黃珍，李漢芳，路夢凡，徐丹，舒國偉，黃銳，徐秦峰

（1.陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院國家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，西安 710021；2.中墾華山牧乳業(yè)有限公司，陜西渭南 714000）

0 引言

駱駝乳由于富含乳鐵蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶等多種保護性蛋白[1-2]，具有易于消化吸收、較高的抗菌性、優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)成分等多種優(yōu)勢，受到廣大消費者的青睞。研究表明，駱駝乳乳鐵蛋白（Camel lactoferrin，CLF）可通過與病毒顆?；蚴荏w結(jié)合，抵抗病毒的侵襲，具有抗菌、抗氧化、抗癌等作用[3-5]。同時，CLF 對熱敏感，熱加工工藝會導(dǎo)致其變性，影響其抗微生物活性[6-8]。因此，檢測駝乳及其制品中乳鐵蛋白的含量對其營養(yǎng)價值的評估具有重要意義。目前，已經(jīng)建立了多種CLF 的檢測方法[9-14]。聚丙烯酰胺凝膠電泳作為一種常見的蛋白分離檢測方法，可用于CLF 的分析，成本低但操作復(fù)雜、耗時[10,13-14]。高效液相色譜與質(zhì)譜法聯(lián)用其特異性、靈敏度、重復(fù)性等均能夠滿足CLF 的定量要求，但前處理復(fù)雜，對操作人員技術(shù)要求較高，測定結(jié)果包含了熱變性CLF[12]。采用薄層色譜法可直接在駱駝乳中分離定量出乳鐵蛋白，樣品前處理簡單，僅能用于CLF 半定量檢測[11]。因此，依然需要發(fā)展操作簡便、快速、準(zhǔn)確的非熱變性CLF 檢測方法，用于駱駝乳及乳制品營養(yǎng)品質(zhì)監(jiān)管及熱處理工藝優(yōu)化。

實驗室前期基于乳鐵蛋白特異性結(jié)合的DNA 序列，建立了牛源乳鐵蛋白的電泳遷移檢測方法[15-16]，并驗證了該方法適用于羊源和人源乳鐵蛋白檢測[17]。本研究中，進一步考察了該方法對于駱駝源乳鐵蛋白CLF 檢測的適用性，并且檢驗了乳鐵蛋白熱變性對于分析性能的影響，測定了不同熱加工處理駝乳制品（凍干駝乳粉、噴霧干燥駝乳粉以及UHT 駝乳）中CLF 含量變化，為駱駝乳制品熱加工工藝優(yōu)化和營養(yǎng)價值評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，BLF）、人源乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-Lac）純度≥85%、酪蛋白（Casein）純度≥90%，均購買自Sigma-Aldrich；羊乳鐵蛋白（goat lactoferrin，GLF）純度≥85%，購買自西安優(yōu)博生物科技有限公司；DNA1 序列（5’-AGG CAG GAC ACC GTA ACC GGT GCA TCT ATG GCT ACT AGC TCT TCC TGC CT-3’）、DNA2 序列（5’-TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC CTC TCC ATG ACG TTC TTC CTC-3’）、DNA3 序列（5’-TAG AAG ATC AAA -3’）均由上海生工生物工程公司合成；考馬斯亮藍R-250、非預(yù)染蛋白Marker 均購買自上海生工生物工程公司；肝素親和柱購買自北京美正生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑購買自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

高速冷凍離心機，Eppendorf；水平和垂直電泳儀，BIO-RAD；TGel 藍光凝膠成像系統(tǒng)，天根生化科技有限公司；OS-03U 搖床，北京六一生物科技有限公司；全自動高通量毛細管凝膠電泳儀器（QseP1）、卡夾，光鼎（Bioptic）公司。

1.2 實驗材料

CLF 的提取:鮮駝乳在4 ℃，12 000 r/min 下離心10 min 后取中間層溶液，按照肝素親和柱說明書中的實驗步驟（美正生物），進行CLF 的提取純化，CLF 最終洗脫液采用BCA 蛋白定量試劑盒定量濃度，分裝后-20 ℃保存待用。

實驗中使用的乳制品為鮮駝乳和UHT 處理的液態(tài)駝乳，-20 ℃保存待用。經(jīng)噴霧干燥駝乳粉（Spray drying，SD）和冷凍干燥駝乳粉（Freeze drying，F(xiàn)D），-20 ℃保存待用。

1.3 檢測方法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：樣品在含有Tris-HCl（pH 6.8）、甘油、2% SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍的上樣緩沖液中，95 ℃，5 min 變性。電泳參數(shù)：12%電泳預(yù)制膠，電壓為120 V，電泳時間為90 min；考馬斯亮藍R-250 標(biāo)記樣品中的蛋白條帶，脫色后使用凝膠記錄系統(tǒng)觀察凝膠。以牛、羊、人乳鐵蛋白為陽性對照，表征CLF。

瓊脂糖凝膠電泳遷移檢測：將退火后DNA 加入稀釋至一定濃度的CLF 標(biāo)準(zhǔn)溶液或含一定量CLF 的待測樣品，混合后上樣。電泳參數(shù)：3%的瓊脂糖凝膠，1×TAE 電泳緩沖液，電壓為90 V，電泳時間為25 min。電泳結(jié)束后使用藍光透射儀觀察電泳結(jié)果。使用數(shù)據(jù)處理軟件WCIF Image J 采集條帶灰度值。

全自動毛細管凝膠電泳檢測參數(shù)為：將退火后（（95±0.5）℃，5 min）非熒光標(biāo)記的DNA 加入稀釋至一定濃度的CLF 標(biāo)準(zhǔn)溶液或含一定量CLF 的待測樣品，用1×PBS 調(diào)整終體積為20 μL。進樣電壓：4 kV；進樣時間：10 s；分離電壓：8 kV；分離時間：240 s；毛細管的有效分離長度為13 cm。

1.4 實際樣品檢測

實際樣品前處理：新鮮駝乳在4 ℃，12 000 r/min離心處理10 min，取中間層；駝乳粉溶解方式為稱取1 g 奶粉用超純水定容至7 mL，4 ℃，12 000 r/min 離心處理10 min，取中間層。

實際樣品檢測：用所建立的檢測CLF 的方法，分別檢測鮮駝乳（取0.1 μL）、不同加工處理駝乳粉（取0.3 μL）中CLF 的含量。在實際樣品中加入CLF 標(biāo)準(zhǔn)品進行加標(biāo)回收檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 駝源乳鐵蛋白的提取與表征

由于駝源乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品無法通過商業(yè)化渠道購買，而研究表明CLF 同其它來源乳鐵蛋白一樣，能夠與肝素高特異性結(jié)合[12]，因此實驗中采用肝素親和柱從生駝乳中提取CLF。圖1（a）為CLF 提取液的SDSPAGE 電泳圖，從中可以看出，相比于生駝乳（泳道2），CLF 提取液僅在約80 ku 出現(xiàn)單一的蛋白條帶（泳道3），并且與牛、羊、人源乳鐵蛋白分子量接近（泳道4-6）[18-19]，表明經(jīng)過肝素親和柱純化步驟成功去除掉了絕大部分的酪蛋白和其它乳清蛋白，獲得了較高純度的CLF（純度＞96%），可用于后續(xù)實驗。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測CLF

2.2 駝源乳鐵蛋白的瓊脂糖凝膠電泳遷移檢測

前期研究表明，采用凝膠電泳遷移檢測時，對于不同來源乳中乳鐵蛋白，其最適的DNA 結(jié)合序列有所差異。例如，對于牛源和人源乳鐵蛋白，最適的序列為DNA1；而羊乳乳鐵蛋白的序列為DNA2[14-17,20-22]。同時，氨基酸序列比對結(jié)果表明，CLF 與人源、牛源和羊源乳鐵蛋白同源性為約75%，如圖1（b）所示。這些差異可能會影響CLF 與DNA 的特異結(jié)合。瓊脂糖凝膠電泳遷移實驗結(jié)果表明，如圖1（c）所示，CLF 最適的序列為DNA1，與牛源和人源乳鐵蛋白一致，因此，對于不同來源的乳鐵蛋白，可能存在能夠與DNA1 結(jié)合的保守序列。

DNA1 序列與CLF 的結(jié)合反應(yīng)具有高特異性，駱駝乳及乳制品中存在的酪蛋白（Cas）和α-乳白蛋白（α-Lac）等乳蛋白均不會出現(xiàn)蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物條帶，如圖1（d）所示。隨著CLF 濃度增加，DNA-CLF復(fù)合物條帶的灰度值增加，如圖1（e）所示，兩者之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2=0.99604），表明DNA1 序列可用于CLF 的定量檢測。因此，基于電泳遷移的乳鐵蛋白檢測方法對于不同來源乳樣品具有通用性。

由于乳鐵蛋白對熱敏感，而乳制品普遍采用熱殺菌工藝，進一步考察了CLF 熱變性對于檢測性能的影響。對于熱變性的CLF 樣品，未觀察到對應(yīng)的DNACLF 復(fù)合物條帶，如圖1（d）所示，表明DNA1 僅能夠結(jié)合非熱變性的CLF，可能是因為加熱變性后乳鐵蛋白的構(gòu)象發(fā)生了改變，破壞了DNA 的結(jié)合位點。因此，基于DNA 親和作用的電泳遷移檢測方法，檢測結(jié)果僅為樣品中非熱變性的乳鐵蛋白含量，可以反映出不同熱加工工藝的差異。

2.3 駝源乳鐵蛋白的毛細管凝膠電泳遷移檢測

DNA1 結(jié)合序列同樣適用于CLF 的毛細管凝膠電泳遷移檢測，如圖2（a）～2（c）。隨著CLF 濃度的增加，體系中游離DNA1 電泳峰面積明顯降低，如圖2（a）所示，與之前的實驗結(jié)果一致[17]。以CLF 的濃度為橫坐標(biāo)，游離DNA1 的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，線性范圍0～120 μg/mL，檢出限5.456 μg/mL，如圖2（b）所示，明顯低于瓊脂糖凝膠電泳遷移方法（40.9 μg/mL）。

圖2 全自動毛細管凝膠電泳檢測CLF

只有CLF 的加入使得游離DNA 的峰面積明顯降低，表明該方法具有良好的特異性，如圖2（c）所示。并且熱變性的CLF，不會導(dǎo)致游離的DNA 序列的峰面積減少，如圖2（d）所示，表明該方法同樣可用于區(qū)分活性與熱變性乳鐵蛋白。此外毛細管凝膠電泳檢測時間更短（5 min），因此更適合于實際樣品CLF 的快速定量檢測。

2.4 實際乳品樣品檢測

為了驗證毛細管凝膠電泳遷移檢測方法的實際應(yīng)用，將其用于鮮駝乳、凍干駝乳粉、噴霧干燥駝乳粉以及UHT 處理的商業(yè)駝乳中CLF 含量的測定，如表1 所示。生駝乳中乳鐵蛋白含量為4.146 mg/mL，與文獻報道（＞5.1g/L）結(jié)果一致[23]。不同樣品的加標(biāo)回收率在90%～110%之間，表明所建立的方法具有較高的準(zhǔn)確性。不同熱加工工藝中CLF 含量為：生駝乳＞凍干駝乳粉＞噴霧干燥駝乳粉＞UHT 液態(tài)駝乳，如圖2（e）～2（f），符合預(yù)期[6-8]。因此，所建立的方法能夠反映出不同加工工藝的影響。該方法僅需簡單除脂與稀釋、無需復(fù)雜前處理就可實現(xiàn)乳制品中活性CLF 的定量檢測，可為駝乳制品生產(chǎn)過程中熱加工的營養(yǎng)價值評定提供參考。

表1 實際樣品中駝乳乳鐵蛋白的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了駝源乳鐵蛋白含量的快速凝膠電泳遷移檢測方法，進一步驗證了方法的通用性。該方法靈敏度高，操作簡單，避免了傳統(tǒng)儀器檢測乳鐵蛋白繁瑣的前處理過程，不依賴大型昂貴儀器，經(jīng)濟節(jié)約。同時，由于特異性的DNA 序列僅能夠結(jié)合非熱變性CLF，而不結(jié)合變性CLF，實現(xiàn)了乳及乳制品樣品中活性CLF 含量的直接檢測，因此可以用于各種特色乳制品熱加工工藝的精準(zhǔn)控制以及乳品營養(yǎng)價值評估。