè)方法靈敏度較高，摸索出能夠達(dá)到快速檢測(cè)所需的最短增菌培養(yǎng)時(shí)間將可以更快獲得檢測(cè)結(jié)果。阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)模型預(yù)測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)均顯示阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)延滯期較短[22-25]，培養(yǎng)8 h即進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，本研究模擬奶粉中阪崎腸桿菌污染水平較低的現(xiàn)狀，將初始加菌量控制在1～9 CFU/1 000 mL的極低濃度，增菌培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng)，初始菌量是影響阪崎腸桿菌快速到達(dá)一定數(shù)量的關(guān)鍵因素。采用熒光PCR方法對(duì)人工染菌后的增菌液進(jìn)行檢測(cè)，最快增菌培養(yǎng)10 h即可檢出阪崎腸桿菌。然后綜合考慮不同嬰幼兒奶粉基質(zhì)的差異及可能含有的常見干擾菌的影響，采用快速檢測(cè)方法對(duì)嬰幼兒奶粉進(jìn)行阪崎腸桿菌檢測(cè)時(shí)，增菌培養(yǎng)12 h才不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

因此，對(duì)于目前市場(chǎng)上銷售的嬰幼兒奶粉，采用傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)方法，增菌培養(yǎng)10～12 h后，奶粉中污染的阪崎腸桿菌數(shù)量即可達(dá)到PCR檢測(cè)方法的檢出限，滿足PCR快速檢測(cè)的需求，此培養(yǎng)時(shí)間比傳統(tǒng)的培養(yǎng)時(shí)間節(jié)省了約30 h。本研究結(jié)果也可用于奶粉生產(chǎn)企業(yè)的日常監(jiān)控，一定程度上可節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，還可有效減低生產(chǎn)成本，為社會(huì)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)效益。