沈笑然,朱瑞鋒,郭佳翔,李凌舟,郭洪亮*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院,北京100029;2.河南科技大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系,河南 洛陽(yáng)471000;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院,北京100020;4.馬來(lái)亞大學(xué),馬來(lái)西亞 吉隆坡50603)

RNA干擾(RNAi)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了一場(chǎng)生物學(xué)革命,最終表明非編碼RNAs在多細(xì)胞生物中是基因表達(dá)的中心調(diào)節(jié)因子[1]。這些小干擾RNA(siRNAs)很快成為生物學(xué)研究中普遍存在的工具,僅通過(guò)一個(gè)堿基序列就能輕松地抑制任何基因[2-3]。在研究領(lǐng)域中,RNAi不僅被用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)、用于病毒性疾病治療、研究基因功能,近年來(lái)RNAi技術(shù)也被當(dāng)成一種研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制的新方法。本研究應(yīng)用該技術(shù)沉默原代星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast) IL-17表達(dá),探討IL-17的功能[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)質(zhì)粒(武漢,晶賽生物技術(shù)公司);Lipofectamine 2000(美國(guó),Invitrogen);熒光顯微鏡(日本,OLYMPUS);C57BL/6小鼠(首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。鼠抗IL-17單克隆抗體(武漢博士德生物制品公司)。

1.2 方法

1.2.1體外原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的制備 取新生C57BL-6小鼠乳鼠于-20℃冷凍,乙醇消毒,斷頭后取出腦,將分離出的皮層組織用眼科剪盡量剪碎成0.5 mm3的小塊,移入無(wú)菌錐底離心管內(nèi),加入胰酶,消化,震蕩,反復(fù)輕輕吹打組織,直至無(wú)明顯組織塊,形成細(xì)胞懸液;取細(xì)胞懸液過(guò)200目篩網(wǎng)后離心7 min,棄上清液,重懸細(xì)胞沉淀,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),之后倍比稀釋到2.0×105·mL-1以傳代備用。

1.2.2IL-17基因沉默質(zhì)粒的構(gòu)建及擴(kuò)增 根據(jù)Gen Bank中登錄的小鼠IL-17Am RNA序列(NM_010552.3),參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)確定3個(gè)RNAi 靶點(diǎn)序列為GGTCAACCTCAAAGTCTTTAA、GCAATGAAGACCCTGATAGAT、GCTGGACCACCACATGAATTC,并設(shè)計(jì)序列TTCTCCGAACGTGTCACGT 為陰性對(duì)照。按照Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)的方式設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的sh RNA序列,Oligo DNA 由武漢晶賽生物技術(shù)公司合成。按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,中量提取超純質(zhì)粒。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

分別用pGenesil-1A或B和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ast。步驟如下:每孔細(xì)胞被稀釋成1.8 μg DNA,以及與稀釋7.5 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混勻,室溫孵育形成DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物形成。逐滴加入500 μl 脂質(zhì)體/DNA混合物到每孔中,搖動(dòng)培養(yǎng)板使之混勻,孵育3 h。48 h后,熒光鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況,并比較兩段序列的轉(zhuǎn)染效率。

1.4 沉默效果檢測(cè)

選取轉(zhuǎn)染效率高的質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1C分別轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ast,與脂質(zhì)體/DNA混合物作用3 h后換成正常的高糖DMEM培養(yǎng)基后,與空白對(duì)照組比較,檢測(cè)3組在3、6、12、24、48 h IL-17 mRNA表達(dá)。3、4、6 d后檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)組為 SiRNA-IL-17+Ast cell;陰性對(duì)照組(NC)(NegativecontrolSiRNA)+Ast cell;空白對(duì)照組為Ast cell(control)。

1.6 IL-17蛋白的Western blotting 檢測(cè)

急性脊髓炎小鼠模型建立后,在疾病高峰期,麻醉處死大鼠,剪開(kāi)脊椎骨,取脊髓組織,超聲粉碎,離心取上清,以BCA法測(cè)定樣品蛋白含量,上樣,電泳分離,轉(zhuǎn)印,雜交,結(jié)合一抗二抗,DAB顯色,用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后,Bandscan分析條帶灰度,分別計(jì)算靶蛋白條帶的光密度與相對(duì)的β-actin條帶光密度的比值,表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.7 PCR法對(duì)IL-17mRNA的檢測(cè)

根據(jù)Genbank檢索的核苷酸序列用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,加入M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶,得到的產(chǎn)物以 GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)預(yù)變性、變性、退火、延伸,30個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果、照相,用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后,Bandscan分析條帶灰度,分別計(jì)算 GDNF條帶的光密度與相對(duì)的GAPDH條帶光密度的比值,表示各組mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以mean±SD表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件(SPSS,Chicago,IL,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間差異比較采用單因素方差分析,兩組之間的比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17基因沉默質(zhì)粒的鑒定

武漢晶賽生物技術(shù)公司構(gòu)建的特異攜帶有IL-17 RNAi pGenesil-1質(zhì)粒的彩色圖譜及IL-17短發(fā)夾環(huán)質(zhì)粒載體基因自動(dòng)測(cè)序圖。DNA測(cè)序鑒定結(jié)果顯示干擾質(zhì)粒pGenesil-1A、B均構(gòu)建成功。

2.2 轉(zhuǎn)染效率觀察

轉(zhuǎn)染后48 h在熒光顯微鏡下觀察,因?yàn)檗D(zhuǎn)染后可使Ast細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)的EGFP表達(dá),并在熒光顯微鏡下可被激發(fā),說(shuō)明轉(zhuǎn)染獲得成功。結(jié)果提示:pGenesil-1B表達(dá)的綠色熒光明顯多于pGenesil-1A,分別為56.72%±3.19%、16.72%±1.93%(見(jiàn)圖1)。

圖1 帶有EGFP標(biāo)記的轉(zhuǎn)染后的Ast細(xì)胞(A、B:400倍,轉(zhuǎn)染48 h后攜帶綠色熒光蛋白表達(dá)的 pGenesil-1B,可見(jiàn)綠色熒光;C、D:400倍,轉(zhuǎn)染48 h后攜帶綠色熒光蛋白表達(dá)的 pGenesil-1A,可見(jiàn)綠色熒光;其中A、C圖為激發(fā)光下的圖片,B、D為正常透光和激發(fā)光下的融合圖片)

2.3 RT-PCR檢測(cè)IL-17 mRNA表達(dá)量變化

IL-17基因沉默對(duì)照組IL-17表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組,基因沉默組在3、6、12、24、48 h任一時(shí)間點(diǎn)IL-17 mRNA表達(dá)均低于正常對(duì)照組和基因沉默對(duì)照組(P<0.05),24 h IL-17比值最低(P<0.05)。見(jiàn)表1,圖2、3。

表1 基因沉默后Ast IL-17 mRNA表達(dá)(n=36)

圖2 Ast IL-17 mRNA結(jié)果

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)基因沉默后IL-17 mRNA表達(dá)

2.4 Western blotting 檢測(cè)IL-17蛋白在3、5、7 d的表達(dá)情況

基因沉默模型組IL-17蛋白表達(dá)在沉默后3、5、7 d持續(xù)受抑制(P<0.05)。IL-17 RNAiB沉默效果優(yōu)于IL-17 RNAiA,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05。見(jiàn)表2、圖4。

表2 基因沉默后Ast IL-17蛋白表達(dá)(n=36)

圖4 IL-17-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后,于第3、5、7 d進(jìn)行IL-17蛋白檢測(cè)結(jié)果

3 討論

在研究領(lǐng)域,為了解某一蛋白功能,方法之一就是在不表達(dá)該蛋白基因情況下,進(jìn)一步來(lái)觀察細(xì)胞或者動(dòng)物的生物學(xué)功能特點(diǎn),來(lái)揭示某種蛋白的作用及其機(jī)制,最具代表的技術(shù)就是RNAi技術(shù)和基因敲除技術(shù),RNAi技術(shù)主要應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究,而后者主要參與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究[6-8]。與基因敲除技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單,效果明顯,且技術(shù)難度低、費(fèi)用低、實(shí)驗(yàn)周期短等特點(diǎn)。

本研究應(yīng)用武漢晶賽生物技術(shù)公司構(gòu)建的特異攜帶有IL-17質(zhì)粒的圖譜及IL-17短發(fā)夾環(huán)質(zhì)粒載體基因自動(dòng)測(cè)序圖成功制備IL-17RNAi質(zhì)粒,制備2條干擾質(zhì)粒pGenesil-1A、B,均構(gòu)建成功。因?yàn)檗D(zhuǎn)染后可使Ast胞內(nèi)有較強(qiáng)的EGFP表達(dá),所以應(yīng)用Lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ast后48 h在熒光顯微鏡下觀察是否存在綠色熒光蛋白表達(dá)是轉(zhuǎn)染成功與否的標(biāo)志。該蛋白可在熒光顯微鏡下被激發(fā)綠色熒光,說(shuō)明轉(zhuǎn)染獲得成功,結(jié)果提示:pGenesil-1B表達(dá)的綠色熒光明顯多于pGenesil-1A,分別為56.72%±3.19%、16.72%±1.93%,說(shuō)明構(gòu)建的pGenesil-1B質(zhì)粒效果更佳,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選取pGenesil-1B質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。同時(shí)應(yīng)用基因沉默技術(shù)后觀察原代Ast細(xì)胞在IL-17基因沉默較對(duì)照組IL-17表達(dá)量顯著減低,基因沉默組分別在3、6、12、24、48 h任一時(shí)間點(diǎn)IL-17 mRNA表達(dá)均低于正常對(duì)照組和基因沉默對(duì)照組。同時(shí),基因沉默模型組IL-17蛋白表達(dá)在沉默后3、5、7 d明顯減少(P<0.05)。另外,IL-17 RNAiB沉默效果優(yōu)于IL-17 RNAiA,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明該技術(shù)可以成功抑制IL-17的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件的過(guò)程中,原代的Ast細(xì)胞具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài)是轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵因素之一。因此,在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇上,本實(shí)驗(yàn)選擇原代健康具有活力的Ast細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染成功率更高。

總之,應(yīng)用Lipofectamine2000可成功將IL-17 RNAi pGenesil-1轉(zhuǎn)染至原代的Ast,轉(zhuǎn)染效率較高,利用RNAi技術(shù)能有效抑制Ast中IL-17基因表達(dá),為研究IL-17在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供了有效的方法。