劉偉光,王艷偉,劉方舟,崔學靜,李 勇,董曉偉,李 碩,戴璐嫻,盛安康,史素芳*

(1.揚州大學醫(yī)學院附屬揚州市婦幼保健院,江蘇 揚州225000;2.邯鄲市第一醫(yī)院,河北 邯鄲056002;3.河北工程大學管理工程與商學院,河北 邯鄲056002;4.邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲056002;5.邯鄲市第二醫(yī)院,河北 邯鄲056002;6.河北工程大學附屬醫(yī)院,河北 邯鄲056002)

據(jù)2020 年全球癌癥統(tǒng)計,乳腺癌(breast cancer,BC)的發(fā)病人數(shù)已經高于肺癌,占癌癥總人數(shù)的11.7%,同時發(fā)現(xiàn)在大部分國家中其發(fā)病率及死亡率位居第一[1-2]。由于乳腺癌的生物學因子多而復雜,目前最廣泛使用的臨床病理標志物(雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2和Ki-67)已經不足以完全評估其治療反應、轉移模式和臨床結果[3]。Rab溶酶體相互作用蛋白樣2(RILPL2)是一種含有與Rab溶酶體相互作用蛋白(RILP)相似結構域的蛋白質。已有實驗表明,RILPL2可能在調節(jié)子宮內膜癌免疫細胞浸潤中起關鍵作用,并與該類患者的預后密切相關[4]。本研究檢測RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織的陽性表達率及表達水平,分析其與乳腺癌患者的臨床病理指標之間的關系,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1患者一般資料 收集2021年1月至12月期間河北工程大學附屬醫(yī)院乳腺科90例經病理證實的單側乳腺癌患者?；颊吣挲g33～55歲,中位年齡44歲,均為女性。所有患者隨訪資料完整,術前均沒有放療、化療等抗腫瘤相關的治療史;術后均行蒽環(huán)類藥物治療,然后行紫杉類藥物化療。該研究依據(jù)《赫爾辛基宣言》進行,同時得到了河北工程大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準同意。

1.1.2組織標本收集 每例患者同時取乳腺癌組織和癌旁正常組織;癌旁正常組織均距癌組織 5 cm以上,經病理證實無癌細胞。

1.1.3主要試劑 組織免疫化學染色(SP 法)試劑盒、二硝基聯(lián)苯胺( DAB) 染色劑、RILPL2蛋白第一抗體均購自北京中杉金橋生物公司;組織蛋白裂解液、聚偏氟乙烯膜均購自山東亞亨生物公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學法 所有手術切除標本均經10%福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋后行4 μm 連續(xù)切片。染色方法與步驟按免疫組織化學(SP 法)試劑盒內的說明書進行。使用RILPL2蛋白第一抗體(稀釋1:300)對乳腺癌組織和癌旁正常組織分別進行染色和觀察,分析由兩名獨立的病理學家進行分析和判定。

1.2.2結果分析與判定 RILPL2的陽性染色位于細胞的胞膜和胞質。采用半定量計分法[5]判斷染色結果,計算組織切片中陽性細胞數(shù)目所占比例(≤25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,≥76%計4分)和染色強度(不染色計0分,淺黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分)的乘積。陰性(-)為<3分,弱陽性(+)為4～6分,中陽性(++)為7～9分,強陽性(+++)為>9分。

1.2.3蛋白免疫印跡分析RILPL2在組織中的表達 收集兩種組織,并用磨漿機將其磨為勻漿。用蛋白裂解緩沖液裂解。提取組織中的總蛋白并使用蛋白檢測試劑盒測定其濃度。將60 μg蛋白質進行凝膠電泳,并轉移到聚偏氟乙烯膜上進行免疫印跡。在室溫下,將膜封閉1 h,然后在4℃下與RILPL2蛋白第一抗體(稀釋1∶500)孵育過夜,隨后在室溫下與第二抗體孵育2 h。膜上的蛋白質通過增強化學發(fā)光后通過圖像分析儀進行定量。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗比較其差異;計數(shù)資料以n(%)表示,采用χ2檢驗分析RILPL2與臨床病理指標之間的相關性,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RILPL2在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達

在癌旁正常組織中,RILPL2蛋白陽性染色呈棕黃色,主要染色于乳腺腺泡細胞的細胞質,細胞核不被染色;在乳腺癌組織中,RILPL2蛋白陽性染色為棕黃色,主要染色于乳腺癌細胞的細胞質和細胞膜,細胞核不被染色,并且其染色明顯比癌旁正常組織淺(見圖1)。

圖1 RILPL2在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(×400)

2.2 RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的陽性表達率比較

免疫組織化學法分析90例乳腺癌組織和癌旁正常組織中RILPL2的表達,結果顯示乳腺癌組織陽性表達率為32.22%(29/90),明顯低于癌旁正常乳腺組織中的66.7%(60/90)(χ2=21.358,P<0.01),見表1。

表1 RILPL2在癌組織和癌旁正常組織中的表達

2.3 RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達水平

采用蛋白免疫印跡法評估RILPL2蛋白在乳腺癌組織及其癌旁正常組織中的相對表達水平,如圖2所示。乳腺癌組織中RILPL2蛋白的相對表達水平(0.990±0.038)明顯低于其在癌旁的正常乳腺組織的相對表達水平(0.625±0.023)(t=34.412,P<0.01)。

注:1—癌旁正常組織,2—乳腺癌組織

2.4 RILPL2與乳腺癌患者臨床病理特征的關系

單因素分析顯示,RILPL2表達與患者年齡無關(χ2=0.169,P>0.05),而與患者的腫瘤大小(χ2= 62.912,P<0.01)、組織學分級(χ2=56.535,P<0.01)、腋窩淋巴結轉移(χ2=4.632,P<0.05)有關,見表2。

表2 RILPL2的表達與乳腺癌患者臨床病例特征的關系

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于中老年女性的一種比較常見的腫瘤性疾病,尤其是絕經后的女性[6]。近年來,由于人們的生活方式及節(jié)奏的改變,此病的發(fā)病率表現(xiàn)為逐年增長的趨勢,對女性的生活質量和生命健康造成嚴重的影響。乳腺癌具有異質性,這不僅體現(xiàn)在其臨床表征和病理特征的不同,而且還觀察到不同乳腺癌亞型之間表達的生物學分子不同[7-8]。普遍認為導管型乳腺癌的預后優(yōu)于其他亞型,因為HER2和TNBC亞型經過治療后往往容易發(fā)生復發(fā)和轉移[9-10]。因此,探索并充分了解乳腺癌的分子亞型或生物分子標志物對治療方案的選擇起關鍵作用。

Rab溶酶體相互作用蛋白樣2基因編碼一種與RILP相似的含有Rab溶酶體相互作用蛋白樣結構域。Rab7/Rab34復合體的形成促進RILP和動力蛋白-動態(tài)蛋白之間的相互作用,以引導晚期內體和溶酶體向微管運動[11]。與RILP不同,RILPL2不包括Rab7鏈接區(qū),此鏈接區(qū)阻止溶酶體隔室異位表達[12]。盡管RILPL2不影響溶酶體的運輸,由于其與活化的Rab34和Rab36相互作用,故它仍可能作為功能性Rab效應器[13-14]。LISE等[15]使用減少RILPL2突變或抑制MyoVa功能來表明RILPL2-MyoVa相互作用破壞抑制RILPL2的活性和隨后Rac1的激活。因此,MyoVa介導的轉運對RILPL2在神經元調節(jié)中的功能很重要。此外,先前的研究表明,RILPL2在病毒復制中發(fā)揮作用,可作為丙型肝炎病毒(HCV)治療乳腺癌的潛在靶點[16]。

文獻研究表明,RILPL2在機體多種組織中均有表達,其中包括大腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胰腺和胎盤等組織[12]。實驗研究顯示,RILPL2在子宮內膜癌組織中呈低表達,并且其表達水平與患者的預后顯著相關,即表達水平升高的患者預后較好[17]。因此,RILPL2可以作為判斷子宮內膜癌患者預后的生物分子標志物。本研究實驗結果顯示,RILPL2在乳腺癌組織中呈低表達,而在癌旁正常組織中呈高表達;其在乳腺癌組織陽性表達率、表達水平明顯低于癌旁正常乳腺組織;RILPL2表達與患者年齡無關,而與患者的腫瘤分期、組織學分級、腋窩淋巴結轉移有關。因此,這說明RILPL2可能作為一種新的評估乳腺癌復發(fā)風險的生物標志分子并指導乳腺癌精準治療,然而RILPL2與其他病理標志物的相關性需待進一步的實驗進行驗證。