孔志強(qiáng), 趙玉紅,2,*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱 150040)

植物多糖具有抗衰老[1]、抗炎[2]、降血糖[3]、降血脂[4]和抗氧化[5]等生理功能,其生物活性受到其分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)特征 (單糖組成、異構(gòu)碳構(gòu)型、糖單元順序、聚合度和分支特性) 等影響[6-9]。研究表明,高分子質(zhì)量多糖不容易穿透生物體的細(xì)胞膜屏障,從而導(dǎo)致生物學(xué)效應(yīng)減弱[7, 10]。通過降解處理降低多糖分子質(zhì)量,為提高其生物利用率提供了可行的方法[11]。

多糖降解方法有物理、化學(xué)和生物降解[9]。物理降解高效且環(huán)保,但需要專門的設(shè)備[12]。生物降解反應(yīng)溫和,但需要基于復(fù)雜多糖結(jié)構(gòu)對酶和微生物進(jìn)行篩選[11]?；瘜W(xué)降解包括酸降解、堿降解和H2O2降解[13]。H2O2降解因其條件溫和且綠色環(huán)保而被廣泛應(yīng)用[14]。 H2O2主要是通過Fenton反應(yīng)生成羥基活性自由基與氫原子,導(dǎo)致多糖解聚[15]。使用單一H2O2降解多糖通常不會導(dǎo)致分子質(zhì)量顯著降低,必須激活H2O2以增加其解聚能力[16]。 Fe2+是一種還原劑,對H2O2促進(jìn)多糖的降解有很強(qiáng)的催化能力[17]。與天然多糖相比,經(jīng)H2O2聯(lián)合Fe2+(H2O2-Fe2+)降解得到的多糖具有更好的生物活性[11,18]。因此,基于 H2O2-Fe2+體系的Fenton降解是提高多糖生物活性的一種有效方法[8]。

沙棘(HippophaerhamnoidesL.),胡頹子科沙棘屬,是廣泛種植于亞歐大陸的一種多刺落葉灌木植物[19],富含維生素、多酚、不飽和脂肪酸和多糖等多種生物活性物質(zhì)[20]。沙棘多糖(sea buckthorn polysaccharides, SBP)具有降血糖[21]、抗氧化[22]和緩解肝損傷[10]等藥理活性,但其分子質(zhì)量較高,水溶性較差,影響其生物活性的發(fā)揮與應(yīng)用[23]。有研究證明高分子質(zhì)量多糖經(jīng)降解處理后其生物活性可顯著提高[24]。目前,有關(guān)沙棘多糖降解及其理化功能特性方面的研究鮮見報道。

本研究擬采用 H2O2-Fe2+法對SBP進(jìn)行降解,研究沙棘降解多糖(sea buckthorn degraded polysaccharides, SBDP)的結(jié)構(gòu)、功能特性及抗氧化活性,旨在為拓展SBPD在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣,黑龍江省黑河市孫吳縣長樂山地大果沙棘開發(fā)有限公司,經(jīng)粉碎、過篩(60目)、脫脂、干燥,得到沙棘果渣粉,備用。 DPPH、ABTS,上海遠(yuǎn)業(yè)生物科技有限公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(分子質(zhì)量為5.000×103、1.160×104、2.380×104、4.860×104、8.090×104、1.480×105、2.730×105、4.098×105、6.678×105Da) ,揚(yáng)州博睿糖生物科技有限公司;其他化學(xué)品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EPOCH12型酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司;LC-10A型高效液相色譜儀,日本島津公司;RI-10A型示差檢測器,日本島津公司;ICS5000型離子色譜儀,美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆賽默飛世爾科技公司;FD5-2.5E型冷凍干燥機(jī),北京金西盟儀器有限公司;AR2000ex型動態(tài)旋轉(zhuǎn)流變儀,美國TA公司;FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技發(fā)展股份有限公司;Zeta plus型激光粒度分析儀,美國布魯克海文儀器有限公司;AVANCE Ⅲ HD 500MHz型核磁共振波譜儀,瑞士布魯克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1SBP的制備

參照裴晉紅等[25]的方法進(jìn)行多糖提取。準(zhǔn)確稱量沙棘果渣粉,按料液比1∶30(g/mL)[m(沙棘果渣粉)∶V(提取流)=1 g∶30 mL]加入蒸餾水,90 ℃ 提取2 h,4 000 r/min離心15 min,收集上清液,重復(fù)2次,合并提取液。提取液濃縮后用Sevage法除蛋白9次,醇沉靜置48 h,抽濾、取沉淀,分別用丙酮和無水乙醇洗2次,凍干后得到沙棘粗多糖。

1.3.2SBDP的制備

參照Zhang等[11]的方法并加以修改。分別將12.5 mL H2O2(1.0 mol/L)、12.5 mL FeSO4(1.0 mol/L)加到100 mL的SBP溶液(質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1)中,25 ℃ 攪拌2 h。多糖溶液經(jīng)72 h透析(截留分子質(zhì)量3 500 Da) 后,真空濃縮、凍干,得到SBDP。

1.3.3多糖分離純化

參照李順峰等[26]的方法,采用DEAE-52纖維素色譜柱對SBP和SBDP進(jìn)行分離純化,自動采集器收集 (流速為1 mL/min,每管收集10 mL)并測定各組分多糖的回收率。

1.3.4多糖分子質(zhì)量及單糖組成測定

參照張嘉園[27]的方法并加以修改。采用高效液相色譜法測定SBP和SBDP的分子質(zhì)量。參照Wang等[28]方法處理樣品,采用離子色譜法分析SBP和SBDP的單糖組成。

1.3.5多糖溶解度、粒徑和pH值的測定

樣品用質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的多糖溶液制備,室溫下用pH計測定其pH值。將10 mg多糖樣品溶于10 mL去離子水中,離心后得上清液,用激光粒度儀對樣品進(jìn)行粒徑評價。測定溫度為25 ℃ (折射率為1.543,散射角為90°)。參照Chen等[29]的方法測定SBP和SBDP的水溶性。

1.3.6多糖化學(xué)鍵分析

參照齊奇等[30]的方法,將干燥的多糖樣品和溴化鉀 (光譜級) 按質(zhì)量比1∶100混合研磨成粉末,然后壓成薄片,用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描。掃描范圍為400～4 000 cm-1,以4 cm-1的分辨率掃描16次。

1.3.7多糖結(jié)構(gòu)測定

參照Ma等[24]的方法并加以修改。將多糖(15 mg)室溫下溶解在D2O(0.5 mL)中,并轉(zhuǎn)移到核磁管中,使用AVANCE Ⅲ HD 500 MHz核磁共振波譜儀獲得1H NMR和13C NMR譜圖。

1.3.8多糖流變特性測定

通過流變儀在(25.0±0.1)℃下,將多糖溶液與平板(d=40 mm)結(jié)合。在0.1～100.0 s-1的剪切速率內(nèi)測試多糖溶液的表觀黏度,在1%的恒定應(yīng)變和1～100 rad/s的角頻率下測量其儲能模量(G′)和損耗模量(G″)。

1.3.9多糖吸濕性和保濕性測定

參照Li等[31]的方法。取一定量的多糖樣品置于105 ℃中烘至恒重,精密稱取50 mg,放入相對濕度81%(飽和硫酸銨溶液)的干燥器中。多糖樣品在室溫下每1 h稱重一次,甘油作為陽性對照。吸濕性根據(jù)式(1)計算。

(1)

將吸濕飽和的樣品置于裝有變性硅膠的干燥器中。在室溫下進(jìn)行保濕實驗,每1 h稱重一次。保濕性根據(jù)式 (2) 計算。

(2)

式(1)、(2)中,m代表飽和的樣品質(zhì)量,mg;mt是處理一定時間后的樣品質(zhì)量,mg;m0是質(zhì)量恒定的樣品質(zhì)量,mg。

1.3.10多糖的體外抗氧化活性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性測定

參照Xu等[8]的方法,將1.0 mL的DPPH溶液(0.2 mmol/L)與1.0 mL的SBP或SBDP溶液(質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg·mL-1) 混合,25 ℃避光孵育 30 min, 于517 nm處測定吸光度,以抗壞血酸(VC) 為陽性對照。根據(jù)式(3)計算多糖清除率。

(3)

式(3)中,A0為用去離子水代替樣品時,溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.3.10.2 ABTS+自由基清除活性測定

參照魏晨業(yè)等[32]的方法,取4.0 mL ABTS工作液,加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度(0.2～2.0 mg·mL-1) 的多糖溶液,混合,避光反應(yīng)6 min,于734 nm波長處測定吸光度。以VC為陽性對照,按式(4)計算樣品ABTS+自由基清除率。

(4)

式(4)中,A0為用去離子水代替樣品時對照溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.3.10.3 羥基自由基清除活性測定

參照譚詩敏[33]的方法,將1.0 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)和1.0 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L) 完全混合,加入不同質(zhì)量濃度 (0.2～2.0 mg·mL-1)的多糖溶液,混勻后加入1.0 mL H2O2溶液 (9 mmol/L) 啟動反應(yīng),37 ℃水浴30 min,于510 nm波長處測定吸光值。以VC作為陽性對照,根據(jù) 式 (5) 計算自由基清除率。

(5)

式(5)中,A0為用去離子水代替樣品時對照溶液的吸光度;A1為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)液混合物的吸光度;A2為用乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)液與樣品溶液混合物的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗,使用SPSS 22.0對所有實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示結(jié)果差異具有顯著性。采用Origin Pro 2021軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖純化結(jié)果及回收率分析

SBP和SBDP經(jīng) DEAE-52纖維素樹脂分級洗脫實驗,結(jié)果如圖1。由圖1可知,SBP分離得到5個組分,分別為SBP-0、SBP-0.1、SBP-0.2、SBP-0.3、SBP-0.4。SBDP分離得到3個組分,分別為SBDP-0、SBDP-0.1、SBDP-0.2。SBP-0和SBDP-0是通過蒸餾水洗脫下來的,為中性多糖,其余組分通過鹽溶液洗脫,為酸性多糖。所得的各組分含量及回收率,見表1。由表1可知,SBP與SBDP的蒸餾水洗脫組分回收率最高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38.92%和49.10%。后續(xù)實驗均選擇收集蒸餾水洗脫的組分制備SBP和SBDP。

表1 多糖洗脫回收率

圖1 SBP與SBDP洗脫曲線Fig.1 Elution curves of SBP and SBDP

2.2 降解對SBP的理化性質(zhì)分析

多糖理化性質(zhì)分析結(jié)果見表2。由表2可知,與SBP相比,SBDP分子質(zhì)量由3.016×105Da下降到2.902×104Da,平均粒徑由(302.46±3.63)nm下降到(237.30±1.76)nm。H2O2-Fe2+降解多糖是基于Fenton反應(yīng)生成大量羥自由基,通過羥自由基攻擊分子間或分子內(nèi)的氫鍵,破壞多糖的聚集[15],顯著降低多糖分子質(zhì)量和粒徑。相比SBP,SBDP的溶解度增加了20.72%,可能是SBDP糖環(huán)上的碳1(C1)、碳4(C4)及碳5(C5)處的氫原子被羥自由基提取,使SBDP含有更多的羥基、羧基等親水基團(tuán)[34]。通過H2O2-Fe2+降解多糖,可有效提高多糖溶解度[35]。

表2 SBP和SBDP理化性質(zhì)

單糖組成的分析結(jié)果如表2。SBDP的單糖組成與SBP相似,主要由巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸組成,其中半乳糖醛酸是SBP主要成分,甘露糖是SBDP主要成分。半乳糖醛酸含量經(jīng)H2O2-Fe2+處理后降低,說明SBP中高半乳糖醛酸區(qū)的糖苷鍵和半乳糖醛酸殘基可能被羥自由基攻擊,產(chǎn)生半乳糖醛酸含量占比更低的組分,并暴露出更多的甘露糖[36]。 H2O2-Fe2+降解多糖具有高效且溫和的特點且?guī)缀醪黄茐亩嗵且患壗Y(jié)構(gòu)[8]。

2.3 降解對SBP的結(jié)構(gòu)特征的影響

2.3.1紅外光譜分析

圖2 SBP和SBDP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of SBP and SBDP

2.3.2核磁共振波譜分析

SBP和SBDP的1H和13C譜圖如圖3。由圖3可知,2種多糖在δH3.0～5.5和δC60～110處出現(xiàn)了幾乎相同的典型多糖峰的分布[23],其中δH為4.3～5.3和δC為90～110的多糖峰信號表明,存在α和β構(gòu)型糖苷鍵[18]。根據(jù)文獻(xiàn)[14]和[44]的研究結(jié)果對單糖殘基的信號進(jìn)行了歸屬,氫-1/碳-1的異常區(qū)(H-1/C-1)所對應(yīng)的糖苷鍵,組成分析結(jié)果如表3[9,23,45]。表3結(jié)果表明,SBP和SBDP的主鏈由7種相同的糖苷鍵組成,證明這2種多糖具有相似的主干結(jié)構(gòu)。此外,δH為1.10和δC為16.75 附近的共振信號歸因于鼠李糖的CH3基團(tuán),δH為2.07和δC為20.23附近的共振信號證明多糖中存在乙?；鶊F(tuán),而δC在170附近的化學(xué)位移表明,糖鏈中存在糖醛酸[46]。

表3 SBP和SBDP的糖苷鍵組成

圖3 SBP和SBDP的核磁共振1H譜和13C譜Fig.3 1H and 13C NMR spectra of SBP and SBDP

從單糖組成、FT-IR光譜和核磁共振光譜來看,甘露糖是SBDP中主要的多糖組分,可能以(1→3,6)-α-D-Manp為骨架,(1→4)-α-D-GalpA和(1→2)-α-L-Rhap為主要側(cè)鏈。研究結(jié)果證明,H2O2-Fe2+處理并沒有改變SBP的一級結(jié)構(gòu)。

2.4 降解對SBP的吸濕性和保濕性的影響

多糖吸濕性和保濕性檢測結(jié)果,見圖4。由 圖4(a) 可知,多糖和甘油的吸濕率隨時間延長而增大,且SBDP吸濕率一直高于SBP。當(dāng)吸濕時間達(dá)到12 h時,SBP和SBDP的吸濕能力趨于飽和,最大吸濕率分別為40.67%±0.35%和 42.67%±0.12%,證明SBDP吸濕性能遠(yuǎn)強(qiáng)于SBP。由 圖4(b) 可知,多糖和甘油的保濕率均隨時間的延長而下降。保濕4 h內(nèi),甘油保濕能力明顯高于SBP和SBDP。保濕5 h后,SBP和SBDP的保濕能力趨于穩(wěn)定,最大保濕率分別為24.24%±0.94%和26.56%±0.69%,均高于甘油(17.36%±0.07%)。多糖的吸濕性和保濕性是由多糖分子中親水基團(tuán)與水分子形成氫鍵所表現(xiàn)的效果,與多糖分子中的親水基含量相關(guān)[46]。同時,多糖鏈可以相互交織,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這對保持水分含量很重要[47]。H2O2-Fe2+處理使得SBDP具有更多羥基、羧基等親水基團(tuán),并且SBDP多糖鏈更容易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。基于此結(jié)果,SBDP有望開發(fā)為保濕劑。

圖4 SBP和SBDP的吸濕和保濕能力Fig.4 Hygroscopicity and moisturizing property of SBP and SBDP

2.5 降解對SBP的流變特性的影響

具有良好流變性的多糖可以用作食品行業(yè)的增稠劑、凝膠劑、混懸劑和乳化劑[48]。多糖的流變特性檢測結(jié)果,見圖5。由圖5可知,2種多糖溶液均表現(xiàn)出剪切稀化特性和牛頓流體行為,且SBDP的溶液黏度始終低于SBP。在低剪切速率下,多糖黏度隨著剪切速率的增加而降低,多糖溶液表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為。這種現(xiàn)象是由于多糖分子的鏈-鏈結(jié)構(gòu)被剪切力破壞,導(dǎo)致黏度下降[48]。同時,高分子質(zhì)量多糖的分子間相互作用力強(qiáng)于低分子量多糖,導(dǎo)致多糖鏈更容易纏結(jié)[49]。在高剪切速率下,較長的多糖鏈可能解開纏繞,2種多糖的表觀黏度保持穩(wěn)定,多糖溶液性質(zhì)更接近牛頓流體[23]。

圖5 SBP和SBDP的流變特性Fig.5 Rheological characterization of SBP and SBDP

儲能模量(G′)為彈性應(yīng)力應(yīng)變之比,損耗模量(G″)為黏性應(yīng)力應(yīng)變之比。G′和G″的交叉點可用于確定多糖溶液的線性黏彈性區(qū)域[50]。由圖5可知,2種多糖的G′和G″均隨角頻率的升高而增加。在低頻區(qū)域,G″大于G′,表示多糖呈現(xiàn)液體黏性[49]。而在高頻區(qū)域,G′大于G″,此時多糖溶液表現(xiàn)出弱凝膠狀特性[48]。SBDP交匯點 (3.98 rad/s) 低于SBP交匯點(5.12 rad/s),由于多糖鏈之間連接點的數(shù)量和復(fù)雜性增加,SBDP更有可能在水溶液中形成強(qiáng)大的分子間(或分子內(nèi))相互作用力和糾纏網(wǎng)絡(luò)[48]。實驗結(jié)果表明,降解處理使多糖具有更好的凝膠性能和體系穩(wěn)定性[23-24]。

2.6 降解對SBP體外抗氧化活性的影響

將所得到的SBP和SBDP按比例稀釋進(jìn)行體外抗氧化活性測定,并與VC的抗氧化活性進(jìn)行對比,研究結(jié)果如圖6。由圖6可知,SBP對DPPH自由基清除能力具有濃度依賴性。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1時,SBP和SBDP對DPPH自由基清除能力無明顯差異。但隨著多糖質(zhì)量濃度增加(0.6～2.0 mg·mL-1),SBDP的DPPH自由基清除能力明顯高于相同質(zhì)量濃度的SBP(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時,SBDP對DPPH自由基的清除能力顯著高于SBP(P<0.05),達(dá)到89.44%±0.12%。同時,SBP和SBDP的半抑制濃度(IC50值)分別為1.06 mg·mL-1和0.71 mg·mL-1,證明SBDP對DPPH自由基清除效果更好。H2O2-Fe2+處理提高了多糖供氫能力,使SBDP更容易與DPPH自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定的產(chǎn)物,從而提高了對DPPH自由基清除能力[35]。

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 SBP和SBDP對自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activities of SBP and SBDP on radical

由圖6可知,ABTS+自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度的增加具有良好的相關(guān)性,自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度成正比。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg·mL-1時,SBP和SBDP的ABTS+自由基清除率分別為93.37%±0.13%和96.09%±0.22%,IC50值分別為0.22 mg·mL-1和0.21 mg·mL-1。SBDP的自由基清除能力更好,清除效果接近VC(99.15%±0.37%)。研究表明多糖的官能團(tuán)中,自由羥基可能通過提供電子將自由基還原為更穩(wěn)定的形式,或者通過直接與自由基反應(yīng)終止自由基連鎖反應(yīng)而參與抗氧化作用[15]。結(jié)果說明,SBP糖環(huán)中C5處的氫原子可能被H2O2-Fe2+產(chǎn)生的羥自由基提取,SBP糖環(huán)被打開,暴露出更多的自由羥基[51],從而顯著提高SBDP的ABTS+自由基清除能力。

由圖6可知,隨著多糖濃度的提高,2種多糖的羥基自由基清除能力均呈現(xiàn)上升趨勢,且在相同濃度下,SBDP的清除能力始終高于SBP。SBP和SBDP對羥基自由基清除的IC50值分別為0.90 mg·mL-1和0.56 mg·mL-1。多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時,SBDP的羥基清除能力顯著增強(qiáng) (P<0.05),達(dá)到73.26%±1.16%。與SBP相比,SBDP具有更強(qiáng)的羥基自由基清除活性。在清除羥基自由基反應(yīng)中,多糖作為電子供體或氫供體參與反應(yīng)中[52],而H2O2-Fe2+處理導(dǎo)致SBDP的分子質(zhì)量更低,使其成為更好的電子或氫的供體,同時,SBDP具有更好的水溶性,這可能導(dǎo)致SBDP中的化學(xué)基團(tuán)與羥基自由基相互作用的機(jī)會增加,提升SBDP分子的反應(yīng)效率,使得SBDP表現(xiàn)出更強(qiáng)的羥基自由基清除能力[11]。

通過上述結(jié)果可知,經(jīng)H2O2-Fe2+降解所得到的SBDP具有良好的抗氧化活性,且隨著濃度的提升,對DPPH自由基、ABTS+自由基及羥基自由基的清除能力均優(yōu)于SBP。

3 結(jié) 論

本研究對SBDP的結(jié)構(gòu)表征、功能特性和抗氧化活性進(jìn)行了分析。SBDP和SBP是含有相同單糖的雜多糖,其主鏈主要由相同的7種糖苷鍵組成。SBDP(2.902×104Da)的分子質(zhì)量明顯低于SBP(3.016×105Da),說明H2O2-Fe2+法是制備低分子質(zhì)量SBDP的有效方法。SBDP水溶性更高,表觀黏度更低,低剪切速率下為假塑性流體,表現(xiàn)出黏彈性行為,具有較強(qiáng)的抗氧化活性。但SBDP的體內(nèi)生物活性和構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。