胡 巍, 楊 帆, 熊子奕, 高金燕, 陳紅兵, 李 欣,*

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室, 江西 南昌 330047;2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院, 江西 南昌 330047;3.江西省食物過敏重點實驗室, 江西 南昌 330047;4.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院, 江西 南昌 330047)

牛乳是八大類過敏食物之一,其營養(yǎng)豐富[1]。牛乳中含有30多種潛在的過敏原蛋白,其中酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是牛乳中的主要過敏原[2]。盡管過敏原標(biāo)簽的使用有效地提高了消費者獲取過敏原信息的便利性,但是現(xiàn)行的標(biāo)簽法規(guī)仍不能消除食品中隱藏的過敏原所引起的潛在危險。因此,實現(xiàn)食物過敏原的準(zhǔn)確檢測是保障食用安全的重要前提。

食物樣品的前處理方法是過敏原檢測的重要環(huán)節(jié),采用不同方法直接影響到檢測的準(zhǔn)確性,并與過敏原的豐度、含量和免疫反應(yīng)性有關(guān)[3]。食物基質(zhì)成分易于與過敏原形成共價鍵、離子鍵、氫鍵或疏水相互作用從而影響其檢測結(jié)果[4]。巧克力是相對復(fù)雜的食品基質(zhì)之一,原料乳粉中包含的乳蛋白是其主要的過敏物質(zhì),其中含有的大量脂肪可能會在調(diào)溫期間影響產(chǎn)品的結(jié)晶從而掩蔽部分過敏原表位[5]。此外,樣品制備過程中脂肪的存在會阻礙過敏原蛋白的分離提取或影響抗原抗體反應(yīng)從而降低檢測的準(zhǔn)確度[6]。因此,開發(fā)適用于高脂肪型食物脫脂的前處理方法迫在眉睫。然而直至目前,這類研究仍鮮有報道。

化學(xué)溶劑法和脂肪酶法作為食物中常見的脫脂方法,被廣泛應(yīng)用于樣品的前處理中[7-8]。溶劑法常使用烷烴、醇和酯類等有機試劑溶解并分離脂肪[9],脂肪酶法通過使酯鍵水解斷裂,將脂肪轉(zhuǎn)化成較易從蛋白質(zhì)中分離出來的脂肪酸和甘油[10]。然而,溶劑和酶均可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),導(dǎo)致過敏原的致敏性發(fā)生變化。崔巖巖等[11]使用溶劑法對椰子粕進行脫脂處理,發(fā)現(xiàn)脫脂溶劑破壞了椰子分離蛋白亞基的二硫鍵,同時通過破壞蛋白分子間的疏水鍵使其三級結(jié)構(gòu)展開。耿勤[12]發(fā)現(xiàn)脂肪酶脫脂會改變米渣蛋白的三級結(jié)構(gòu)并使其溶解性降低。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響著過敏原的致敏性,結(jié)構(gòu)變化的過程中其表位的含量和暴露情況也可能隨之變化。因此,脫脂效果好、過敏原提取率高且對過敏原結(jié)構(gòu)影響較小的脫脂方法是目前高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)前處理的研發(fā)重點。

本研究選用含有牛乳過敏原的巧克力作為高脂肪型食物基質(zhì)模型,分別利用正己烷、異丙醇和乙酸乙酯等脫脂劑和脂肪酶對樣品進行脫脂處理,比較了不同脫脂方法對樣品脫脂率、蛋白損失率、粒度、蛋白結(jié)構(gòu)、脂肪分布情況和微觀結(jié)構(gòu)的影響。此外,利用間接ELISA定量脫脂前后樣品中主要牛乳過敏原的濃度,依據(jù)實驗結(jié)果為3種牛乳過敏原分別確定一種較優(yōu)的脫脂方法,以期有效提升高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)中牛乳過敏原的提取效果,最終達(dá)到提升檢測準(zhǔn)確度的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉,恒天然商貿(mào)上海有限公司(由純牛乳噴霧干燥獲得,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%);可可粉,太古糖業(yè)(中國)有限公司;可可脂,法國可可百利公司;正己烷、異丙醇、乙酸乙酯均為色譜純,德國Meker公司;食品脂肪酶(活力值50 000 U),安徽綠微康生物科技有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、預(yù)染大分子蛋白質(zhì)Marker、考馬斯亮藍(lán)R250、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt, ANS)、羊抗兔lgG抗體,美國Sigma公司;尼羅紅染色劑,北京索萊寶科技有限公司;3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB),欣博盛生物科技有限公司;兔抗α-乳白蛋白、兔抗β-乳球蛋白和兔抗酪蛋白血清為實驗室自制。其他常用生化試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZC-101S1型脂肪測定儀,上海纖檢儀器有限公司;XCell4 SureLock 中型膠電泳槽,美國Bio-RAD公司;TU-1901型紫外分光光度計,北京普析通用儀器公司;F-4600型熒光分光光度計、Regulus 8100型冷場發(fā)射掃描電鏡,日本Hitachi公司;Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;BI-200SM型動靜態(tài)光散射儀,美國Brookhaven公司;Leica TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡,德國Laica公司。

1.3 實驗方法

1.3.1模擬高脂肪型復(fù)雜食物基質(zhì)的制備

巧克力食品模型較多,為了保障配方的穩(wěn)定性,參考文獻報道的基礎(chǔ)模型并進行調(diào)整得出最終模型[13],乳粉60 g,可可脂70 g,白砂糖20 g。原材料混合均勻后在60 ℃下融化并攪拌,于45 ℃精煉 1 h, 隨后在27～29 ℃進行調(diào)溫,放入冰箱4 ℃冷卻凝固2 h。

1.3.2脫脂處理方法

1)溶劑法。將樣品和脫脂劑加入離心管中,恒溫37 ℃磁力攪拌2 h,獲得的處理液在8 000g下離心10 min,棄去上清,于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥并揮發(fā)溶劑,收集粉末狀樣品備用。

2)酶法。向磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中加入脂肪酶以獲得質(zhì)量濃度為0.3 g/L的脫脂酶液,樣品預(yù)熱后加入酶液進行水解,于 50 ℃下攪拌90 min。之后采用95 ℃水浴加熱處理10 min使酶滅活,于冷水浴中迅速冷卻,凍干成粉末狀。

1.3.3脫脂率的測定

參考羅舜菁等[14]的方法并稍加修改。稱取2 g左右樣品,轉(zhuǎn)入在底部已塞脫脂棉的濾紙筒內(nèi),再用脫脂棉塞入上部壓住試樣,放入專用鋁杯中,于脂肪測定儀中進行脂肪量的測定。

設(shè)置浸泡、抽提、回收、烘干4個階段的溫度和時間,55 ℃浸泡1.5 h,75 ℃抽提1.5 h,85 ℃溶劑回收15 min,烘干階段設(shè)為110 ℃45 min。稱量測定前后鋁杯的質(zhì)量差以獲得脂肪質(zhì)量,脫脂率的計算見式(1)。

(1)

式(1)中,w0為脫脂前樣品脂肪體積分?jǐn)?shù),g/100g;w1為脫脂后樣品脂肪體積分?jǐn)?shù),g/100g。

1.3.4蛋白損失率的測定

采用Bradford(考馬斯亮藍(lán))法測定脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的損失率。本研究將BSA設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。向96孔酶標(biāo)板中每孔加入20 μL待測樣品和200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液混勻,避光放置10 min,于595 nm處測定其吸光度值,繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而計算出樣液的蛋白質(zhì)濃度,蛋白損失率的計算見式(2)。

(2)

式(2)中,ρ0為脫脂處理前蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;ρ1為脫脂處理后蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.3.5蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)對脫脂處理后模擬基質(zhì)中的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進行鑒定分析。每孔上樣8 μL。電泳條件設(shè)置為:電流12 mA(濃縮膠)和24 mA(分離膠)?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色15 min,染色結(jié)束用冰醋酸-甲醇溶液進行脫色。

1.3.6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定

1.3.6.1 圓二色譜分析

參考操強等[15]的研究方法采用圓二色譜儀測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化。比色皿厚度為1 mm,波長范圍為190～240 nm,速度為100 nm/min,在室溫及連續(xù)吹入氮氣條件下檢測,樣品掃描3次取其平均值,通過差減除去空白基線信號值,再使用Dichroweb網(wǎng)站計算蛋白二級結(jié)構(gòu)含量。

1.3.6.2 內(nèi)源性熒光光譜分析

參考Gao等[16]的研究方法采用熒光分光光度計測定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化。設(shè)定熒光分光光度計的條件為:激發(fā)波長(λex)為280 nm,發(fā)射波長(λem)為300～450 nm,光步5 nm,測試時間為200 ms,狹縫寬度為5.0 nm,對樣品的熒光強度進行掃描。

1.3.6.3 三維熒光分析

采用熒光分光光度計測定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)激發(fā)波長(λex)范圍為200～400 nm,發(fā)射波長(λem)范圍為200～600 nm時,兩者都以5 nm為間距增加,采集熒光信號得到激發(fā)發(fā)射矩陣熒光光譜,即三維熒光光譜。

1.3.7蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

本研究以ANS熒光探針法測定蛋白質(zhì)的表面疏水性差異[17]。室溫下以1∶50的比例向樣品中加入5 mmol/L ANS溶液,避光反應(yīng)1 h后使用熒光分光光度計檢測熒光強度,激發(fā)波長(λex)為390 nm,發(fā)射波長(λem)為400～600 nm,掃描速度為1 200 nm/min,狹縫寬度為5.0 nm。

1.3.8脂肪分布的測定

使用激光共聚焦顯微鏡觀察測定模擬基質(zhì)的脂肪分布,參考謝安琪等[18]的方法并稍加修改。取1 mL樣品加入20 μL質(zhì)量濃度為0.01 g/L的尼羅紅染料并混合均勻,避光放置30 min。將樣品均勻涂布于載玻片上并固定在激光共聚焦顯微鏡載物臺上,20倍物鏡,設(shè)置激發(fā)波長為488 nm,并采集熒光圖像。

1.3.9模擬基質(zhì)粒度的測定

參考Xie等[19]的研究方法,采用動靜態(tài)光散射表征模擬基質(zhì)的平均粒徑大小并比較粒徑分布的情況。

1.3.10模擬基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考步營等[20]的方法測定模擬基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)。蘸取少量脫脂前后的樣品粉末均勻涂布于導(dǎo)電膠上,并將導(dǎo)電膠貼合在置物臺上,將附有樣品的置物臺放在冷場發(fā)射掃描電鏡下進行觀察,電壓設(shè)置為5 kV。

1.3.11牛乳過敏原質(zhì)量濃度的測定

參考本團隊先前建立的間接ELISA方法[21]并稍加修改,測定模擬基質(zhì)中牛乳過敏原的濃度。分別以α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白和稀釋一定倍數(shù)的待測樣品作為包被抗原,兔多克隆抗體作為一抗,辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗。α-乳白蛋白:將α-乳白蛋白用PBS梯度稀釋至0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 μg/mL進行抗原包被,兔抗α-乳白蛋白血清稀釋倍數(shù)為1∶160 000,繪制α-乳白蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-乳球蛋白:將β-乳球蛋白用PBS梯度稀釋至0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5 μg/mL進行抗原包被,兔抗β-乳球蛋白血清稀釋倍數(shù)為 1∶160 000。酪蛋白:將酪蛋白用PBS梯度稀釋至0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/mL進行抗原包被,兔抗酪蛋白血清稀釋倍數(shù)為1∶10 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次并取平均值,采用SPSS 24.0進行差異顯著性分析,認(rèn)為P<0.05時為具有顯著性差異,采用Origin 9.0進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂方法對模擬基質(zhì)脫脂率和蛋白損失率的影響

不同脫脂方法處理后樣品的脫脂率和蛋白損失率見圖1。由圖1可知,4種脫脂方法的脫脂率由優(yōu)到差依次為正己烷、乙酸乙酯、脂肪酶、異丙醇。正己烷和乙酸乙酯的脫脂率均超過80%,其中正己烷脫脂率高達(dá)87.87%。此外,脫脂處理后模擬基質(zhì)中的蛋白質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的損失,其中正己烷對蛋白質(zhì)含量的影響最小,損失率為6.86%,異丙醇影響最大,損失率超過30%。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品,不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖1 脫脂方法處理后模擬基質(zhì)的脫脂率和蛋白損失率Fig.1 Degreasing rate and protein loss rate of simulated matrix treated with different degreasing methods

2.2 脫脂方法對模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響

不同脫脂方法處理后模擬基質(zhì)中乳蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知,樣品主要存在4條蛋白條帶,分子質(zhì)量依次位于35、25、15、10 kDa左右。這與預(yù)測的結(jié)果一致,巧克力中只含有乳蛋白,在25～35 kDa的是牛乳中含量最高的酪蛋白,分別位于15 kDa和10 kDa上方的是分子質(zhì)量為18.3 kDa的β-乳球蛋白和14.2 kDa的α-乳白蛋白。脫脂前后樣品中蛋白的組分和分子質(zhì)量大小無顯著變化,表明4種脫脂處理方法對樣品中主要的牛乳過敏原蛋白的一級結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生影響。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。泳道M:蛋白 Marker;泳道1:對照組;泳道2～5 :正己烷組、異丙醇組、乙酸乙酯組和脂肪酶組。Casein:酪蛋白;ALA:α-乳白蛋白;BLG:β-乳球蛋白。圖2 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3 脫脂方法對模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1圓二色譜分析結(jié)果

圓二色性光譜廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象研究領(lǐng)域。對不同脫脂方法處理前后蛋白質(zhì)的圓二色性光譜進行分析,結(jié)果見圖3和表1。由圖3和表1可知,在190～240 nm的波長范圍內(nèi),190 nm處的正峰和208、220 nm處的負(fù)峰是α-螺旋的特征峰,而195 nm左右的正峰和217 nm左右的負(fù)峰是β-折疊的特征峰。整體來看,脫脂處理改變了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。和對照組相比,溶劑法脫脂處理后樣品蛋白的α-螺旋含量均降低,正己烷、異丙醇和乙酸乙酯組分別降低了56.8%、88.1%和34.7%。異丙醇組β-轉(zhuǎn)角含量降低41.8%,β-折疊和無規(guī)則卷曲含量分別升高了2.4和1.5倍。研究發(fā)現(xiàn),氫鍵與二級結(jié)構(gòu)含量的變化密切相關(guān)[22],脫脂溶劑中大多含有羥基、酯鍵、大量的氧原子和氫原子,可能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用從而改變了二級結(jié)構(gòu)中氫鍵的順序和排列模式,出現(xiàn)了大量反平行β-折疊聚集體[23]。此外,正己烷組β-轉(zhuǎn)角含量升高了1.6倍,β-折疊含量降低了31.6%,無規(guī)則卷曲含量降低了92.5%?？赡苁且驗棣?螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,脯氨酸更加暴露于蛋白表面,促進了β-轉(zhuǎn)角的形成[24]。乙酸乙酯組除α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角降低外,其他結(jié)構(gòu)含量均略微升高,但整體而言變化最小。脂肪酶處理后α-螺旋含量升高36%,β-轉(zhuǎn)角含量降低82.1%。這可能是由于脂肪酶處理后基質(zhì)中與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂肪被去除,部分疏水區(qū)域暴露于蛋白質(zhì)表面,由于疏水相互作用而出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集。

表1 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖3 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的圓二色譜Fig.3 Circular dichroism spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3.2內(nèi)源性熒光光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的3種熒光氨基酸成分為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸,色氨酸含量最多,酪氨酸的熒光通常會被淬滅,苯丙氨酸對蛋白質(zhì)固有熒光的貢獻由于其吸收率過低而通常忽略不計。因此,色氨酸通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光光譜中340 nm處吸收峰的主要來源[25]。不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜結(jié)果見圖4。由圖4可知,3種溶劑脫脂后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強度均有不同程度的增強,而脂肪酶組的熒光強度略微降低。熒光增強可能是因為脂肪被脫除后蛋白質(zhì)出現(xiàn)空穴結(jié)構(gòu),三級結(jié)構(gòu)更為松散,色氨酸微環(huán)境的極性降低。脂肪酶因為特異性較強,相對來說對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響最小,但熒光強度有略微降低,可能是因為在脂肪酶脫脂之后,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)先部分展開,但緊接著蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生新的疏水鍵,導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸殘基被進一步掩蔽。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖4 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光光譜Fig.4 Intrinsic fluorescence spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.3.3三維熒光分析結(jié)果

不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的三維熒光光譜及結(jié)果見圖5和表2。由圖5和表2可知,三維熒光光譜的結(jié)果與內(nèi)源性熒光光譜基本一致。樣品出現(xiàn)了2個明顯的蛋白熒光特征峰,峰a(λex=280 nm)和峰b(λex=235 nm)分別是由酪氨酸、色氨酸殘基的π→π*躍遷和多肽鏈骨架的n→π*躍遷引起的特征峰,此外,色氨酸的吲哚基團被認(rèn)為是蛋白質(zhì)中約280 nm處紫外吸收最主要的來源,它們可以表征蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)[26]。結(jié)果表明:脫脂處理前后峰a位置無變化,峰b從原來的(λex=230 nm、λem=335 nm)紅移至(λex=235 nm、λem=335 nm或λex=235 nm、λem=340 nm)。溶劑法脫脂處理后模擬基質(zhì)中乳蛋白的三維熒光強度均升高,其中正己烷組對蛋白熒光強度影響最小,其次是乙酸乙酯。熒光增強可歸因于脫脂溶劑中的羥基自由基或氧自由基具有優(yōu)異的質(zhì)子親和能力,可能與芳香環(huán)中的氫質(zhì)子結(jié)合,促使更多吲哚基團暴露[27]。相比于對照組,異丙醇組的峰a熒光強度升高了91.16%,同時峰b也升高了102.47%。異丙醇帶有羥基,易與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基作用[28],破壞原有的α-螺旋、β-折疊含量和分布情況,使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)整體呈現(xiàn)解折疊和展開的趨勢,這與圓二色性光譜的結(jié)果一致。脂肪酶因為特異性較強,相對來說對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響較小,但熒光強度有略微降低,可能是因為在脂肪酶脫脂之后,原脂肪與蛋白質(zhì)結(jié)合的位置形成了部分空穴結(jié)構(gòu),促使蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生一定的疏水相互作用而部分聚集。

表2 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的三維熒光光譜峰位置和峰強度

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖5 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的三維熒光光譜Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.4 脫脂方法對模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

ANS可與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水位點結(jié)合,因而測量蛋白質(zhì)的表面疏水性可采用此法[29]。不同脫脂方法處理后蛋白質(zhì)的ANS熒光光譜結(jié)果見圖6。由圖6可知,除脂肪酶組外,溶劑脫脂均使得蛋白的表面疏水性增強。其中,異丙醇組疏水性最強,脂肪酶組最弱且低于對照組。通常來說,蛋白質(zhì)的帶電基團和極性氨基酸殘基通常位于外部,而非極性部分主要位于蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[30]。根據(jù)圓二色譜和內(nèi)源性熒光光譜的結(jié)果可知,溶劑脫脂處理使得模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的解折疊和展開,這可能使得原本包裹在內(nèi)部的疏水性空腔暴露于外部,從而為ANS提供了更多的結(jié)合位點。研究表明,在高脂肪食品中脂肪與蛋白質(zhì)接觸緊密,脂肪在水解過程中產(chǎn)生的超氧化物自由基會促使蛋白質(zhì)也發(fā)生氧化,而蛋白質(zhì)氧化會引發(fā)氨基酸側(cè)鏈的碳化[31]。因此,脂肪酶的水解作用可能使得乳蛋白表面疏水性側(cè)鏈基團改變,導(dǎo)致ANS結(jié)合位點減少。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖6 脫脂處理后模擬基質(zhì)中蛋白質(zhì)的ANS熒光光譜Fig.6 ANS fluorescence spectrum of proteins in simulated matrix after degreasing treatment

2.5 脫脂方法對模擬基質(zhì)脂肪分布的影響

脂肪用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的尼羅紅染色,并將信號設(shè)置為綠色,可以清晰直觀地看到模擬基質(zhì)中綠色脂肪液滴的大小和分布情況。不同脫脂方法處理前后模擬基質(zhì)的共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果見圖7。由圖7可知,未經(jīng)處理的對照組中存在大量脂肪,脂肪液滴直徑較大并呈現(xiàn)出大面積的聚集現(xiàn)象。經(jīng)過不同脫脂方法處理后,脂肪液滴表現(xiàn)出不同程度的減小,整體分布由大量聚集變得更為分散和均勻。其中正己烷組的液滴最小且數(shù)量最少,其次是乙酸乙酯和脂肪酶。與脫脂率的結(jié)果一致,異丙醇組雖然未見明顯的大脂肪塊,但液滴分布仍然較為密集,去除的脂肪在4種脫脂方法中最少。根據(jù)相似相溶原理,結(jié)構(gòu)相似的化合物更容易互相混溶,可能是因為異丙醇的極性比正己烷和乙酸乙酯的更強,脂肪在強極性環(huán)境中溶解性較差。相反,正己烷的極性最弱,更有利于脂肪的溶解和去除。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品。圖7 激光共聚焦顯微鏡下脫脂處理后的模擬基質(zhì)Fig.7 Laser confocal micrographs of simulated matrix after degreasing treatment

2.6 脫脂方法對模擬基質(zhì)粒度的影響

脫脂處理后模擬基質(zhì)的粒度測定結(jié)果見圖8。由圖8可知,從粒度分布情況來看,對照組顆粒大小均一且呈現(xiàn)單峰分布,正己烷組和乙酸乙酯組的變化較小,同樣呈現(xiàn)單峰分布。異丙醇組和脂肪酶組由單峰分布變?yōu)殡p峰分布,說明模擬基質(zhì)中產(chǎn)生了大顆粒聚集體。從平均粒徑來看,正己烷組和乙酸乙酯組的粒徑略微降低,這可能是因為脫脂處理后脂肪分子從蛋白質(zhì)-脂肪復(fù)合物上脫去,溶液體系粒徑隨之降低。相反的是,異丙醇組粒徑顯著升高,由297.9 nm升高至445.1 nm,可能是因為異丙醇顯著改變了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),使其過度變性,形成了更大的聚集體。同時,異丙醇組的脫脂率最低,體系內(nèi)殘留的脂肪易與蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈重新結(jié)合形成新的復(fù)合物。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品;圖8(a)至圖8(e)為不同脫脂方法處理后模擬基質(zhì)的粒徑大小分布情況,圖8(f)為平均粒徑大小;不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖8 脫脂處理后模擬基質(zhì)的粒度Fig.8 Particle size of simulated matrix after degreasing treatment

2.7 脫脂方法對模擬基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的影響

在放大倍數(shù)為5 000倍下使用掃描電鏡觀察不同方法脫脂前后模擬基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化,結(jié)果見圖9。由圖9可知,脫脂處理后表面形貌發(fā)生了明顯的改變。由圖9(a)可知,未處理的模擬基質(zhì)表面光滑,內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊湊,視野內(nèi)可見大范圍的致密平滑結(jié)構(gòu),可能是因為基質(zhì)中的脂肪與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用,致使顆粒之間大量聚集黏附。由圖9(b)可知,正己烷脫脂處理后基質(zhì)呈現(xiàn)出了多孔疏松的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),這是由于脂肪分子被脫去后基質(zhì)顆粒黏連情況明顯減少,蛋白質(zhì)由大量聚集轉(zhuǎn)變?yōu)榫环稚⒌臓顟B(tài),因而顯示出更為清晰的骨架。乙酸乙酯脫脂后基質(zhì)表面出現(xiàn)明顯的裂解,產(chǎn)生明顯的空腔,但其蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)不均一且仍存在少量結(jié)塊,這可能是因為乙酸乙酯破壞了部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其整體骨架結(jié)構(gòu)不明顯[32]。脂肪酶脫脂后基質(zhì)表面雖然出現(xiàn)了少許直徑較大的孔洞,但仍可看出其余部分存在明顯的光滑平面和塊狀堆積。異丙醇組呈現(xiàn)出不規(guī)則大小的結(jié)塊,一方面是因為脂肪殘留較多,另一方面是因為異丙醇對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞最為顯著,蛋白質(zhì)之間發(fā)生了聚集現(xiàn)象,基質(zhì)重新形成平滑致密的結(jié)構(gòu)[14]。

2.8 脫脂方法對牛乳過敏原提取質(zhì)量濃度的影響

利用間接ELISA獲得模擬基質(zhì)中3種主要牛乳過敏原的質(zhì)量濃度,結(jié)果見圖10。由圖10可知,溶劑脫脂處理整體提高了模擬基質(zhì)中過敏原的提取質(zhì)量濃度。然而,在脂肪酶組中表現(xiàn)為降低的趨勢,不利于過敏原的提取和定量檢測。牛乳中蛋白質(zhì)的含量為3.0%～3.5%,其中酪蛋白占80%,是牛乳中含量最高的過敏原。除脂肪酶之外,其他3種溶劑脫脂均提高了酪蛋白的提取率。其中,乙酸乙酯組的過敏原質(zhì)量濃度最高,由對照組的31.3 mg/mL升高至50.4 mg/mL,提升了61.02%。盡管該方法整體的蛋白損失率高于正己烷,但結(jié)果顯示其更適合于酪蛋白的提取。對于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,正己烷脫脂后兩者的質(zhì)量濃度最高,分別為0.73 mg/mL和1.89 mg/mL?？赡苁且驗檎和榈拿撝Ч罴?消除了脂肪基質(zhì)對過敏原提取的阻礙作用。同時,該方法下的蛋白質(zhì)損失量也最少,說明過敏原在該溶劑中的溶解度低,可以較好地保留下來。然而,異丙醇和乙酸乙酯處理后α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的濃度均有所降低,可能是因為它們對這兩種過敏原蛋白結(jié)構(gòu)影響較為顯著,從而使得表位更為隱蔽,甚至破壞了過敏原內(nèi)部表位[33]。

對照組為未經(jīng)脫脂處理的巧克力樣品;不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖10 脫脂前后模擬基質(zhì)中主要牛乳過敏原的質(zhì)量濃度Fig.10 Main milk allergens concentration in simulated matrix after degreasing methods treatment

3 結(jié) 論

通過與過敏原發(fā)生相互作用,復(fù)雜食物基質(zhì)中的脂肪會影響過敏原的提取和抗原抗體反應(yīng)從而影響過敏原檢測結(jié)果。本研究首次提出通過脫脂處理提升高脂肪復(fù)雜食物基質(zhì)中牛乳過敏原檢測前處理效果的方法,利用正己烷、異丙醇、乙酸乙酯和脂肪酶對含有牛乳過敏原的高脂肪巧克力進行脫脂處理,發(fā)現(xiàn)脂肪酶組效果不理想,而脫脂劑可以提高牛乳過敏原的溶出率。正己烷的脫脂率最高且蛋白損失率最低,分別為87.87%和6.86%。相比于未脫脂樣品,酪蛋白在乙酸乙酯組中的提取率最高并提升了61.02%,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在正己烷組中的提取質(zhì)量濃度最高,分別為0.73 mg/mL和1.89 mg/mL,并且正己烷和乙酸乙酯對過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)破壞較小,可以較好地維持過敏原的致敏性。為了進一步優(yōu)化高脂肪型食物基質(zhì)中牛乳過敏原檢測的前處理方法,后續(xù)將對脫脂處理后過敏原的提取體系進行研究。此外,還存在高淀粉和高蛋白等多個類型的復(fù)雜食物基質(zhì),未來應(yīng)針對不同類型的復(fù)雜食物基質(zhì)建立相應(yīng)的研究方案,為獲得更為完善的牛乳過敏原檢測前處理方法提供理論依據(jù)。