康云霞,何成彥,阿力木·羅合曼,何 平,孫景春

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130033)

結(jié)直腸癌是人類第三大常見癌癥,約占所有癌癥的10%,也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。2020年全球約有190萬新發(fā)病例和90萬死亡病例[1]。近年來,隨著經(jīng)濟發(fā)展以及生活方式和飲食的改變,中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率增加[2]。這給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此,識別和評估新的生物標(biāo)志物和治療靶點迫在眉睫。目前,蛋白酶體26S非ATP酶調(diào)節(jié)亞基7(PSMD7)的表達及其在結(jié)直腸癌進展中的作用在很大程度上仍然未知。本實驗通過分析PSMD7在結(jié)直腸癌組織中的表達,旨在為結(jié)直腸癌的診斷提供新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本實驗所用的標(biāo)本為吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2018至2020年經(jīng)外科手術(shù)切除的組織,共16對。所有患者在術(shù)前均未接受過任何治療,且經(jīng)病理確診為腺癌。在術(shù)中分離癌組織,同時在距離癌組織上段5 cm處采集癌旁標(biāo)本。將采集的標(biāo)本立刻用預(yù)冷的PBS徹底沖洗后,于-80℃冰箱中儲存。所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

美國Agilent公司的液相色譜分析儀,美國ThermoFisher公司的TLQXL離子阱質(zhì)譜儀,PSMD7抗體,β-actin多抗,蛋白定量試劑盒,DNA酶,RNA酶,PBS,裂解液,碘代乙酰胺,TPCK修飾的測序級胰酶,DTT,NH4HCO3,SDS,預(yù)制膠,苯甲基磺酰氟(PMSF)。

1.3 方法

1.3.1提取組織蛋白及測定濃度 在冰上配好裂解液,將癌組織與癌旁組織從-80℃冰箱中取出,加入液氮充分研磨后加入提前配好的裂解液,于冰上裂解30 min。去除掉樣品中殘留的DNA和RNA之后,低溫條件下12 000 rpm離心10 min,吸取上清液即得到總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,將蛋白樣品加入96孔板,測得其在562 nm處的吸光度值,繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算蛋白濃度。

1.3.2二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù) 將蛋白樣品制備成蛋白水解多肽混合物,將其溶解在0.1%的甲酸溶液中,用TLQXL離子阱質(zhì)譜儀檢測二維色譜分離的蛋白多肽后,得到質(zhì)譜圖。

1.3.3免疫印跡試驗 使用10%的預(yù)混膠試劑盒制膠,先配10%的APS溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用),按比例和順序加入分離膠A、分離膠B、APS及TEMED,充分混勻后灌入玻璃板,用水壓平,等待40～50 min。同樣按比例配置濃縮膠,灌入濃縮膠后插入梳子,等待濃縮膠完全凝固。提前計算好蛋白樣品的上樣體積,電泳槽內(nèi)加滿電泳液,孔內(nèi)加入Marker和蛋白樣品,所有的孔都用loading buffer配平。10V電泳20 min,然后80 V電泳1.5 h。將快速轉(zhuǎn)膜液按比例稀釋,400 mA冰浴轉(zhuǎn)膜24 min,快速封閉液封閉后,一抗孵育過夜。PBS-T洗膜3次,二抗4℃孵育1 h,PBS-T洗膜5次,最后ECL熒光化學(xué)法顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SEQUEST算法分析二維色譜與質(zhì)譜結(jié)果,利用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析所得數(shù)據(jù),P<0.05差異蛋白具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

本實驗的癌組織與癌旁組織每個蛋白的豐度通過譜圖數(shù)來衡量。衡量的標(biāo)準(zhǔn)如下:兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72;兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1。PSMD7作為其中一個上調(diào)蛋白,質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 PSMD7質(zhì)譜圖結(jié)果

2.2 免疫印跡試驗結(jié)果

分析16對組織中PSMD7的表達量,結(jié)果顯示PSMD7在結(jié)直腸癌組織表達量明顯高于癌旁組織,如圖2所示。

圖2 PSMD7 免疫印跡結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸癌是全球最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一,致死率較高。近年來,由于常規(guī)臨床檢查的普及、感染控制和手術(shù)技術(shù)的改善、成像技術(shù)的進步、以及化療和放療方面的進展,結(jié)直腸癌患者的5年生存率從50%上升到65%[3]。腫瘤的位置、年齡等因素是影響患者生存率的重要原因。局部結(jié)直腸癌患者的5年生存率可高達90%,區(qū)域轉(zhuǎn)移患者生存率降至71%,而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者生存率低至14%[4]。因此,早期發(fā)現(xiàn)和診斷對于預(yù)防結(jié)直腸癌至關(guān)重要。

PSMD7蛋白是小鼠Mov34基因的人類同源物,定位于人類染色體16q23-q24區(qū)域[5]。PSMD7有幾個明確的結(jié)構(gòu)域,包括C末端特征性的KEKE基序,MPR1p 和 PAD1p N 端(MPN)結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)域JAB[6]。MPN結(jié)構(gòu)域是JAMM家族的一個顯著特征。2004年,AMBROGGIO等[7]首次報道了原核生物黃球古菌AF2198(AfJAMM)的MPN結(jié)構(gòu)域蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。根據(jù)MPN結(jié)構(gòu)域蛋白是否具有異肽酶活性,可以進一步分為兩個亞家族:MPN+家族和MPN-家族。PSMD7屬于MPN-家族,其MPN結(jié)構(gòu)域顯示出典型的金屬蛋白酶折疊,但它無法配位金屬離子[8]。因此,PSMD7是催化失活的,似乎主要對26S蛋白酶體中的 Rpn11起支持作用[9]。PSMD7在多種類型的腫瘤進展中發(fā)揮作用。WANG等[10]的實驗發(fā)現(xiàn)PSMD7在胃癌組織中高表達,且PSMD7的過表達促進了胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,并且其通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測了PSMD7與RAD23B之間的相互作用,并通過免疫共沉淀證實了RAD23B是PSMD7的一種新型底物。XU等[11]的研究表明,敲低PSMD7通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白和p53通路來減少增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、衰老和凋亡,高PSMD7的表達預(yù)測肺腺癌患者的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)較差。還有研究通過對數(shù)據(jù)庫的挖掘發(fā)現(xiàn)PSMD7表達與腫瘤亞型、腫瘤大小、淋巴結(jié)浸潤和TNM分期密切相關(guān)。PSMD7敲低抑制關(guān)鍵細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達,促進p21和p27在乳腺癌細(xì)胞中的穩(wěn)定性[12]。此外,PSMD7下調(diào)有助于減緩腫瘤生長,抑制蛋白酶體功能,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和mTOR/p70S6K通路在體內(nèi)的活性減弱[13]。LC-MS將高分辨率LC與快速靈敏的MS檢測方法相結(jié)合,可以檢測數(shù)以萬計的蛋白質(zhì),同時提供有關(guān)蛋白質(zhì)豐度水平的相對定量信息。LC-MS已成為生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗證等轉(zhuǎn)化研究的強大工具[14]。

本研究通過LC-MS和免疫印跡證實了PSMD7在結(jié)直腸癌組織中高表達,提示PSMD7可能是結(jié)直腸癌的新的生物標(biāo)志物,為結(jié)直腸癌的臨床診斷提供了新的依據(jù)。但PSMD7在結(jié)直腸癌進展中的分子機制還不清楚,需要進一步研究。