常詩(shī)晗, 烏日娜, 方海田, 劉曉燕, 滕政蓉, 任廣鈺,張 英, 劉慧燕,*, 武俊瑞,*

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110866;2.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心, 遼寧 沈陽(yáng) 110866;3.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川 750021;4.沈陽(yáng)市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽(yáng) 110866;5.寧夏伊品生物科技股份有限公司, 寧夏 銀川 750001)

雙歧桿菌是一種嚴(yán)格厭氧的益生菌,具有預(yù)防腸道感染,降低膽固醇水平,維持腸黏膜屏障完整性和抵抗病原體在腸道定植等一系列促進(jìn)健康的特性[1-2]。在食品加工過(guò)程中以及在到達(dá)結(jié)腸之前的胃腸道運(yùn)輸過(guò)程中,雙歧桿菌的生存能力經(jīng)常受到阻礙。許多益生菌對(duì)胃中低pH值和近端腸內(nèi)高濃度的膽鹽環(huán)境都很敏感,在暴露于胃液時(shí)會(huì)失活[3]。益生菌在宿主體內(nèi)達(dá)到預(yù)期效果,其活菌數(shù)必須在106CFU/g以上[4]。因此,為雙歧桿菌創(chuàng)造嚴(yán)格的生長(zhǎng)環(huán)境以及開(kāi)發(fā)有效保護(hù)益生菌活性的技術(shù)具有重要意義。

微膠囊化包埋技術(shù)可以保護(hù)益生菌免受外部環(huán)境和胃腸道的不利條件的影響,提供足夠的細(xì)菌數(shù)量,實(shí)現(xiàn)其益生作用,并延長(zhǎng)其生命周期[5]。合理運(yùn)用微膠囊技術(shù)和壁材,可提高包埋率與穩(wěn)定性,將微膠囊的粒徑控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)[6-7],也可以使其在特定條件下釋放[8-9]。 內(nèi)源乳化法和擠壓法在微膠囊實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛[10],是可行的益生菌保護(hù)、應(yīng)用和控釋技術(shù)。Holkem等[11]通過(guò)內(nèi)源乳化法制備雙歧桿菌BB-12微顆粒,并對(duì)其鈣離子緩釋效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,微球?qū)﹄p歧桿菌BB-12具有保護(hù)作用,在pH值7.5的條件下呈現(xiàn)出釋放性。擠壓法操作溫和、簡(jiǎn)單、成本低,且不涉及任何有害溶劑,能夠減少細(xì)胞的損傷,提高包埋效率[12]。此方法使用的材料中以海藻酸鈉作為壁材的固定化應(yīng)用最多。海藻酸鹽是一種常用于固定活細(xì)胞的聚合物,具有很強(qiáng)的交聯(lián)能力和不同分子質(zhì)量的溫和膠凝特性[13],有生物相容性好、無(wú)毒、可生物降解和低成本的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于益生菌微膠囊的制備中[14]。然而,僅由海藻酸鹽制成的益生菌膠囊表面較粗糙,有孔隙和裂縫,所形成的凝膠孔隙可達(dá)5～200 nm[15]。在較低的pH值溶液時(shí)(例如在胃腸道條件下),單獨(dú)的海藻酸鈉不能有效地阻隔胃酸的滲入,無(wú)法更好地保護(hù)益生菌[16-17]。將海藻酸鹽與其他聚合物混合能夠增強(qiáng)微膠囊對(duì)酸性介質(zhì)的耐受性,從而提高益生菌的存活率[18]。Han等[19]利用海藻酸鈣-乳清蛋白分離物為壁材制備保加利亞乳桿菌和副干酪乳桿菌微膠囊,結(jié)果表明微膠囊中益生菌的存活率從3%提高到了41.26%。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)益生菌微膠囊的研究大多停留在方法和壁材上,且混合益生菌微生態(tài)制劑普遍存在活性保持與協(xié)同作用技術(shù)難題,關(guān)于益生菌微膠囊在實(shí)現(xiàn)分隔包埋以及在胃腸道的緩釋情況方面的研究甚少。本研究擬對(duì)B.adolescensFS2-3和B.subtilisSN15-2進(jìn)行微膠囊雙菌分隔包埋,希望為防止益生菌菌株的直接接觸抑制,創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境。采用海藻酸鈉為壁材,同時(shí)添加巰基化羧甲基纖維素鈉(CMC-SH)加強(qiáng)益生菌在腸道內(nèi)的黏附性。研究益生菌在模擬胃腸道中活力變化及釋放特性,并觀(guān)察微膠囊在儲(chǔ)存期間活菌數(shù)的變化。研究旨在為解決雙歧桿菌不耐人體胃腸道惡劣環(huán)境的問(wèn)題,以及具有腸道緩釋功能的益生菌微膠囊分隔包埋問(wèn)題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、碳酸鈣、磷酸鹽緩沖液、醋酸、氫氧化鈉、鹽酸,Biowest 公司;CMC-SH、CMC、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、半胱氨酸鹽酸鹽、氯化鈉、吐溫-80、冰乙酸、胃蛋白酶、磷酸二氫鉀、膽鹽、胰蛋白酶,北京化工廠(chǎng);金龍魚(yú)大豆油,家樂(lè)福超市;N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、二硫蘇糖醇(DTT),北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-16G型低溫高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);LGJ-10N/A型真空冷凍干燥機(jī),上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司;S-4800型掃描電子顯微鏡,日本日立高科技公司;BX43型顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Secura 225D-1CN型天平,北京Sartorius公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌器,日本三洋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

青春雙歧桿菌(B.adolescensFS2-3)活化:取-80 ℃超低溫冰箱中甘油保藏的菌株解凍,在雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn),放置在含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、5%的H2、90%的N2的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。復(fù)蘇后,挑取單菌落染色鑒定后,接種于雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種比例接入雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中傳代。

枯草芽孢桿菌(B.subtilisSN15-2)活化:將-80 ℃超低溫冰箱中甘油保藏的菌株解凍,取一定菌液于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn),37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。接種環(huán)挑取菌落,接入LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,備用。

1.3.2CMC-SH與海藻酸鈉復(fù)合薄膜的制備

1.3.2.1 CMC-SH的制備

參照Deng等[20]方法,并稍加修改。將0.10 g CMC溶解在20 mL的超純水中,加入0.22 g EDC·HCl和 0.13 g NHS, 調(diào)節(jié)pH值至4.8,于25 ℃下攪拌 2 h, 然后加入0.475 g半胱氨酸鹽酸鹽,用超純水透析24 h。透析后,加入0.295 g DTT,pH值調(diào)為8.5,置于室溫反應(yīng)24 h。鹽酸調(diào)節(jié)0.1 mol/L NaCl溶液至pH值為3.5,用于混合物透析。透析24 h后,再用pH 值3.5的HCl溶液透析48 h,凍干。

1.3.2.2 復(fù)合薄膜的制備

分別稱(chēng)量1 g的CMC和CMC-SH溶解于20 mL蒸餾水中。再稱(chēng)取0.6 g海藻酸鈉加入上述溶液中,放置于25 ℃搖床中,溶脹4 h。取300 mg甘油加入溶液中,并超聲處理2～3 min。將溶液分裝倒入直徑為7 cm的平底模具中,置于60 ℃烘箱中干燥6 h。再放于50%濕度、25 ℃條件下干燥48 h,備用。單一的海藻酸鈉薄膜制備方法同上。

1.3.3微膠囊的制備方法

1.3.3.1 內(nèi)芯微球的制備

采用內(nèi)源乳化法制備內(nèi)芯微球,參照李龍等[21]的方法,略有修改。取1 mLB.adolescensFS2-3(1×108CFU/mL)于1.5 mL離心管中,并按菌液體積的1%加入CMC-SH混合。將20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%海藻酸鈉和0.1 g CaCO3與上述菌液充分混合,用滅菌水補(bǔ)足至60 mL。向混合液中加入含有質(zhì)量濃度2 g/L吐溫-80的大豆油180 mL。放置于400 r/min磁力攪拌器上乳化5 min。加200 μL乙酸繼續(xù)乳化10 min。乳化后加滅菌蒸餾水使混合液分層,待凝膠成型的微膠囊都沉降到溶液底部后,吸去油相,離心收集微膠囊并洗滌3次,去除表面油相和菌體,保存好備用。

1.3.3.2 外殼微球的制備

采用擠壓法制備外殼微球,配制50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉,200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。取1 mLB.subtilisSN15-2(1×108CFU/mL)與1.3.3.1節(jié)制得的1 mL濕微球混合。將菌球混合液按體積比1∶1和海藻酸鈉充分混合,菌膠混合液在注射泵的壓力下,通過(guò)注射器和毛細(xì)管制得的微通道,進(jìn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈣溶液中,攪拌鈣化15 min。離心后洗滌,收集得到益生菌雙菌微膠囊。

1.3.4微膠囊制備條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以包埋率為考察指標(biāo)考察不同因素對(duì)益生菌雙菌微膠囊的影響,綜合分析后選擇了6種因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表1。

表1 單因素變量

1.3.4.1 內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球比例為1∶1。按照不同內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%制備微膠囊。

1.3.4.2 CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球比例為 1∶1。按照CMC-SH在菌液中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)制備微膠囊。

1.3.4.3 水相和油相體積比的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球體積比為1∶1。按照不同水相與油相體積比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)制備微膠囊。

1.3.4.4 外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,菌液與內(nèi)芯微球體積比為1∶1。按照不同外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)制備微膠囊。

1.3.4.5 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,菌液與內(nèi)芯微球體積比例為1∶1。按照不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、2%、3%、4%、5%)制備微膠囊。

1.3.4.6 菌液和內(nèi)芯微球比例的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%,水油體積比為1∶3,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。按照不同菌液與內(nèi)芯微球體積比(1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1)制備微膠囊。

1.3.5微膠囊包埋工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采取四因素三水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以包埋率為響應(yīng)值,利用Design Expert進(jìn)行分析。各因素及水平設(shè)置如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

1.3.6微膠囊包埋率的測(cè)定

參照Fritzen等[22]的方法,并稍加修改。稱(chēng)取制成的益生菌雙菌微膠囊1 g,加入9 mL解囊液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的檸檬酸三鈉)中,置于37 ℃搖床中振蕩。促使微膠囊中的益生菌完全釋放進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。經(jīng)過(guò)梯度稀釋后,將菌懸液分成2份,1份涂布于雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上,于厭氧箱中培養(yǎng)24 h。另1份涂布于LB固體培養(yǎng)基上,置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計(jì)總菌數(shù)。根據(jù) 式(1) 計(jì)算微膠囊包埋率。

(1)

式(1)中,N0為制備微膠囊時(shí)起始添加的活菌數(shù),CFU/g;N1為微膠囊中包埋的活菌數(shù),CFU/g。

1.3.7微膠囊的結(jié)構(gòu)形貌觀(guān)察

采用掃描電鏡(SEM)觀(guān)察微膠囊冷凍干燥后的形態(tài)。用雙面膠帶固定在微膠囊表面,吹去多余粉末。樣品通過(guò)濺射鍍銅管鍍金2.5 min,將微膠囊置于載玻片上,采用光學(xué)顯微鏡在10～100倍觀(guān)察微膠囊形貌。

1.3.8微膠囊在模擬人工胃腸液中釋放率的測(cè)定

1)模擬人工胃液制備。參照劉月靜[23]的方法,并稍加修改。取質(zhì)量濃度為2 g/L NaCl溶液,調(diào)pH值至2。取3 g胃蛋白酶,加入NaCl溶液中充分混勻,用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌,現(xiàn)用現(xiàn)配。

2)模擬人工腸液配制?；贏fzaal等[24]的方法,并稍加修改。取 6.8 g K2HPO4,用500 mL蒸餾水溶解,NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8。另取10 g胰酶,加適量的水使其溶解,將2種溶液混合,并加水定容至1 000 mL,濾膜過(guò)濾,現(xiàn)用現(xiàn)配。

3)解囊液的配制。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的檸檬酸三鈉,溶解于50 mL蒸餾水中,121 ℃滅菌20 min備用。

稱(chēng)量1 g微膠囊,用無(wú)菌水充分洗滌。再將微膠囊加入9 mL預(yù)熱的人工胃液中處理2 h后,轉(zhuǎn)移至9 mL預(yù)熱的人工腸液中,于37 ℃,100 r/min水浴搖床中振蕩1 h,每隔一段時(shí)間取1管樣品。根據(jù)式(2)計(jì)算微膠囊釋放率。

(2)

式(2)中,A為人工胃腸液處理后的活菌數(shù),CFU/g;B為人工胃腸液處理前的活菌數(shù),CFU/g。

1.3.9微膠囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

基于姚澤晨[25]的方法,并稍加修改。將益生菌雙菌微膠囊分裝于2 mL離心管中,在4、25 ℃溫度條件下保存6周。每周取1管,評(píng)價(jià)儲(chǔ)存穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異具有顯著性,同時(shí)利用Origin 2020軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同單因素對(duì)益生菌包埋率的影響

2.1.1內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

海藻酸鈉對(duì)益生菌包埋率影響見(jiàn)圖1。由圖1可知,隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,包埋率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2% 時(shí),包埋率達(dá)到最大,與其他組有明顯差異性。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí),膠囊的外壁過(guò)薄,機(jī)械強(qiáng)度較弱,不能有效包埋菌體。而當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于2%時(shí),溶液黏度和密度也會(huì)隨之變大,這使得凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空隙無(wú)法容納更多芯材,影響成球效果[26]。因此,內(nèi)芯海藻酸鈉較優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖1 內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on inner core on probiotic embedding rate

2.1.2CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

CMC-SH對(duì)益生菌包埋率影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,隨著CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,微膠囊的包埋率增加,當(dāng)CMC-SH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí),微膠囊包埋率最大,CMC-SH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大會(huì)不利于益生菌的包埋。CMC-SH的添加使海藻酸鈉凝膠孔隙變小,有效提高微膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用。而CMC-SH本身就具有一定黏彈性,質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大會(huì)使要包埋的菌體分散較為困難,不利于溶解,進(jìn)而引起包埋率降低。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)包埋達(dá)到較佳效果,而質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2%以上時(shí)已經(jīng)不利于包埋,影響益生菌包埋率。因此,選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CMC-SH進(jìn)行包埋。

2.1.3水相與油相體積比對(duì)益生菌包埋率的影響

水相油相體積比對(duì)益生菌包埋率的影響見(jiàn) 圖3。 由圖3可知,隨著水相油相體積比的改變,微膠囊的包埋率也隨之變化。當(dāng)油相體積過(guò)小時(shí),形成微球之間摩擦力過(guò)大,影響包埋率。而油相體積增加過(guò)大時(shí),單位體積豆油中海藻酸鈉含量過(guò)高,過(guò)多的菌體進(jìn)入囊結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致囊壁變薄,在后續(xù)的攪拌過(guò)程中容易致使結(jié)構(gòu)破裂,造成包埋率下降[27-28]。因此,結(jié)合數(shù)據(jù)選用水相與油相體積比為 1∶3,該比值較適于包埋。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。 圖3 水相油相體積比對(duì)益生菌包埋率影響Fig.3 Effect of water-oil volume ratio on probiotic embedding rate

2.1.4外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌生菌包埋率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知微膠囊的包埋率隨外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增加,當(dāng)外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3%時(shí),微膠囊包埋率最大,當(dāng)外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時(shí),微膠囊包埋率降低。外層海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低機(jī)械強(qiáng)度弱,不利于保護(hù)益生菌,或質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高黏性較大造成菌體不易分散且不易被擠出,進(jìn)而造成部分益生菌損失[29],同樣會(huì)影響菌體的包埋率。而與用海藻酸鈉制備內(nèi)芯微球的方法不同,所選最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也會(huì)有所不同。因此,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)以3%為較優(yōu)條件。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖4 外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率影響Fig.4 Effect of sodium alginate concentration in outer layer on probiotic embedding rate

2.1.5氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率的影響

氯化鈣對(duì)益生菌包埋率影響見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變,對(duì)益生菌的包埋情況也會(huì)不同。當(dāng) CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2%時(shí),隨著CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,包埋率也增大,在氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí),益生菌包埋率最高。隨著氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)升高,包埋率反而下降,原因可能是過(guò)高的Ca2+含量會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)交聯(lián)有限造成包埋率下降。周莉等[30]對(duì)保加利亞乳桿菌微膠囊化的研究也發(fā)現(xiàn)相應(yīng)結(jié)果。因此,選用2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈣效果最優(yōu)。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖5 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)益生菌包埋率影響Fig.5 Effect of calcium chloride concentration on probiotic embedding rate

2.1.6菌液和內(nèi)芯微球比例對(duì)益生菌包埋率的影響

菌液與內(nèi)芯比例對(duì)益生菌包埋率的影響見(jiàn) 圖6。 由圖6可知,菌液和內(nèi)芯微球的混合同樣會(huì)影響益生菌的包埋率,但程度相對(duì)較小。內(nèi)芯微球加入過(guò)少,液體里含有球的密度過(guò)低,會(huì)降低雙歧桿菌的菌數(shù)。而內(nèi)芯微球較多時(shí),密度過(guò)大同樣會(huì)影響包埋率。同樣,當(dāng)菌液的數(shù)量較多,大量的菌游離于溶液體系中,不能被壁材包裹,也會(huì)造成包埋率不高,達(dá)不到預(yù)期效果。當(dāng)菌液和內(nèi)芯微球的比例適中(體積比1∶1)時(shí),壁材很好地把游離菌用致密的網(wǎng)狀海藻酸鈣結(jié)構(gòu)包被。結(jié)合數(shù)據(jù),選用菌液與微球體積比為1∶1時(shí),制備益生菌雙菌微膠囊最好。

不同小寫(xiě)字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 菌液和內(nèi)芯微球體積比對(duì)益生菌包埋率影響Fig.6 Effect of volume ratio of bacterial solution to inner core microsphere on probiotic embedding rate

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1回歸模型及顯著性分析結(jié)果

采用Box-Behnken design ( BBD ),以包埋率為響應(yīng)值,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-expert 10.0.7 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到二次多元回歸方程,見(jiàn)式(3)。

Y=72.63-0.99×A-1.60×B-0.87×
C-0.69×D+0.30×AB+0.39×AC+
0.095×AD+0.45×BC+0.78×BD+1.09×
CD-3.08×A2-4.25×B2-5.93×
C2-6.79×D2。

(3)

式(3)中,Y為響應(yīng)值,即包埋率;A為內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù);B為CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù);C為水油體積比;D為外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4為回歸模型方差分析結(jié)果。由表3可知,模型P值顯著(P<0.000 1),而失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明模型具有統(tǒng)計(jì)意義,且實(shí)驗(yàn)的擬合度較好,可用此模型進(jìn)行工藝分析;B2、C2、D2為極顯著;由F值可知,因素對(duì)包埋率的影響由大到小為CMC-SH在菌液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)、內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水油體積比、外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

2.2.2響應(yīng)面模型驗(yàn)證

響應(yīng)面立體圖和等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖7。等高線(xiàn)是橢圓形可說(shuō)明2個(gè)因素交互作用顯著,而圓形則相反。根據(jù)立體圖曲面的傾斜度可確定2個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。通過(guò)軟件分析,得到益生菌雙菌微膠囊的較佳制備工藝參數(shù):內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%,CMC-SH在菌液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%,水油體積比為1.0∶2.9,外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.9%。在優(yōu)化條件下計(jì)算出包埋率的理論預(yù)測(cè)值為72.93%。以此為條件,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)的包埋率平均值為72.14%,與模型的理論預(yù)測(cè)值基本接近。

圖7 不同因素交互作用對(duì)包埋率的影響Fig.7 Effect of interaction of different factors on embedding rate

2.3 微膠囊結(jié)構(gòu)的形貌觀(guān)察結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀(guān)察制備的微膠囊結(jié)果見(jiàn)圖8(a)。 由圖8可知,益生菌雙菌微膠囊因受到真空冷凍干燥的影響,失水皺縮呈現(xiàn)凹陷和褶皺結(jié)構(gòu)。微膠囊凍干后粒徑會(huì)減小,且壁材海藻酸鈉形成的微膠囊具有多孔性[31]。表面是致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),沒(méi)有顯示裂縫或可見(jiàn)斷裂,限制了酸和酶對(duì)益生菌的影響,包埋益生菌效果較好。根據(jù)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察[圖8(b)],采用擠壓法制備的濕微膠囊呈內(nèi)外2個(gè)規(guī)則的球形,外殼微球能順利包埋內(nèi)芯微球,成功制成益生菌雙菌微膠囊。

圖8 微膠囊形貌Fig.8 Morphology of microcapsules

2.4 連續(xù)模擬人工胃腸道對(duì)微膠囊釋放率的影響

益生菌在腸內(nèi)釋放是發(fā)揮益生性能的關(guān)鍵,通過(guò)測(cè)定釋放率,確定益生菌釋放時(shí)間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知,雙菌微膠囊在胃液處理2 h的釋放率微乎其微,而單菌微膠囊釋放率已達(dá)到最大值。與單菌微膠囊相比,雙菌微膠囊更能保持菌株在胃液中的活力。在腸液處理150 min后,通過(guò)觀(guān)察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù),雙菌微膠囊中青春雙歧桿菌的活菌數(shù)明顯增多,枯草芽孢桿菌已經(jīng)釋放出來(lái)。隨著時(shí)間的變化,溶液中的微膠囊也逐漸崩解,在180 min時(shí),釋放率達(dá)到86.3%,微膠囊基本完全崩解。Luo等[32]利用復(fù)合材料制備的植物乳桿菌微膠囊也可以保護(hù)模擬胃液中益生菌的活力,并在模擬腸液中更好釋放益生菌,能順利將其定殖到腸道。海藻酸鈉在模擬人工胃液中會(huì)發(fā)生質(zhì)子化,當(dāng)微膠囊進(jìn)入腸液后更易溶脹,進(jìn)而加快釋放速度。

圖9 微膠囊在連續(xù)模擬人工胃腸液中的釋放率Fig.9 Release rate of microcapsules in continuous simulated artificial gastroenteric fluid

2.5 不同貯藏條件對(duì)微膠囊益生菌活性的影響

益生菌通過(guò)微膠囊化,可以在加工過(guò)程中提高菌株活菌數(shù),免受外界環(huán)境影響。選擇一個(gè)合適的溫度貯藏益生菌微膠囊,保證益生菌存活率至關(guān)重要[33]。微膠囊貯藏穩(wěn)定性見(jiàn)圖10。由圖10可知, 4 ℃和 25 ℃ 貯藏溫度下,益生菌雙菌微膠囊的貯藏存活率都高于2種游離菌株。對(duì)比2種溫度下益生菌的存活率,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),在42 d后, 4 ℃ 條件下的微膠囊中菌株存活率能達(dá)到66.13%,較 25 ℃條件下菌株的存活率60.71%更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),4 ℃條件下微膠囊具有良好的穩(wěn)定性,適合貯藏益生菌雙菌微膠囊。

不同字母表示同一貯藏時(shí)間益生菌存活率差異顯著(P<0.05)。 圖10 微膠囊在不同溫度下貯藏的存活率Fig.10 Survival rate of microcapsules stored at different temperatures

3 結(jié) 論

本研究制備的益生菌雙菌微膠囊,將2種益生菌封裝到不同隔間,包裹在同一微膠囊內(nèi)。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到益生菌雙菌微膠囊的最優(yōu)制備工藝參數(shù):內(nèi)芯海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%;CMC-SH在菌液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%;水油體積比1.0∶2.9;外層海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.9%。益生菌雙菌微膠囊可提高益生菌在胃腸道的活性并能在腸道內(nèi)充分釋放益生菌。不同溫度貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,益生菌雙菌微膠囊在4 ℃條件貯藏比在25 ℃條件下貯藏具有更高的存活率。制備的微膠囊能夠解決益生菌不耐人體胃腸道惡劣環(huán)境的問(wèn)題,希望研究結(jié)果可為具有腸道緩釋功能的益生菌微膠囊分隔包埋研究開(kāi)辟新的思路。