黃志遠, 董文明, 田 洋, 黃艾祥, 王雪峰

(云南農業(yè)大學 食品科學技術學院, 云南 昆明 650201)

近年來,食品安全已成為全球公共衛(wèi)生關注的焦點問題。微生物污染是最常見的食品安全問題之一,可引起食品腐敗和食源性疾病,從而影響人類的健康,并造成巨大的經濟損失[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種革蘭氏陽性共生細菌[2],作為世界上第三大食源性致病菌,可引起菌血癥、敗血癥等疾病[3],在中國超過25%的食源性疾病都與S.aureus有關[4]。而導致感染的毒力因子受細菌生長階段的調控,細菌在早期對數期時會產生細胞因子,這些因子使細菌能夠逃避宿主的防御并建立生物膜[5]。生物膜是一種具有良好結構和多樣性的動態(tài)細菌胞外聚集物,對抗生素的耐藥性是原菌株的10～1 000倍[6]。因此,有必要尋找新型抑制劑進一步抵抗細菌生物膜的形成。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一類具有天然生物活性的多肽,對細菌、病毒、真菌都有抑制作用[7]。它們是生物體(如兩棲動物、哺乳動物、昆蟲和植物)用來對抗病原體入侵的天然免疫屏障,被稱為“第二防御系統(tǒng)”[8]。與傳統(tǒng)抗生素不同,AMPs具有多靶點的抑菌機制,一些AMPs可以通過破壞細胞壁膜、作用于DNA和RNA、抑制蛋白質合成以及增加細胞內活性氧的水平來發(fā)揮作用,因此不易產生耐藥性[9]。并且AMPs對環(huán)境友好,具有良好的穩(wěn)定性,可以在食品工業(yè)中作為一種新型食品防腐劑保存原料與產品[10]。同時,有研究表明,一些AMPs可以有效抑制生物膜的形成,甚至對成熟的生物膜造成破壞[11]。如來自舌蘭蛙的抗菌肽brevin-gr23可顯著抑制胞外多糖的產生、金黃色葡萄球菌生物膜的附著和形成[12]。螺旋肽G3可以在不同階段干擾變形鏈球菌生物膜的形成,在初始階段,G3通過降低細菌表面電荷、疏水性、膜完整性和黏附相關基因轉錄來抑制細菌黏附;在后期,G3與胞外聚合物中的胞外DNA(eDNA)相互作用,破壞成熟生物膜的3D穩(wěn)定性結構,從而分散它們[13]。

MOp2和MOp3是本課題組前期從辣木籽蛋白水解物中分離鑒定到的2種新型陰離子抗菌肽。MOp2相對分子質量為907.06,MOp3相對分子質量為712.81,都帶1個負電荷,固體狀態(tài)下結構以β-轉角為主,具有良好的穩(wěn)定性,使用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理1 h后仍保留70%以上的活性。它們對S.aureus表現出了良好的抑菌活性,并且對S.aureus造成一定的膜損傷[14-15]。但MOp2、MOp3是否會對S.aureus的生物膜產生抑制作用鮮有研究。因此,本研究擬通過分析MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的形成能力以及成熟生物膜的影響,結合分子對接技術解析2種辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S.aureus(CICC 10384),中國工業(yè)培養(yǎng)收集中心。結晶紫(分析純)、DAPI熒光染料(分析純),中國碧云天生物技術有限公司;刃天青(分析純),中國索萊寶科技有限公司。MOp2(肽序列:HVLDTPLL)、MOp3(肽序列:HVLDTPLL),肽段純度98%以上,安徽省國平藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan Go型酶標儀,美國Thermo Scientific公司;Dmi3000B型熒光顯微鏡,德國Carl Zeiss AG公司;DHp-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;TGL20M型臺式高速離心機,北京中興偉業(yè)儀器有限公司;LDZM-60KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1S.aureus生物膜形成能力測定

參照Ommen等[16]方法并稍加修改。在24孔板中分別加入2 mL無菌胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSB)和體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL),在37 ℃下分別培養(yǎng)4、8、12、24、48、72、96、120 h。培養(yǎng)完成后,棄去培養(yǎng)基,并用PBS清洗以除去浮游細菌。然后向各孔添加500 μL甲醇,固定1 h后棄去甲醇并用PBS洗滌。向各孔加入體積分數1%結晶紫染色15 min后用PBS洗滌。干燥后,加入200 μL乙醇-丙酮溶液(體積比4∶1),然后在595 nm處測定吸光度。

1.3.2辣木籽抗菌肽處理后S.aureus最小抑制生物膜質量濃度和最小清除生物膜質量濃度測定

參照Zhang等[17]方法并稍加修改。最小抑制生物膜質量濃度(MBIC)測定:在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL),隨后加入抗菌肽,使之終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL,37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜。然后在每孔中加入噻唑藍(MTT)溶液20 μL(5 mg/mL),2 h后吸去上清液,用PBS清洗以除去游離菌,乙醇脫色后測定OD570 nm。以無菌TSB孔為空白對照組,OD值與空白組相比無顯著變化的最小質量濃度定為MBIC。最小清除生物膜質量濃度(MBEC)測定:生物膜在24孔板中培養(yǎng)完成后,用PBS洗去游離菌,加入與測定MBIC相同質量濃度的抗菌肽,然后在37 ℃下培養(yǎng)24 h。MTT染色后測定OD570 nm,OD值與對照組相比無明顯變化的最小質量濃度定為MBEC。

1.3.3辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的清除作用測定

參照Ommen等[16]方法并稍加修改。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)。37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并使用無菌PBS清洗,然后加入MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)12 h。在0、2、4、6、8、10、12 h時,參照1.3.1節(jié)中結晶紫染色法測定各組樣品的OD595 nm。

1.3.4辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜微觀形態(tài)的變化

參照Lin等[18]方法并稍加修改。在6孔板中分別加入5 mL無菌TSB、體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)及1片無菌蓋玻片(2 cm×2 cm)。37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并使用無菌PBS清洗,然后加入MOp2與MOp3(4 mg/mL),空白對照組中加入無菌水。37 ℃培養(yǎng)12 h后,取出蓋玻片,并加入DAPI(10 μg/mL)在黑暗中染色20 min,隨后用熒光顯微鏡觀察生物膜結構。

1.3.5辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜內細菌新陳代謝的變化

將不銹鋼片(1 cm×1 cm)在體積分數75%乙醇中浸泡24 h,并超聲處理1 h以除去表面雜質。隨后用無菌去離子水徹底清洗,并將不銹鋼片121 ℃高壓滅菌30 min備用。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB、體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)及1片滅菌不銹鋼片。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并用無菌PBS清洗,然后加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水。處理4 h,取出不銹鋼片置于無菌均質袋,加入10 mL PBS超聲15 min,使生物膜細菌從不銹鋼片上分離并收集菌懸液,在菌懸液中加入體積分數10%的刃天青溶液,37 ℃黑暗中振蕩2 h,4 ℃下10 000 r/min離心10 min取得上清液,用酶標儀分別檢測其在560 nm激發(fā)波長和590 nm發(fā)射波長處的熒光值。

1.3.6辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜初期形成的變化

1.3.6.1 細菌初期黏附實驗

參照Bai等[19]方法并稍加修改。體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)接種于含3 mL葡萄糖(質量分數0.5%)、氯化鈉(質量分數3%)的腦心浸液培養(yǎng)基中,并加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)至對數期。以5 000 r/min冷凍離心5 min,得細菌沉淀物,將細菌沉淀物置于37 ℃下,并加到含纖維蛋白原的96孔板中,孵育1 h后,用體積分數25%的甲醛固定,然后進行結晶紫染色,用酶標儀測定OD595 nm。相對黏附率計算見式(1)。

(1)

1.3.6.2 辣木籽抗菌肽處理后S.aureus表面疏水性的變化

體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)接種于3 mL的TSB肉湯,并加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)24 h。之后向試管中加入500 μL甲苯,劇烈旋轉3 min,然后靜止10 min,以獲得相分離。最后,仔細吸取下層水相,并在渦流前后測定600 nm處吸光度。疏水率計算見式(2)。

(2)

1.3.7辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜胞外聚合物的變化

1.3.7.1 酶解實驗

在48孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,培養(yǎng)后棄掉培養(yǎng)基。實驗共設置4組樣品,其中1組為空白組,其余3組為實驗組,每組設置10個復孔?？瞻捉M中加入無菌水,實驗組分別加入高碘酸鈉(10 μmol/L)、脫氧核糖核酸酶(2 mg/mL)和蛋白酶K(100 μg/mL)。將48孔板在37 ℃培養(yǎng)2 h,并用結晶紫染色。乙醇脫色30 min后,用酶標儀測定595 nm處的吸光度。

1.3.7.2 細菌胞外多糖含量測定

參照崔海英等[20]方法并稍加修改。將不銹鋼片(1 cm×1 cm)在體積分數75%的乙醇中浸泡24 h,并超聲處理1 h以除去表面雜質。隨后用無菌去離子水徹底清洗,并將不銹鋼片在121 ℃下高壓滅菌30 min備用。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB、體積分數1%的細菌菌懸液(108CFU/mL)及1片滅菌的不銹鋼片。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,培養(yǎng)開始時加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白組加入等量無菌水。培養(yǎng)完成后,棄去TSB,并用PBS沖洗以除去表面游離菌。將清洗后的不銹鋼片置于PBS中超聲處理1 h,收集菌懸液,10 000 r/min離心10 min取上清液作為胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)樣本備用。

采用苯酚-硫酸法測定上清液中胞外多糖的含量,將1 mL上清液和1 mL苯酚(50 g/L)溶液混合,混合均勻后振蕩30 s,之后加入15 mL硫酸(體積分數95%)溶液,在黑暗中反應15 min后,將溶液渦旋振蕩10 s,置于恒溫水浴中反應20 min。使用紫外分光光度計檢測溶液在490 nm處的吸光度,以分析胞外多糖的質量濃度。

1.3.7.3 細菌胞外蛋白含量測定

使用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白質含量。取1.3.7.2節(jié)中制備的EPS樣本40 μL于試管中,按照蛋白質加樣量(表1)加樣,靜置10 min,用酶標儀在波長595 nm處測定各管的吸光度,按式(3)計算蛋白質含量。

表1 蛋白質加樣量

(3)

1.3.7.4 細菌eDNA含量測定

按照1.3.7.2節(jié)中方法制備EPS樣本,使用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取EPS中eDNA后,使用酶標儀檢測260 nm處的吸光度,并根據吸光度計算eDNA含量。

1.3.8分子對接分析

對接使用的AgrA、LuxS、CshA、SarA蛋白質晶體結構從Uniprot數據庫中下載獲得,其中AgrA蛋白的PDB ID為6PRA,其余蛋白質為基于Alphafold預測的結構。MOp2、MOp3的3D結構采用PyMol 2.5.2構建,并保存為PDB格式。

采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接,在對接開始之前,使用PyMol 2.5.2對受體蛋白進行處理,包括去除水分子、鹽離子以及小分子。隨后設置對接盒子,使之包裹整個蛋白質結構。此外,使用ADFRsuite 1.03將所有處理好的小分子以及受體蛋白轉換為AutoDock Vina 1.1.2對接必需的PDBQT格式。對接時,全局搜索的詳盡度設為32,其余參數保持默認設置。打分最高的對接構象被認為是結合構象,最后使用PyMol 2.5.2對接結果進行可視化分析。

1.4 數據處理

實驗結果使用SPSS 26.0軟件分析,采用單因素方差分析和Bonferroni統(tǒng)計學檢驗來確定P<0.05的顯著性水平下的統(tǒng)計差異,數據表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 S. aureus生物膜的形成能力

S.aureus可以在食品原料或者食品加工機器表面形成生物膜。金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力見圖1。由圖1可知,隨著培養(yǎng)時間的延長,吸光度不斷上升,并且在48 h達到最高(1.78),表明此菌株有很強的生物膜形成能力,其結果判讀依據是OD595 nm>4ODc(ODc=0.08)為強生物膜形成株[21]。48 h時被認為是生物膜的成熟階段,生物膜復雜的三維結構完全形成,生物膜內細菌群也處于活躍狀態(tài)[22-23]。因此,在后續(xù)的實驗中,生物膜培養(yǎng)時間選擇為48 h。

圖1 金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力Fig.1 Biofilm forming ability of S. aureus

2.2 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜的MBIC和MBEC測定結果

辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MBIC和MBEC見圖2。由圖2可知,MOp2、MOp3對S.aureus的MBIC均為4 mg/mL,MBEC均為8 mg/mL。MOp2與MOp3的MBIC處于成熟生物膜抑制劑桉葉素(8 mg/mL)[24]與丁香精油(1 mg/mL)[17]之間,因此,MOp2、MOp3有望成為一種新型生物膜抑制劑。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖2 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MBIC和MBECFig.2 MBIC and MBEC of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S.aureus

2.3 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜的清除作用

MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的清除效果采用結晶紫半定量法測定,結果見圖3。空白組的吸光度在12 h內基本保持不變,實驗組的吸光度隨著MOp2、MOp3質量濃度的增加而減少,說明MOp2與MOp3的質量濃度越高對S.aureus生物膜的清除效果越好。1×MBIC的MOp2處理12 h后,生物膜清除率達到63.28%,2×MBIC時生物膜清除率達到80.56%。1×MBIC的MOp3處理12 h后,生物膜清除率達到67.90%,2×MBIC時生物膜清除率達到81.64%,進一步說明MOp2、MOp3可以有效清除生物膜且呈現一定的劑量依賴性。

圖3 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜的清除效果Fig.3 Clearance effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S. aureus biofilm

2.4 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜微觀形態(tài)的影響

為了研究MOp2、MOp3對S.aureus生物膜形態(tài)結構的影響,采用熒光顯微鏡對菌體結構進行了微觀觀察,見圖4。由圖4可知,空白組[圖4(a)]生物膜結構完整、立體,處理組[圖4(b)至圖4(e)]熒光強度明顯下降,生物膜三維結構解體,大多呈游離狀態(tài)分散在玻片表面。結果表明:MOp2、MOp3能破壞S.aureus的生物膜立體結構,導致細菌死亡,這與Reis-Teixeira等[25]的研究結果一致。

圖4 金黃色葡萄球菌生物膜經辣木籽抗菌肽處理前后的熒光顯微照片Fig.4 Fluorescence micrographs of S. aureus biofilm before and after treatment with Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides

2.5 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜內細菌新陳代謝的影響

細菌的新陳代謝能力一定程度上能反映出菌體細胞的活力。刃天青具有熒光強度,能夠穿透細胞膜,通過不同細菌氧化還原酶的作用降解為高熒光強度的中間產物試鹵靈。刃天青向試鹵靈轉化是不可逆的,并且這種轉化與參與代謝的細菌數量成正比,因此這種方法可以檢測細菌的生存能力[26]。

MOp2、MOp3對金黃色葡萄球菌生物膜新陳代謝的影響見圖5。由圖5可知,經過0.5×MBIC的MOp2與MOp3處理后,S.aureus生物膜的代謝活性明顯下降(P<0.05),分別下降了15.60%和20.62%;而經過1×MBIC的MOp2與MOp3處理后,S.aureus生物膜的代謝活性顯著下降了54.11%和62.34%。造成S.aureus生物膜代謝活性下降的原因可能是細菌代謝過程中能量傳遞的電子傳遞鏈主要位于細胞膜的內表面,細胞膜在受到抗菌肽的刺激和破壞后,能量代謝功能紊亂,因此代謝活性大大下降,同時先前的研究通過冷凍掃描電鏡也發(fā)現MOp2、MOp3可以破壞S.aureus的細胞壁膜結構[14-15]。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖5 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜新陳代謝的影響Fig.5 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm metabolism of S. aureus

2.6 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜黏附率的影響

生物膜初期形成階段主要依靠細菌細胞之間的黏附作用聚集到一起,此時細菌利用細胞壁錨定蛋白(CWA)附著于不同載體的表面[27]。本研究測定了MOp2、MOp3對S.aureus初期黏附的影響,見圖6。 由圖6可知,0.5×MBIC的MOp2與MOp3可以顯著抑制S.aureus的初始定值(P<0.05),黏附率分別下降了19.84%和24.04%;1×MBIC的MOp2與MOp3對S.aureus的黏附呈現了更好的抑制作用,黏附率分別下降了44.19%和50.77%;特別是在2×MBIC時,黏附率分別下降了74.45%和75.96%。結果表明:MOp2、MOp3對生物膜菌體的初期黏附能力具有抑制作用且呈現劑量依賴性,細菌初期黏附能力下降,生物膜的形成能力也隨之下降。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖6 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜黏附率的影響Fig.6 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm adsorption of S. aureus

2.7 辣木籽抗菌肽對S. aureus表面疏水性的影響

細胞表面疏水性與細菌黏附、生物膜的形成密切相關,細菌表面疏水性的降低可能會弱化生物膜的形成能力[28]。MOp2與MOp3對S.aureus表面疏水性的影響見圖7。由圖7可知,與空白組相比,在經過MOp2與MOp3處理后,細菌表面疏水性均有顯著下降(P<0.05),且與抗菌肽質量濃度呈正相關;在2×MBIC時,S.aureus的表面疏水性分別下降了71.94%和73.77%,這與楊露等[28]的研究結果一致。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖7 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜疏水性的影響Fig.7 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm hydrophobicity of S. aureus

2.8 辣木籽抗菌肽對S. aureus胞外聚合物的影響

2.8.1S.aureus生物膜組成分析

成熟的生物膜是附著的微生物群落,能夠抵抗外來分子(包括許多小分子抗菌劑)并導致持續(xù)感染[29]。生物膜的形成首先是細菌黏附到表面,然后是群體感應(QS)的聚集、菌落發(fā)育和EPS的分泌。其中,EPS具有一系列的功能,如作為支架和將生物膜細胞連接在一起[30]。同時,EPS還為生物膜提供了結構穩(wěn)定性,并維持了其代謝活性。使用高碘酸鈉、DNaseⅠ和蛋白酶分別水解多糖、DNA和蛋白質,測定胞外多糖、eDNA和胞外蛋白的含量,發(fā)現S.aureus生物膜中含量最高的是蛋白質(質量分數49.01%),其次是胞外多糖(質量分數39.73%)和eDNA(質量分數11.26%)。

2.8.2辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外多糖的影響

多糖是EPS中研究最多的成分,基于糖單體,多糖分為同多糖和雜多糖。EPS的含量在增長平穩(wěn)期開始時處于峰值,在指數階段和穩(wěn)定階段觀察到QS活性,QS系統(tǒng)的轉錄調控因子影響胞外多糖操縱子的轉錄調控因子,并控制胞外多糖的產生[31]。MOp2與MOp3對細菌胞外多糖含量的影響見圖8。在經過1×MBIC的MOp2與MOp3處理后,胞外多糖的含量出現顯著下降(P<0.05),分別下降了22.66%和27.39%;2×MBIC時,胞外多糖含量下降更為明顯?？赡艿脑蚴荕Op2與MOp3對S.aureus的QS系統(tǒng)造成影響,使胞外多糖合成受阻。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖8 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外多糖的影響Fig.8 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on extracellular polysaccharides of S. aureus biofilm

2.8.3辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外蛋白的影響

S.aureus的胞外聚合物中含量最高的為蛋白質,并且有研究對生物膜的EPS基質進行蛋白組學分析,發(fā)現存在一些毒力因子,它們是感染宿主的主要蛋白質[32],因此,探究MOp2與MOp3對細菌胞外蛋白分泌的影響尤為重要。辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影響見圖9。經過1×MIBC的MOp2、MOp3作用后,胞外蛋白的含量分別下降了48.05%和39.55%;經過2×MIBC的MOp2、MOp3作用后,胞外蛋白的含量分別下降了61.57%和54.54%。這說明MOp2與MOp3在很大程度上阻止了胞外蛋白的形成,并且明顯抑制了胞外蛋白的合成與分泌,這與Vazquez-Armenta等[33]的研究結果一致。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖9 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影響Fig.9 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on extracellular protein of S. aureus biofilm

2.8.4辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外DNA的影響

eDNA是S.aureus生物膜的功能成分,起初eDNA被認為是一種次要成分,主要與基因轉移的基因庫有關,但是最近有研究重新評估了其對生物膜形成的貢獻。eDNA通過細胞死亡和裂解釋放,主要發(fā)生在生物膜的內部,保護細菌免受抗菌劑和抗生素的影響[34],此外,eDNA還能促進細胞間的細胞黏附[35]。MOp2與MOp3對eDNA的影響見圖10。 在0.5×MBIC與1×MBIC時,生物膜eDNA的含量變化不顯著,在2×MBIC時,eDNA含量明顯下降(P<0.05),分別下降了為14.24%和17.55%,與Secchi等[36]的研究結果一致,說明MOp2與MOp3通過抑制eDNA的合成,破壞細菌的自我防御系統(tǒng)并導致生物膜無法黏附。

不同小寫字母表示組間數據差異顯著(P<0.05)。圖10 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜eDNA的影響Fig.10 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on eDNA of S. aureus biofilm

2.9 辣木籽抗菌肽與S. aureus生物膜形成關鍵蛋白的分子對接分析

QS系統(tǒng)在生物膜形成過程中起關鍵作用。QS系統(tǒng)中的AgrA蛋白對菌體生物膜的形成、毒力因子分泌等多種生物活性起調控作用[37]。CshA是一種細菌黏附蛋白,覆蓋在細菌細胞表面,細菌可以利用其附著在基質或者其他細菌上形成生物膜[38]。QS系統(tǒng)中AI-2信號分子的合成依賴LuxS蛋白酶。LuxS蛋白酶可以影響細菌形成生物膜以及其耐藥性[39]。葡萄球菌輔助調節(jié)因子(SarA)是重要的毒力基因調控因子,可調控約120個基因的表達,涉及QS系統(tǒng)、生物膜合成、耐藥性等眾多與S.aureus致病相關的生理過程[40]。這4種蛋白質在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用,使用分子對接技術可推測MOp2、MOp3是否與這4種蛋白質發(fā)生相互作用。

結合能表示對接的可能性,低于-20.92 kJ/mol通常被認為更有可能結合[41]。辣木籽抗菌肽與S.aureus生物膜形成關鍵蛋白的分子對接位點見表2。由表2可知,MOp2、MOp3與這4種蛋白的結合能均小于-20.92 kJ/mol。辣木籽抗菌肽與S.aureus生物膜形成關鍵蛋白的分子對接結果見圖11。 由圖11可知,MOp2通過3個氫鍵與AgrA結合,MOp3通過6個氫鍵與AgrA結合;MOp2通過3個氫鍵與CshA結合,MOp3通過6個氫鍵與CshA結合;MOp2通過6個氫鍵與LuxS結合,MOp3通過6個氫鍵與LuxS結合;MOp2通過2個氫鍵與SarA結合,MOp3通過4個氫鍵與SarA結合。結果表明:MOp2與MOp3均可能通過氫鍵與這4種蛋白質結合,從而抑制這些蛋白質的表達,最終導致細菌無法黏附和形成生物膜。

圖11 辣木籽抗菌肽與金黃色葡萄球菌生物膜形成關鍵蛋白的分子對接結果Fig.11 Molecular docking results of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides with key biofilm formation proteins of S. aureus

表2 辣木籽抗菌肽與金黃色葡萄球菌生物膜形成關鍵蛋白的分子對接分析

3 結 論

本研究采用結晶紫半定量法證明了S.aureusCICC 10384有很強的生物膜形成能力,而辣木籽抗菌肽MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的MBIC和MBEC均為4 mg/mL和8 mg/mL,能有效清除S.aureus生物膜。經MOp2、MOp3處理后,S.aureus生物膜黏附減少、細菌數量減少,生物膜菌體新陳代謝能力和生物膜早期形成能力顯著下降,細菌初期黏附能力及表面疏水性降低。酶解實驗結果表明,S.aureus生物膜EPS中含量最多的為胞外蛋白,其次為胞外多糖和eDNA,而MOp2、MOp3會抑制EPS中3種成分的分泌合成。分子對接結果發(fā)現,MOp2、MOp3均可能通過氫鍵與生物膜形成關鍵蛋白AgrA、CshA、LuxS和SarA結合,這可能導致群體感應系統(tǒng)紊亂,進而導致細菌無法黏附和形成生物膜。研究結果可為辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的影響提供一定的參考,希望為其在食品工業(yè)中的進一步應用提供一定的科學依據。接下來的研究將通過蛋白質組學、Western blot、平行反應監(jiān)測、RT-qPCR等技術針對性地分析2種肽抑制生物膜的具體靶點。