張瑩凡, 呂昕昱, 肖瑀晗, 楊 露, 申光輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)健康重點(diǎn)實(shí)驗室(部省共建), 四川 雅安 625014)

生物被膜是細(xì)菌菌體被自分泌的胞外多糖、蛋白質(zhì)、核酸等基質(zhì)大分子聚合物包裹構(gòu)成的高度結(jié)構(gòu)化的細(xì)菌群體[1],難以徹底殺滅和清除,給食品安全生產(chǎn)和流通帶來嚴(yán)重威脅[2]。因此,開發(fā)高效安全的生物被膜控制技術(shù),對保障食品安全生產(chǎn)和品質(zhì)穩(wěn)定具有重要意義。

植物精油作為天然來源的抗菌分子資源,在食品抗菌保鮮技術(shù)領(lǐng)域備受關(guān)注[3-4]。藤椒是花椒屬竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的果實(shí),富含芳樟醇、檸檬烯等組分。藤椒精油具有良好的抗菌抗生物被膜活性。Manoharan等[5]研究發(fā)現(xiàn),芳樟醇可抑制白色念珠菌生物被膜的形成;Park等[6]發(fā)現(xiàn),檜烯通過抑制致齲毒力因子來抑制變形鏈球菌的生物被膜及其細(xì)胞黏附能力;Subramenium等[7]證實(shí)了檸檬烯通過結(jié)合鏈球菌表面相關(guān)毒力因子來抑制生物被膜的形成。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)DY1a是非發(fā)酵豆制品的優(yōu)勢腐敗菌,具有抗逆性強(qiáng)[8]、代謝產(chǎn)生有毒生物胺[9]、生物被膜形成速度快[10]等特點(diǎn),給生產(chǎn)設(shè)備清洗消毒和產(chǎn)品貯藏安全帶來了嚴(yán)重威脅。本團(tuán)隊前期研究表明,藤椒精油對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物被膜的形成具有良好的抑制效果[11],但由于藤椒精油的組分復(fù)雜性及細(xì)菌生物被膜調(diào)控通路的多樣性,目前對藤椒精油抗細(xì)菌生物被膜的分子作用機(jī)理了解不夠深入。

分子對接是采用計算機(jī)輔助分子模擬技術(shù),對活性小分子與靶點(diǎn)分子之間的作用模式、結(jié)合位點(diǎn)和影響因素等進(jìn)行預(yù)測的虛擬研究手段[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)等多學(xué)科為理論基礎(chǔ),利用互作網(wǎng)絡(luò)和可視化等技術(shù)揭示生命活動與活性藥物分子之間互作機(jī)理的學(xué)科[13-14]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、活性物質(zhì)篩選及功能食品分子挖掘等領(lǐng)域凸顯出良好的方法學(xué)優(yōu)勢[15-16]。

本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),揭示藤椒精油抑制解淀粉芽孢桿菌生物被膜的關(guān)鍵潛在活性分子及其胞內(nèi)作用靶點(diǎn),并驗證關(guān)鍵小分子的抗生物被膜活性,以解析藤椒精油抗細(xì)菌生物被膜的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌DY1a,四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院。氯化鈉、甲醇、結(jié)晶紫、草酸銨、無水乙醇、冰乙酸、吐溫-80,均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;金合歡醇乙酸酯(色譜純)、反式金合歡醇(色譜純),上海邁瑞爾生化科技有限公司。肉湯培養(yǎng)基(LB)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-211B型恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造有限公司;QL-901型渦旋儀,江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;ST16R型高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash型熒光酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1藤椒精油主要組分的收集整理

以“ZanthoxylumarmatumDC. essential oil”和“藤椒精油”為主要關(guān)鍵詞檢索中外相關(guān)研究文獻(xiàn),整理收集后得到藤椒精油小分子相關(guān)信息,通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載小分子sdf格式文件,構(gòu)建藤椒精油主要組分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.3.2潛在靶點(diǎn)的篩選與小分子-潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藤椒精油小分子sdf格式文件上傳至PharmMapper反向?qū)臃?wù)器(http:∥www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)進(jìn)行小分子-靶點(diǎn)分子對接,以標(biāo)準(zhǔn)化得分(normalized fit score)大于0.4為選擇指標(biāo)進(jìn)行潛在作用靶點(diǎn)初篩,STITCH數(shù)據(jù)庫(http:∥stitch.embl.de/)尋找靶點(diǎn)作補(bǔ)充。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)查找篩選結(jié)果的基因名(gene name)。通過產(chǎn)生物被膜菌株BacillusamyloliquefaciensL-17基因組(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP074391.1)[17]進(jìn)一步查詢篩選得到與解淀粉芽孢桿菌有關(guān)的靶點(diǎn)。

根據(jù)藤椒精油小分子與潛在靶點(diǎn)的關(guān)系制作網(wǎng)絡(luò)(network)文件和類型(type)文件,將2個文件導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI(蛋白相互作用)網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3KEGG和GO靶點(diǎn)通路分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org/)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集,分析藤椒精油小分子與靶點(diǎn)結(jié)合過程中可能影響的生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。通過京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,獲得藤椒精油小分子與靶點(diǎn)結(jié)合過程中的潛在信號通路。使用Chiplot在線可視化工具(https:∥www.chiplot.online/)繪制GO功能富集與KEGG通路分析氣泡圖。

1.3.4核心靶點(diǎn)的篩選

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STITCH (http:∥stitch.embl.de/)數(shù)據(jù)庫,以置信度大于0.9為選擇指標(biāo)[16],得到潛在靶點(diǎn)分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖,下載tsv格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,通過互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得潛在靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值、特征向量中心性、介數(shù)中心度和接近中心度的平均值,以大于各節(jié)點(diǎn)的平均值為標(biāo)準(zhǔn)獲得核心靶點(diǎn)。

1.3.5藤椒精油小分子與核心靶點(diǎn)的分子對接

通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點(diǎn)的一級結(jié)構(gòu)序列信息,提交至SWISS-MODEL在線服務(wù)器(https:∥swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白3D建模。以核心靶點(diǎn)為受體,藤椒精油小分子為配體,利用基于AutoDock Vina 軟件的CB-DOCK2在線分子對接服務(wù)器(https:∥cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)依次進(jìn)行對接位口袋檢測和盲對接,配體分子通過加氫和部分電荷處理,并由RDKit生成初始3D構(gòu)象。受體蛋白質(zhì)缺失的側(cè)鏈原子和氫原子的添加,去除結(jié)晶水等操作均由在線服務(wù)器采用OpenBabel和MGL程序工具自動處理[18]。對接結(jié)合能以AutoDock Vina score函數(shù)[19]計算并表示,單位kJ/mol。采用Discovery Studio 2021對最佳對接復(fù)合物進(jìn)行相互作用分析和可視化[20]。

1.3.6潛在小分子抗生物被膜活性的驗證

1.3.6.1 培養(yǎng)基制備

TSBS培養(yǎng)基:A液為胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(30.0 g/L),B液為豆?jié){粉(50.0 g/L)。將滅菌后的A、B液按體積比1∶1混合均勻。A液121 ℃滅菌15 min,B液115 ℃滅菌20 min。

1.3.6.2 細(xì)菌生物被膜的培養(yǎng)

將本課題組實(shí)驗室保存的解淀粉芽孢桿菌DY1a[8]接種至LB培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,4 ℃、4 000 r/min 離心10 min,棄去培養(yǎng)基,PBS緩沖液輕輕沖洗菌體沉淀3次,并調(diào)節(jié)菌懸液600 nm吸光度至0.10。根據(jù)小分子化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力,綜合考慮小分子化合物的可獲得性,選擇金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇進(jìn)行抗生物被膜活性驗證。用體積分?jǐn)?shù)0.20%的吐溫-80進(jìn)行乳化,分別加入到滅菌TSBS培養(yǎng)基[11],再接入制備好的菌懸液,使2種小分子化合物最終添加體積比分別為0.32、0.64、1.28 μL/mL,初始接菌量為106CFU/mL,同時以未添加精油組分培養(yǎng)體系為對照組,用渦旋儀混合均勻后分裝至5 mL的滅菌小燒杯,用封口膜封口,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,觀察生物被膜形成情況并拍照。

1.3.6.3 生物被膜的定量檢測

1.3.6.4 細(xì)菌運(yùn)動能力測定

參考楊露等[10]的方法并略加修改。配制金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇添加體積比分別為0.32、0.64、1.28 μL/mL的泳動、叢集TSB培養(yǎng)基,泳動培養(yǎng)基瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.475%,叢集培養(yǎng)基瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.600%,同時以未添加精油組分的TSB培養(yǎng)基為對照組。泳動實(shí)驗:待泳動培養(yǎng)基凝固后,在培養(yǎng)基中心滴入5 μL 106CFU/mL的菌懸液,待菌液吸干,37 ℃培養(yǎng)24 h,測量泳動圈直徑大小。叢集實(shí)驗:待叢集培養(yǎng)基凝固后,用接種針挑取少量單菌落刺入培養(yǎng)基中心,37 ℃培養(yǎng) 24 h,測量泳動圈直徑大小,并按式(1)計算藤椒精油小分子對細(xì)菌泳動或叢集運(yùn)動的抑制率。

(1)

式(1)中,A1為對照組泳動或叢集圈面積;A2為處理組泳動或叢集圈面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)利用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示存在顯著性差異。采用Cytoscape軟件繪制互作網(wǎng)絡(luò),采用Chiplot在線可視化工具繪制富集分析圖和分組對接結(jié)合能的2D熱圖,采用Origin Pro 2019軟件繪制生物被膜定量實(shí)驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤椒精油主要組分

通過Web of Science和CNKI等國內(nèi)外學(xué)術(shù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫檢索整理,共收集到60種藤椒精油組分,見表1。

表1 藤椒精油主要化學(xué)組分

2.2 藤椒精油小分子的潛在靶點(diǎn)篩選

通過PharmMapper、L-17基因組信息的尋找和篩選,以標(biāo)準(zhǔn)化得分大于0.4為標(biāo)準(zhǔn),共得到54種藤椒精油小分子對應(yīng)的720個潛在靶點(diǎn),去除重復(fù)得到133個靶點(diǎn)。用STITCH 數(shù)據(jù)庫共篩選到18種藤椒精油小分子對應(yīng)的56個靶點(diǎn)。合并整理2個數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn),使用Cytoscape軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析,獲得藤椒精油小分子-潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)(圖1)。

黃色矩形節(jié)點(diǎn)代表藤椒精油小分子;橙色圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn),顏色越深表示拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)值越大。圖1 藤椒精油小分子-潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Interaction network of Zanthoxylum armatum DC. essential oil compounds-potential targets

藤椒精油60種化合物中有54種小分子與潛在靶點(diǎn)存在互作關(guān)系,且絕大部分精油小分子存在多個潛在靶點(diǎn),表明藤椒精油小分子作用的多靶點(diǎn)性。

2.3 潛在靶點(diǎn)功能富集分析

藤椒精油組分的133個潛在抗生物被膜作用靶點(diǎn)的GO富集和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果見圖2。由圖2(a)可知,GO富集分析共獲得了17條GO二級條目,包含生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分。藤椒精油小分子與相關(guān)潛在靶點(diǎn)的作用可能與細(xì)胞代謝過程(cellular metabolic process)、初級代謝過程(primary metabolic process)等生物學(xué)過程,離子結(jié)合(ion binding)、小分子結(jié)合(small molecule binding)等分子功能,及細(xì)胞內(nèi)(intracellular)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)等細(xì)胞組分有關(guān)。這些涉及生物代謝過程、分子結(jié)合功能及細(xì)胞組分構(gòu)建的核心靶點(diǎn),在藤椒精油調(diào)節(jié)細(xì)菌生物被膜發(fā)育和形成過程中起著重要作用。

氣泡大小與富集的靶點(diǎn)基因數(shù)目成正比,氣泡顏色由藍(lán)變紅代表富集的顯著程度提高。圖2 潛在靶點(diǎn)的GO和KEGG通路富集分析Fig.2 GO and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets

進(jìn)一步對解淀粉芽孢桿菌的133個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析,得到排名前8的顯著富集信號通路[圖2(b)],表明藤椒精油小分子與相關(guān)潛在靶點(diǎn)的作用可能與次級代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、不同環(huán)境下的微生物代謝(microbial metabolism in diverse environments)等二級代謝通路有關(guān)。在三級代謝通路中,精油活性分子與相關(guān)潛在靶點(diǎn)的作用主要涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine, aspartate and glutamate metabolism),甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine, serine and threonine metabolism),及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成(phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis)等相關(guān)代謝通路。

2.4 藤椒精油小分子的核心靶點(diǎn)篩選

為獲得藤椒精油組分中抗生物被膜的關(guān)鍵核心靶點(diǎn),進(jìn)一步通過STITCH數(shù)據(jù)庫,以置信度大于0.9為標(biāo)準(zhǔn),獲得潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3)。圖3中涉及節(jié)點(diǎn)數(shù)126、邊數(shù)70、平均節(jié)點(diǎn)數(shù)1.11。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)篩選節(jié)點(diǎn)度值、特征向量中心性、介數(shù)中心度、接近中心度值大于平均數(shù)的核心靶點(diǎn),分別為GuaA、GltA、PurF、GlyA、CarB、OdhA、PdhD、FolD,核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)見表2。利用表2繪制核心靶點(diǎn)的PPI互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖4。

圖3 潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Interactions network of potential targets

圖4 生物被膜形成密切相關(guān)的核心靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Interaction network of core targets closely associated with biofilm formation

表2 核心靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

2.5 藤椒精油小分子與核心靶點(diǎn)分子對接分析

為驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測研究結(jié)果的可靠性,將8個核心靶點(diǎn)3D模型pdb文件及與核心靶點(diǎn)存在互作的21種藤椒精油活性分子的sdf文件,提交至CB-DOCK2在線服務(wù)器依次進(jìn)行分子對接,對接結(jié)合能的2D熱圖見圖5。由圖5可知,大部分對接結(jié)合能均小于等于-20.93 kJ/mol,表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可靠性較高[22]。其中桉葉醇與OdhA、CarB、PurF結(jié)合能分別為-28.88、-31.81、-31.81 kJ/mol,金合歡醇乙酸酯與OdhA、CarB、PurF結(jié)合能分別為-32.23、-29.72、-31.39 kJ/mol,反式法尼醇與OdhA、CarB、PurF結(jié)合能分別為-31.39、-29.72、-28.88 kJ/mol,表明桉葉醇、金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇與靶點(diǎn)OdhA、CarB、PurF相互間結(jié)合能力較強(qiáng),進(jìn)一步證明這些靶點(diǎn)是藤椒精油發(fā)揮抗生物被膜活性的核心靶點(diǎn)。

圖5 藤椒精油活性分子與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)合能的2D熱圖Fig.5 2D Heatmap of molecular docking binding energy of Zanthoxylum armatum DC.essential oil compounds and core targets

為進(jìn)一步分析精油活性分子與核心靶點(diǎn)的相互作用情況,選擇藤椒精油活性分子與核心靶點(diǎn)結(jié)合較穩(wěn)定的對接復(fù)合物,繪制分子對接相互作用圖,部分藤椒精油活性分子與核心靶點(diǎn)之間的相互作用見圖6,形成穩(wěn)定對接構(gòu)象的結(jié)合口袋組成氨基酸殘基、口袋體積和氫鍵數(shù)量見表3。圖6(a)表明,反式法尼醇能夠同CarB的關(guān)鍵氨基酸殘基GLY175、GLU299形成典型氫鍵,同時與THR173形成非典型氫鍵(碳?xì)滏I),與ILE298、LEU210、ILE167、MET240、ALA144、ARG169、HIS243、PRO170通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用。圖6(b)表明,金合歡醇乙酸酯能夠同CarB的關(guān)鍵氨基酸殘基SER935形成典型氫鍵,同時與LEU895、LEU907、TYR1040、ALA793、PHE928通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用。圖6(c)表明,反式法尼醇主要與OdhA的氨基酸殘基LEU323、LEU659、VAL695、HIS260、HIS322、HIS460通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用,與PHE689通過π-σ疏水堆積作用連接,配體與受體間無氫鍵作用。圖6(d)表明,金合歡醇乙酸酯能夠與OdhA的關(guān)鍵氨基酸殘基GLN363、LEU323形成典型氫鍵,同時與GLU661形成非典型氫鍵(碳?xì)滏I),與LEU659、ALA359、ALA358、HIS260、HIS460通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用,與PHE689通過π-σ疏水堆積作用連接。圖6(e)表明,反式法尼醇能夠同PurF鏈A中的關(guān)鍵氨基酸殘基LEU99形成典型氫鍵,與鏈C中的氨基酸殘基LEU99通過烷基產(chǎn)生疏水相互作用,同時與氨基酸殘基LEU98、TYR92、LYS56、PHE100通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用。圖6(f)表明,金合歡醇乙酸酯能夠同PurF的關(guān)鍵氨基酸殘基LEU99、LYS56形成典型氫鍵,同時與氨基酸殘基TYR92通過π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用。

PdhD與桉葉油醇結(jié)合能較弱,桉葉油醇能與PdhD的氨基酸殘基通過烷基或π-烷基產(chǎn)生疏水相互作用,但無典型氫鍵。GltA與棕櫚酸乙酯和棕櫚烯酸結(jié)合能也較弱,棕櫚酸乙酯和棕櫚烯酸與GltA的氨基酸殘基雖存在典型氫鍵,但存在鹽橋和靜電相互作用力。而結(jié)合能高的靶點(diǎn)-小分子復(fù)合物中不存在鹽橋和靜電相互作用力,因此推測鹽橋和靜電相互作用力可能會影響分子的幾何構(gòu)型,導(dǎo)致對接結(jié)合能較低。

2.6 藤椒精油小分子抗生物被膜活性驗證結(jié)果

根據(jù)虛擬計算對接結(jié)果,選擇金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇進(jìn)行抗生物被膜活性驗證。圖7是解淀粉芽孢桿菌DY1a在添加0.32、0.64、1.28 μL/mL金合歡醇乙酸酯或反式法尼醇的TSBS培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h 后形成的氣液界面生物被膜。由圖7可知,對照組氣液面生物被膜較為致密厚實(shí),且在空氣一側(cè)形成了明顯的肉眼可見的皺褶。添加金合歡醇乙酸酯的培養(yǎng)基界面雖形成了明顯的生物被膜,但生物被膜較單薄松散,且無肉眼可見的皺褶,易被外界機(jī)械力分散破壞,表明藤椒精油活性分子金合歡醇乙酸酯在實(shí)驗體積比范圍內(nèi)對菌株生物被膜的發(fā)育和成熟均有良好的延緩作用。添加不同體積比的金合歡醇乙酸酯對菌株生物被膜的抑制活性無明顯差異,而添加1.28 μL/mL反式法尼醇的培養(yǎng)體系氣液界面未見明顯的生物被膜形成,表明在該體積比下反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a氣液面生物被膜的形成具有完全抑制作用。

圖7 金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物被膜的抑制作用Fig.7 Antibiofilm effects of farnesol acetate and trans-farnesol on Bacillus amyloliquefaciens DY1a

通過結(jié)晶紫染色法進(jìn)一步對不同培養(yǎng)條件下形成的生物被膜進(jìn)行定量分析,結(jié)果見圖8。由 圖8 可知,添加金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇的培養(yǎng)基形成的生物被膜生物量(以O(shè)D595 nm表示)均低于對照組,說明這2種化合物對于解淀粉芽孢桿菌DY1a氣液面生物被膜生長均有抑制活性。在1.28、0.64 μL/mL 條件下,添加反式法尼醇的培養(yǎng)基的生物被膜形成量低于添加相同體積比的金合歡醇乙酸酯的培養(yǎng)基的生物被膜生物量,說明反式法尼醇的抗生物被膜活性強(qiáng)于金合歡醇乙酸酯。

*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。圖8 生物被膜定量結(jié)果Fig.8 Results of biofilm biomass quantification

細(xì)菌運(yùn)動能力測定結(jié)果見圖9、表4。隨著精油組分添加量的提高,細(xì)菌泳動圈直徑逐漸減小,表明金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動能力均有抑制作用。與泳動結(jié)果相似,叢集圈直徑也隨著精油組分含量的升高而減小,表明金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇對細(xì)菌叢集能力均有抑制作用。在相同添加量下,添加反式法尼醇的叢集培養(yǎng)基形成的叢集圈直徑比添加金合歡醇乙酸酯的叢集培養(yǎng)基形成的叢集圈直徑小,表明反式法尼醇抑制細(xì)菌叢集的能力強(qiáng)于金合歡醇乙酸酯。添加1.28 μL/mL反式法尼醇的TSB培養(yǎng)基無肉眼可見叢集圈生成,表明該添加量能完全抑制叢集圈的形成,與結(jié)晶紫結(jié)果一致。

圖9 金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動和叢集能力的抑制作用Fig.9 Inhibitory effects of farnesol acetate and trans-farnesol on swimming and swarming motilities of Bacillus amyloliquefaciens DY1a

表4 金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動和叢集能力的抑制率

3 討 論

藤椒精油對解淀粉芽孢桿菌氣液界面生物被膜的形成具有良好的抑制與清除活性,在食源性致病菌和腐敗菌生物被膜綠色防控領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力[11]。細(xì)菌生物被膜形成過程復(fù)雜,涉及菌體黏附能力、運(yùn)動能力和胞外基質(zhì)多糖和蛋白質(zhì)合成分泌等過程[2,23]。同時,植物精油組分復(fù)雜,不同化合物可能在抗生物被膜形成方面發(fā)揮不同的生物活性功能[4]。因此,采用常規(guī)實(shí)驗方法逐一分析精油單一組分的抗生物被膜活性及相關(guān)機(jī)理是一項十分龐大的研究工作,往往難以找到切入點(diǎn)和突破口。為進(jìn)一步闡明藤椒精油抗細(xì)菌生物被膜的分子機(jī)理,本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接技術(shù),從分子層面解析精油中起抗生物被膜作用的關(guān)鍵活性組分及其胞內(nèi)作用靶點(diǎn)。

溫澤文等[24]的研究表明,奧替溴銨通過抑制細(xì)菌初級代謝,降低其蛋白質(zhì)合成能力從而表現(xiàn)出良好的生物被膜抑制效應(yīng);黃寧[25]通過Pathway分析發(fā)現(xiàn),次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸的生物合成、各種環(huán)境中的微生物代謝通路與細(xì)菌生物被膜的形成有關(guān);劉琳等[26]發(fā)現(xiàn),某些信號分子可以調(diào)控一些次級代謝,從而維持細(xì)菌生物被膜結(jié)構(gòu);Pisithkul等[27]發(fā)現(xiàn)生物被膜的生長與初級生物合成途徑、發(fā)酵途徑和次級代謝的代謝有關(guān),生物被膜生長過程中三羧酸循環(huán)的活性會增強(qiáng)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法同代謝通路富集分析相結(jié)合,揭示了藤椒精油小分子是通過影響細(xì)胞代謝和生物合成等生物功能,以及通過多靶點(diǎn)-多成分-多通路來抑制解淀粉芽孢桿菌生物被膜的形成。

同時,本研究采用分子對接技術(shù),驗證了藤椒精油中金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇、桉葉醇、茴香醚、檸檬烯等21種主要活性組分與解淀粉芽孢桿菌DY1a的8個核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力及相互作用模式,結(jié)果表明,大部分對接復(fù)合物結(jié)合能低于-20.93 kJ/mol,其中金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇與OdhA、CarB和PurF 這3個靶點(diǎn)的結(jié)合能力強(qiáng)于其他靶點(diǎn)。OdhA是三羧酸循環(huán)中2-氧代戊二酸脫氫酶復(fù)合物的組分之一,該復(fù)合物在催化2-氧代戊二酸氧化脫羧為琥珀酰輔酶A過程中起著重要作用[28];PurF為谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸鹽酰胺轉(zhuǎn)移酶,作為嘌呤生物合成關(guān)鍵酶,可促進(jìn)鉀離子的依賴性擴(kuò)散,從而對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出菌落的廣泛擴(kuò)散效應(yīng)[29];CarB為精氨酸特異性氨甲酰磷酸合成酶,是柑橘黃單胞菌泳動和生物被膜形成必需的基因[30]。因此,藤椒精油活性分子通過與OdhA、PurF、CarB等靶點(diǎn)結(jié)合,從而干擾與生命活動相關(guān)的大分子合成代謝,最終抑制細(xì)菌生物被膜的形成和成熟。

結(jié)果表明,金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇在實(shí)驗添加量范圍內(nèi)對菌株生物被膜的發(fā)育和成熟均有良好的延緩作用。同時在相同添加量下反式法尼醇的抗生物被膜活性強(qiáng)于金合歡醇乙酸酯。然而,分子對接結(jié)果顯示,金合歡醇乙酸酯結(jié)合的核心靶點(diǎn)數(shù)目更多。這可能是由于金合歡醇乙酸酯對部分調(diào)控靶點(diǎn)的基因表達(dá)存在上調(diào)作用,致使金合歡醇乙酸酯抑制生物被膜的總體活性比反式法尼醇低。從細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制層面進(jìn)行分析,金合歡醇乙酸酯可能需要與多種信號分子的含量同時達(dá)到閾值,才可協(xié)調(diào)調(diào)控與生物被膜形成有關(guān)的基因表達(dá)[31]。同時,由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于已有實(shí)驗研究證據(jù)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測分析,可能還存在一些尚未研究解析的生物被膜靶點(diǎn)與反式法尼醇具有更強(qiáng)的結(jié)合能力。分子對接環(huán)境與實(shí)際生命代謝胞內(nèi)環(huán)境存在差異也會導(dǎo)致分子對接和生物被膜活性驗證結(jié)果存在差異。盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)存在一些不足,但在當(dāng)前技術(shù)條件下,仍然值得被用于復(fù)雜生命代謝活動有關(guān)機(jī)理的輔助解析工作。

4 結(jié) 論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),對藤椒精油抗解淀粉芽孢桿菌生物被膜作用的關(guān)鍵活性分子、關(guān)鍵靶點(diǎn)、代謝通路信息和拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,共篩選出21種主要精油活性組分及8個核心靶點(diǎn),證明了藤椒精油抗細(xì)菌生物被膜的多組分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。結(jié)合分子對接技術(shù),驗證了3種藤椒精油活性組分桉葉醇、金合歡醇乙酸酯、反式法尼醇可通過氫鍵、疏水作用與核心靶點(diǎn)OdhA、CarB、PurF結(jié)合。抗生物被膜活性實(shí)驗驗證結(jié)果進(jìn)一步表明,金合歡醇乙酸酯和反式法尼醇對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物被膜的形成和細(xì)菌運(yùn)動能力具有顯著抑制活性。研究結(jié)果希望為藤椒精油抗細(xì)菌生物被膜的胞內(nèi)分子機(jī)理提供新的見解,同時為利用藤椒精油開發(fā)抗細(xì)菌生物被膜新策略奠定理論依據(jù)。