王 星,張 妍,張明磊,高建步,張永杰,齊貴彬

(河南省南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽473000)

隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高以及人們健康意識的提升,雖然我國心血管疾病防治工作目前取得了階段性的成效,然而仍面臨著極大的挑戰(zhàn)。據(jù)《中國心血管病報告2018》[1]概要顯示,我國心血管疾病的患病率仍處于上升期,估算現(xiàn)存心血管疾病患者人數(shù)高達2.9億,其中約有1100萬人患冠心病(CHD);不僅如此,因心血管病死亡人數(shù)占居民疾病死亡人數(shù)構(gòu)成的40%以上,嚴(yán)重威脅著公共健康安全,加重我國社會的疾病負擔(dān)。CHD的病理基礎(chǔ)為動脈粥樣硬化(AS),雖然高血壓、糖尿病以及血脂紊亂在臨床上被公認為AS的高危因素,并且受個人基因調(diào)控,然而,AS是一種多基因疾病,病理過程復(fù)雜,并且其發(fā)病機制尚未闡明[2-4]。因此,用科學(xué)的方法從分子層面闡述冠心病的潛在機制已成為當(dāng)務(wù)之急,以期為臨床篩選高?；颊咭约爸贫ǜ深A(yù)疾病治療方法提供理論基礎(chǔ)。近年來生物信息學(xué)通過獲取基因芯片,可高效、廣泛地收集生物信息與相關(guān)疾病的表達譜數(shù)據(jù),在基因功能研究、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測以及藥物設(shè)計等方面發(fā)揮著重要作用[5]。本研究利用生物信息學(xué)工具分析GEO數(shù)據(jù)庫篩選中國人CHD的關(guān)鍵基因和信號通路數(shù)據(jù),探究CHD潛在的發(fā)病機制與治療靶點。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)收集本研究在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以“coronary heart disease AND homo sapiens[Organism]”為關(guān)鍵詞進行檢索,在人類冠心病基因表達芯片實驗數(shù)據(jù)的檢索結(jié)果中找到GSE71226數(shù)據(jù)集,它是基于Affymetrix人類基因U133 Plus 2.0陣列的GPL570平臺進行搭建的。GSE71226數(shù)據(jù)集中包含6個樣本,3個CHD患者樣本,分別為GSM1830987,GSM1830988,GSM1830989;3個健康人群樣本,分別為GSM1830990,GSM1830991,GSM1830992。分別下載基因表達圖譜(GEO)原始數(shù)據(jù)[6]和探針注釋文件進行進一步分析。

1.2 篩選差異基因利用R studio軟件“l(fā)imma”包對GSE71226數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理[7],設(shè)置參數(shù)P值<0.05;差異倍數(shù)(FC)≥2進行差異表達分析以及聚類分析;利用R studio軟件“pheatmap”包繪制差異表達基因的火山圖以及熱圖等可視化處理。

1.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析利用R Studio軟件中“clusterProfiler”包和“org.Hs.eg.db”包對差異基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P值<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 構(gòu)建差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)利用STRING網(wǎng)站(http://string-db.org/)和Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)[8],使用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件篩選CHD的hub基因并用MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的功能模塊識別關(guān)鍵基因[9],以此來獲取轂基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選對CHD芯片表達數(shù)據(jù)集GSE71226進行標(biāo)準(zhǔn)化處理后,差異基因篩選結(jié)果顯示,GSE71226數(shù)據(jù)集中包含120個差異表達基因,其與健康對照人群相比,冠心病患者有76個基因顯著上調(diào)和44個基因顯著下調(diào)。差異基因表達圖見圖1,圖2。

圖1 差異表達基因火山圖

圖2 前50位差異表達基因熱圖

2.2 GO富集分析及KEGG通路分析GSE71226數(shù)據(jù)集來源的差異表達基因顯著富集在血紅蛋白復(fù)合體(hemoglobin complex)和結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合體(haptoglobin-hemoglobin complex)等細胞成分(CC)中,分子功能(MF)主要體現(xiàn)為結(jié)合珠蛋白結(jié)合(haptoglobin binding)以及氧氣載體活性(oxygen carrier activity),見圖3;上調(diào)差異表達基因主要富集在單純皰疹病毒1型感染信號通路,真核生物中的核糖體合成信號通路,信使RNA監(jiān)測通路以及RNA轉(zhuǎn)運信號通路,上調(diào)差異表達基因主要富集在瘧疾信號通路,金黃色葡萄球菌感染信號通路,補體和凝聚級聯(lián)信號通路以及神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路,見圖4。

圖3 差異表達基因的GO富集分析氣泡圖

圖4 差異表達基因的KEGG富集通路分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及轂基因的獲取將CHD患者外周血樣本與健康人群外周血樣本間篩選出的差異表達基因?qū)隨TRING后構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)圖,該網(wǎng)絡(luò)由104個節(jié)點蛋白和92條邊構(gòu)成(P<0.05),見圖5;通過Cytoscape軟件進一步篩選出10個基因,其中與CHD關(guān)聯(lián)最大的基因為α血紅蛋白穩(wěn)定蛋白(AHSP)以及SLC4A1,見圖6。

圖5 差異基因之間的蛋白-蛋白相互作用

圖6 關(guān)鍵基因模塊

3 討論

本研究通過從GEO數(shù)據(jù)庫獲取GSE71226數(shù)據(jù)集,采用逐步生物信息學(xué)分析,最終發(fā)現(xiàn)確定AHSP為CHD的關(guān)鍵基因。R語言對微陣列芯片進行分析,得出120個CHD患病人群與健康對照人群間的差異表達基因,其中76個上調(diào)基因和44個下調(diào)基因。GO功能分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與的CC為血紅蛋白復(fù)合體與結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合體,主要參與的MF體現(xiàn)為結(jié)合珠蛋白結(jié)合以及氧氣載體活性;KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在單純皰疹病毒1型感染,真核生物中的核糖體合成,信使RNA監(jiān)測,RNA轉(zhuǎn)運瘧疾,金黃色葡萄球菌感染,補體和凝聚級聯(lián)以及神經(jīng)活性配體受體相互作用信號通路。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)得到AHSP關(guān)鍵基因。

心血管疾病給居民和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān),據(jù)相關(guān)統(tǒng)計[10-11]報道,因心血管病死亡占據(jù)中國城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位,其中農(nóng)村地區(qū)死亡率為46.66%,城市為43.81%,并且每年因心臟病過早死亡導(dǎo)致的直接損失高達5580億美元。心血管疾病中尤以CHD最為致命,其病情不僅十分兇險,而且易迅速進展為惡性心律失常、心力衰竭,甚至導(dǎo)致心源性猝死,嚴(yán)重威脅著患者的生命安全。因此,尋找冠心病新的診斷與治療的靶點成為科研工作者們亟待解決的問題[1,12-14]。越來越多的研究表明,在動脈粥樣硬化形成與發(fā)展中,免疫系統(tǒng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過對特定條件下細胞內(nèi)或者組織內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本進行測序,反映生物體在不同條件下不同基因的表達水平和調(diào)控模式[16]。在KEGG通路分析中,發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在單純皰疹病毒1型感染信號通路上。眾多臨床病理研究[17-19]中顯示,單純皰疹病毒等的微生物可能是CHD發(fā)病的感染因子。病毒感染易引起炎癥細胞的增多、聚集和激活,并分泌TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等細胞因子,導(dǎo)致脂代謝紊亂、血清甘油三酯(TG) 的積累、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 減少,氧自由基大量合成和釋放,增加CHD發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險。

在篩選出的關(guān)鍵基因中,AHSP基因主要有兩個作用,一是穩(wěn)定游離α-珠蛋白;二是促進血紅蛋白四聚體的組裝,以此來抵御過多游離而不穩(wěn)定的α-珠蛋白給機體造成的危害[20-21]。有研究[22-23]表明,AHSP表達或功能的改變正是在地中海貧血患者中觀察到的一些臨床變異性的原因,然而,在冠心病患者中的作用卻未曾報道。這可能是因為AHSP在維持紅系細胞的氧化還原平衡狀態(tài)過程中發(fā)揮積極的保護作用,α-珠蛋白由氧化產(chǎn)生并通過內(nèi)源性還原酶循環(huán),如氧化環(huán)境中無β-珠蛋白行使“清道夫”的職責(zé),過量的α-珠蛋白將對心肌細胞產(chǎn)生毒性[24]。而過度的氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用,其不僅可造成機體與細胞衰老,破壞Ca2+穩(wěn)態(tài),損傷心肌細胞,還能嚴(yán)重損傷胰島β細胞,加速動脈粥樣硬化,導(dǎo)致糖尿病及冠心病的發(fā)生及預(yù)后不良[25]。另外,AHSP能特異性結(jié)合游離α-血紅蛋白,穩(wěn)定其結(jié)構(gòu),并限制其參與產(chǎn)生活性氧的化學(xué)反應(yīng)的能力[26-28]。如內(nèi)皮細胞表達的α-珠蛋白結(jié)合內(nèi)皮NOS(eNOS)通過氧化降解其酶促產(chǎn)物NO,從而減少NO對附近血管平滑肌的血管擴張作用,最終導(dǎo)致冠脈狹窄及氧氣輸送障礙[24,29]。

本研究仍存在一定的局限性,首先,本研究納入的樣本數(shù)量較小,這可能導(dǎo)致篩選的轂基因有所偏差;其次,本研究只采用生物信息學(xué)方法進行初步探索,有待進一步的實驗進行驗證。

綜上所述,CHD發(fā)病機制復(fù)雜,由多種因素導(dǎo)致。本研究通過生物信息學(xué)分析CHD患者與正常人群間的基因表達差異,成功地構(gòu)建相關(guān)的PPI,同時揭示了差異表達的富集的相關(guān)通路來參與CHD的發(fā)病過程,為CHD診斷和治療提供了潛在的靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者簡介：王星(1984-),男,河南省南陽市人,碩士研究生,主治醫(yī)師,主要研究心血管內(nèi)科方向。