葛金麗, 李 行, 李 強(qiáng), 柘娜娜, 周震滄, 劉兆玉

遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(遵義市第一人民醫(yī)院)血液內(nèi)科,遵義 563000

多發(fā)性骨髓瘤是一種成熟B淋巴細(xì)胞惡性增生性疾病,嚴(yán)重威脅患者生命安全,但其發(fā)病機(jī)制尚未闡明[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)可以充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿調(diào)控miRNA水平。多項(xiàng)研究顯示,circRNA在多發(fā)性骨髓瘤中表達(dá)異常,并可在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用[3]。circ_NEK6在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平升高,并可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-382-5p而促進(jìn)乳腺癌擴(kuò)增序列2(BCAS2)的表達(dá)從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[4]。但circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)程中的作用尚不清楚。既往的報(bào)道顯示,miR-503-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[5],但其是否調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)程還未見報(bào)道。Starbase軟件分析結(jié)果顯示circ_NEK6可以與miR-503-5p互補(bǔ)結(jié)合。因此,我們推測(cè)circ_NEK6可能靶向miR-503-5p而調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤惡性進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

招募30例多發(fā)性骨髓瘤患者為研究組,其中男18例,女12例,年齡47～68歲,平均年齡(60.32±4.26)歲。同時(shí)選取在本院體檢的55例健康志愿者為對(duì)照組,其中男35例,女20例,年齡42～70歲,平均年齡(59.36±5.12)歲。所有受試者均簽署了知情同意書,且本研究獲得了遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

人多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞購(gòu)自上海通派公司;DMEM培養(yǎng)液(貨號(hào):11965092)與胎牛血清(貨號(hào):10100147)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Trizol試劑(貨號(hào):15596026)、Lipofectamine3000(貨號(hào):L3000075)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;反轉(zhuǎn)錄(貨號(hào):KR107)與熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào):FP217)購(gòu)自北京天根公司;si-circ_NEK6、miR-503-5p mimics、anti-miR-503-5p及相應(yīng)的對(duì)照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)由廣州銳博公司合成;MTT試劑(貨號(hào):C0009 S)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):C1062S)購(gòu)自上海碧云天公司;Transwell小室(貨號(hào):3422)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E1910)購(gòu)自美國(guó)Promega公司;兔抗人Bax(貨號(hào):ab32503)、Bcl-2(貨號(hào):ab32124)、GAPDH(貨號(hào):#5174)抗體與二抗(貨號(hào):ab205718)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 分別抽取多發(fā)性骨髓瘤患者和健康志愿者清晨空腹靜脈血5 mL,3000 r/min離心10 min,吸取上清液后保存于-80℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 U266細(xì)胞接種于6孔板,按照Lipofectamine3000說明書采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-circ_NEK6、miR-503-5p mimics、anti-miR-503-5p及相應(yīng)的對(duì)照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)266細(xì)胞,隨后將細(xì)胞分為si-circ_NEK6組、si-NC組、miR-503-5p組、miR-NC組、si-circ_NEK6+anti-miR-NC組和si-circ_NEK6+anti-miR-503-5p組。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說明書,使用Trizol試劑提取總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_NEK6和miR-503-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) U266細(xì)胞接種于96孔板,每個(gè)孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL),孵育4 h。去除上清液后,向每個(gè)孔中加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶,最后應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔490 nm處吸光度值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 以每孔500個(gè)細(xì)胞將U266細(xì)胞接種于含有完全培養(yǎng)液的6孔板中孵育。每3天更換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d,用甲醇固定形成的細(xì)胞克隆30 min,用0.1%結(jié)晶紫染色15 min,最后在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆形成數(shù)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 收集各組U266細(xì)胞加入胰蛋白酶消化,洗滌后,將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液重懸,然后依次與5 μL Annexin Ⅴ-FITC和20 μL PI黑暗中染色15 min。應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 將5×105U266細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液重懸后加入Transwell小室的上室,并將含有10%血清的培養(yǎng)液用作化學(xué)引誘劑加入下室中。24 h后,將細(xì)胞膜下側(cè)的遷移細(xì)胞用多聚4%甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min,并在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域的遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)Starbase預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn),將預(yù)測(cè)的序列和通過點(diǎn)突變獲得突變序列分別克隆到pmirGLO雙熒光素酶載體中,構(gòu)建野生型載體wt-circ_NEK6與突變型載體mut-circ_NEK6。隨后將構(gòu)建的載體與miR-NC或miR-503-5p mimics共轉(zhuǎn)染至U266細(xì)胞。48 h后,使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量用RIPA裂解液提取蛋白并用BCA檢測(cè)濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉后,膜與anti-Bax(1∶1000)、anti-Bcl-2(1∶1000)、anti-GAPDH(1∶2000)孵育,然后用二抗(1∶3000)處理。使用ECL發(fā)光液顯示蛋白條帶,并用Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ_NEK6和miR-503-5p的表達(dá)

相較于對(duì)照組,circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中高表達(dá)[(2.53±0.30)vs.(0.93±0.17),P<0.01],而miR-503-5p在患者血清中低表達(dá)[(0.45±0.10)vs.(1.11±0.17),P<0.05],相較于正常漿細(xì)胞(nPCs),circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266中高表達(dá)[(2.84±0.26)vs.(1.00±0.08),P<0.01],而miR-503-5p在U266中低表達(dá)[(0.36±0.18)vs.(1.05±0.09),P<0.01],高表達(dá)circ_NEK6或低表達(dá)miR-503-5p與患者預(yù)后差相關(guān)(均P<0.05)。

2.2 抑制circ_NEK6對(duì)U266細(xì)胞功能的影響

相較于si-NC組,si-circ_NEK6轉(zhuǎn)染顯著降低U266細(xì)胞中circ_NEK6的表達(dá)量(P<0.01),同時(shí)伴隨著細(xì)胞中miR-503-5p表達(dá)升高(P<0.01)。進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)顯示,si-circ_NEK6轉(zhuǎn)染導(dǎo)致U266細(xì)胞增殖抑制率升高,凋亡率升高,克隆形成數(shù)量以及細(xì)胞遷移數(shù)量減少(均P<0.01)。此外,si-circ_NEK6轉(zhuǎn)染抑制U266細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)(均P<0.01),見圖1、表1。

表1 circ_NEK6抑制對(duì)U266細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響Table 1 Effects of circ_NEK6 inhibition on proliferation,apoptosis and migration of U266

A:Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖1 circ_NEK6抑制對(duì)U266細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of circ_NEK6 inhibition on U266 cell apoptosis and related protein expression

2.3 circ_NEK6靶向miR-503-5p

通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出miR-503-5p在circ_NEK6上存在互補(bǔ)序列,見圖2。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-503-5p過表達(dá)抑制wt-circ_NEK6的熒光素酶活性[(0.44±0.05)vs.(0.99±0.07),P<0.01],而不影響mut-circ_NEK6的熒光素酶活性[(0.97±0.06)vs.(0.98±0.09),P>0.05],證明miR-503-5p是circ_NEK6下游靶標(biāo)。

圖2 circ_NEK6和miR-503-5p的互補(bǔ)序列Fig.2 The complementary sequence of circ_NEK6 and miR-503-5p

2.4 miR-503-5p對(duì)U266細(xì)胞功能的影響

相較于miR-NC組,miR-503-5p轉(zhuǎn)染后U266細(xì)胞中miR-503-5p含量顯著升高(P<0.01)。進(jìn)一步功能試驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)miR-503-5p后U266細(xì)胞增殖抑制率升高,凋亡率升高,克隆形成數(shù)量以及細(xì)胞遷移數(shù)量減少(均P<0.01)。此外,上調(diào)miR-503-5p抑制U266細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)(均P<0.01),見圖3、表2。

表2 miR-503-5p對(duì)U266細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響Table 2 Effects of miR-503-5p on U266 cell proliferation,apoptosis and

A:Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖3 miR-503-5p對(duì)U266細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-503-5p on U266 cell apoptosis and related protein expression

2.5 抑制miR-503-5p影響si-circ_NEK6介導(dǎo)的U266細(xì)胞增殖和遷移

si-circ_NEK6+anti-miR-503-5p組U266細(xì)胞中miR-503-5p含量相較于si-circ_NEK6+anti-miR-NC組顯著降低,證明轉(zhuǎn)染成功。隨后我們發(fā)現(xiàn)敲低miR-503-5p逆轉(zhuǎn)si-circ_NEK6介導(dǎo)的增殖抑制率升高、克隆形成數(shù)量以及細(xì)胞遷移數(shù)量減少(均P<0.01),見表3。

表3 miR-503-5p抑制劑對(duì)si-circ_NEK6介導(dǎo)的U266細(xì)胞增殖和遷移的影響Table 3 Effects of miR-503-5p inhibitor on si-circ_NEK6-mediated proliferation and migration of U266

2.6 抑制miR-503-5p影響si-circ_NEK6介導(dǎo)的U266細(xì)胞凋亡

此外,我們還證實(shí)anti-miR-503-5p轉(zhuǎn)染相較于anti-miR-NC轉(zhuǎn)染可以減弱si-circ_NEK6介導(dǎo)的凋亡率升高(P<0.01),Bfile:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/2023.10/TJYX202304/TJYX202304.ebook/images/bcaf374d2474e657bfcfeb83e3ecd44e0.jpgax高表達(dá)以及Bcl-2低表達(dá)(均P<0.01),見圖4、表4。

表4 miR-503-5p抑制劑對(duì)si-circ_ NEK6介導(dǎo)的U266細(xì)胞凋亡的影響Table 4 Effects of miR-503-5p inhibitor on si-circ_NEK6-mediated U266 cell

A:Western blot檢測(cè)Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖4 miR-503-5p抑制劑對(duì)si-circ_NEK6介導(dǎo)的U266細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR-503-5p inhibitor on si-circ_NEK6-mediated U266 cell apoptosis and related protein expression

3 討論

circRNA在各種組織中高度豐富,并由于其環(huán)狀結(jié)構(gòu),相較于其他線性RNA非常穩(wěn)定[6]。近年來,已有研究表明,circRNAs具有多種生物學(xué)功能,并與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[7]。多發(fā)性骨髓瘤約占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%,目前,盡管該疾病的治療已取得重大進(jìn)展,使多發(fā)性骨髓瘤患者的生存率在過去的15年里有了顯著的改善[8],但患者仍然面臨著疾病的復(fù)發(fā),其治愈仍然難以實(shí)現(xiàn)。靶向治療是一種針對(duì)控制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和擴(kuò)散的蛋白質(zhì)的癌癥治療方法。它是精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)。越來越多的證據(jù)表明circRNAs是靶向治療的潛在靶點(diǎn)[9]。circRNA在多發(fā)性骨髓瘤組織中差異表達(dá),可能作為多發(fā)性骨髓瘤治療、診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[10]。研究表明circRNA可通過調(diào)控miRNA/mRNA分子軸而參與多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生及發(fā)展過程[11]。因此,本文對(duì)circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤中的作用進(jìn)行了研究,并探討了circ_NEK6能否作為該病的治療靶點(diǎn)。

有研究表明,circ_NEK6在甲狀腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá),并可通過靶向調(diào)控miR-370-3p表達(dá)而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖及侵襲[12]。circ_NEK6高表達(dá)可通過調(diào)控miR-370-3p/MYH9表達(dá)而促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)展進(jìn)程[13]。本研究結(jié)果顯示,circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中上調(diào),敲低后可抑制細(xì)胞增殖和遷移,提示circ_NEK6可促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖和遷移。此外,我們還發(fā)現(xiàn)敲低circ_NEK6表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高。Bax和Bcl-2都是細(xì)胞質(zhì)蛋白,Bax蛋白是促凋亡蛋白,通過從線粒體釋放細(xì)胞色素c激活級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而促進(jìn)Caspase的連續(xù)激活并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,被認(rèn)為可以阻止Bax釋放細(xì)胞色素c,從而抑制凋亡機(jī)制的下游激活,誘導(dǎo)細(xì)胞存活[14]。在此,敲低circ_NEK6提高了細(xì)胞凋亡率和Bax水平,而降低了Bcl-2水平,進(jìn)一步提示circ_NEK6對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡有抑制作用。因此circ_NEK6 siRNA的使用可能是未來多發(fā)性骨髓瘤circRNA靶向治療的研究方向。

circRNA被廣泛報(bào)道的功能是充當(dāng)miRNA海綿,miRNA通常與靶mRNA結(jié)合誘導(dǎo)mRNA降解或翻譯抑制,circRNA通過廣泛結(jié)合miRNA,降低其活性,從而上調(diào)其靶mRNAs的表達(dá)[15]。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們指出circ_NEK6可靶向miR-503-5p。報(bào)道顯示,miR-503-5p可通過靶向調(diào)控TRAF4表達(dá)而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲[16]。在本研究,miR-503-5p在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中低表達(dá),且能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)以及遷移。此外,miR-503-5p抑制劑可消除circ_NEK6敲低對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用,提示circ_NEK6可充當(dāng)miR-503-5p的海綿而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移。miRNAs最近被發(fā)現(xiàn)在癌癥中調(diào)節(jié)JAK-STAT信號(hào),JAK2/STAT3通路的磷酸化與抗凋亡有關(guān)[17]。在多發(fā)性骨髓瘤中,JAK/STAT3信號(hào)通路的激活依然發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。miR-503-5p能夠抑制JAK/STAT3磷酸化,抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活,從而抑制卵巢癌的惡化[18]。因此,miR-503-5p可能是通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移,這還需要我們?cè)诤罄m(xù)的研究中進(jìn)一步的探索和論證。

綜上所述,circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤患者血清中表達(dá)上調(diào),而miR-503-5p表達(dá)下調(diào)。circ_NEK6可負(fù)向調(diào)控miR-503-5p的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移。本研究指出,靶向抑制circ_NEK6可能是治療多發(fā)性骨髓瘤的有效途徑,填補(bǔ)了circ_NEK6在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制中分子作用的知識(shí)空白。