陳 潔, 王 陽, 金 曙, 李 歡, 龍 輝, 吳清明,3△

1 武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430064 2 湖北省十堰市太和醫(yī)院消化內(nèi)科,十堰 442099 3武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院感染免疫腫瘤微環(huán)境研究所,職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室,武漢 430070

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球發(fā)病率和死亡率前3位的癌癥[1],因其起病隱匿、發(fā)病緩慢,早期篩查使得它成為可以預(yù)防和治愈的疾病,降低其死亡率,減少經(jīng)濟負擔(dān)[2]。目前CRC的早期診斷方法分為侵入性檢查和非侵入性檢查。侵入性檢查主要是腸鏡檢查,是CRC診斷的金標準,但并不推薦用于CRC人群篩查的首選[3-4]。非侵入性檢查包括實驗室檢查(糞便樣本、血液樣本)和影像學(xué)檢查,其中定量糞便免疫化學(xué)檢測(quantitative fecal immunochemical test,qFIT)和糞便分子檢測備受關(guān)注。qFIT利用血紅蛋白抗原抗體反應(yīng)的原理進行檢測下消化道出血,不受飲食或藥物影響,適用于人群篩查[5],但對結(jié)腸腺瘤的敏感度及特異度不高。miRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,可以用于CRC的早期診斷[6]。研究顯示miRNA675-5p在CRC發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6],在癌組織中和CRC患者血液中高表達[7-8]。血清miR-675有可能作為CRC早期檢測和預(yù)后預(yù)測的生物標志物[9]。為進一步提高檢測的特異度和敏感度,可以進行聯(lián)合檢測,對結(jié)直腸癌患者、腺瘤患者、息肉患者及正常對照組的糞便樣本進行miRNA675-5p聯(lián)合qFIT檢測,評估其在結(jié)直腸癌篩查中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2021年12月于武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院、十堰市太和醫(yī)院就診的經(jīng)結(jié)腸鏡和活組織檢查確診的48例結(jié)直腸癌、46例腺瘤、42例息肉患者的臨床資料和糞便標本。此外選取37例健康人作為正常對照組。納入標準:(1)醫(yī)院病理檢查明確診斷為結(jié)直腸癌、腺瘤、息肉;(2)腫瘤患者均為首次確診病例,無復(fù)發(fā);(3)收集糞便標本前未行相關(guān)藥物治療或侵入性腸道操作。排除標準:(1)腫瘤患者檢查前已接受手術(shù)或放化療等;(2)曾行腸道手術(shù),患有自身免疫性疾病或一些消化系統(tǒng)的器質(zhì)性疾病如炎癥性腸病,腸結(jié)核等;(3)因各種原因未行結(jié)腸鏡檢查者;(4)糞便為水樣便或未按照要求留便;(5)合并其他惡性腫瘤。結(jié)直腸癌組中男27例,女21例,年齡(63.46±13.29)歲(范圍:33～86歲);腺瘤組中男31例,女15例,年齡(62.52±10.04)歲(范圍:43～86歲);息肉組中男29例,女13例,年齡(59.9±6.86)歲(范圍:48～74歲);正常對照組中男8例,女29例,年齡(29.19±18.74)歲(范圍:18～77歲)。結(jié)直腸癌組、腺瘤組、息肉組在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),具有可比性。本研究中所有研究對象均自愿參加并簽署知情同意書,該研究方案經(jīng)本院倫理委員會審批通過(倫理號:201512、LL-2022-11-28-01)。

1.2 研究方法

在術(shù)前或內(nèi)鏡檢查前留取約2～5 g糞便放入糞便收集器中,放置-80℃冰箱留存,用于miRNA的提取檢測,并用qFIT采便器留取糞便標本進行qFIT檢測。本實驗所有結(jié)腸鏡檢查由具有高級職稱的內(nèi)鏡醫(yī)師開展。若鏡下發(fā)現(xiàn)異常病變,均取組織活檢以明確病理診斷,并記錄相應(yīng)病變的大小、顏色、形態(tài)、數(shù)目、與周圍組織關(guān)系等。根據(jù)結(jié)腸鏡和活組織病理檢查結(jié)果,分為結(jié)直腸癌組、腺瘤組、息肉組和正常對照組。

1.3 miRNA675-5p的檢測方法

1.3.1 主要儀器和試劑 科鹿(武漢)生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒(EP014)、核酸純化試劑盒(EP013)、第一鏈cDNA合成試劑盒(EQ003),EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix,熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex)購自美國生命技術(shù)公司。熒光定量PCR所用引物為武漢恒意賽生物科技有限公司合成,引物序列:miRNA675-5p上游引物:5′-CTTGGTGCGGAGAGGGC-3′,下游引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′;內(nèi)參基因U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.3.2 qRT-PCR檢測 Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,產(chǎn)物用于qRT-PCR擴增。實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成,每個樣品均作3個復(fù)孔,使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行(ELK Biotechnology,EQ001)。反應(yīng)體系為:2× Master Mix 5.0 μL,引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μL,Template 1.0 μL,ddH2O 2.0 μL,Rox 1.0 μL。反應(yīng)程序為:預(yù)變性95℃,3 min,95℃,10 s→58℃,30 s→72℃,30 s,循環(huán)(40次)。反應(yīng)結(jié)束后生成熒光定量值動態(tài)曲線,分析顯示結(jié)果及循環(huán)閾值(Ct)。對照為U6基因。采用F=2-ΔΔCt法分析比較目的基因在結(jié)直腸癌、腺瘤、息肉及正常對照組糞便中的表達。ΔΔCt=(Ct miRNA675-5p-CtU6)實驗組-(Ct miRNA675-5p-CtU6)對照組。

1.4 qFIT檢測方法

1.4.1 主要儀器和試劑 高敏定量糞便血紅蛋白檢測系統(tǒng)專用機(FC-100B)、采便管、大便隱血試劑。

1.4.2 qFIT檢測 嚴格按照要求及說明書進行qFIT檢測,結(jié)果<10 μg/g為陰性,≥10 μg/g以具體數(shù)值表示;兩份檢測結(jié)果取最大值為最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組qFIT檢測

結(jié)直腸癌組的qFIT值[259.94(36.25,758.55)]明顯高于腺瘤組[0(0,13.42)]、息肉組[0(0,0)]、正常對照組[0(0,0)](均P<0.01),腺瘤組高于息肉組和正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);息肉組和正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.365)。如表1所示。

表1 各組qFIT檢測結(jié)果比較Table 1 Comparison of qFIT test results among all groups

2.2 qFIT檢測對結(jié)直腸癌、腺瘤的診斷價值

將結(jié)直腸癌組、腺瘤組分別與正常對照組比較,利用ROC診斷模型,繪制結(jié)直腸癌組qFIT的ROC曲線,得出AUC:0.925,95%CI(0.864,0.987),應(yīng)用約登指數(shù)算出,當(dāng)qFIT的截斷值為21.435 ug/g時,其預(yù)測腸癌的敏感度為85.4%(41/48),特異度為100%(37/37),約登指數(shù)為0.854(圖1)。腺瘤組qFIT的ROC曲線,得出AUC:0.630,95%CI(0.511,0.749)。應(yīng)用約登指數(shù)算出,當(dāng)qFIT的截斷值為5.39 μg/g時,其預(yù)測腺瘤的敏感度為28.3%(13/46),特異度為97.3%(36/37),約登指數(shù)為0.256(圖2)。

圖1 結(jié)直腸癌組qFIT檢測ROC曲線Fig.1 ROC curve of colorectal cancer group detected by qFIT

圖2 腺瘤組qFIT檢測ROC曲線Fig.2 ROC curve of adenoma group detected by qFIT

2.3 miRNA675-5p聯(lián)合qFIT檢測對結(jié)直腸癌、腺瘤的診斷價值

將結(jié)直腸癌組、腺瘤組分別與正常對照組比較,利用ROC診斷模型,繪制結(jié)直腸癌組聯(lián)合檢測(miRNA675-5p聯(lián)合qFIT)的ROC曲線的AUC:0.993,95%CI(0.945,1.000)(圖3),聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌診斷的敏感度100%(48/48),特異度89.2%(33/37)。腺瘤組聯(lián)合檢測(miRNA675-5p聯(lián)合qFIT)的ROC曲線,得出AUC:0.897,95%CI(0.810,0.953)(圖4)。聯(lián)合檢測對腺瘤診斷的敏感度71.7%(33/46),特異度86.5%(32/37)。結(jié)直腸癌組聯(lián)合檢測ROC曲線的AUC(0.993)值高于qFIT單獨檢測AUC值(0.925)(P<0.01)。腺瘤組聯(lián)合檢測AUC(0.897)值明顯高于qFIT單獨檢測AUC值(0.630)(P<0.01)。如表2。

圖3 結(jié)直腸癌組miRNA675-5p聯(lián)合qFIT檢測ROC曲線Fig.3 ROC curve was detected by miRNA675-5p combined with qFIT in colorectal cancer group

圖4 腺瘤組miRNA675-5p聯(lián)合qFIT檢測ROC曲線Fig.4 ROC curve was detected by miRNA675-5p combined with qFIT in the adenoma group

表2 結(jié)直腸癌組、腺瘤組聯(lián)合檢測和qFIT檢測曲線下面積的比較Table 2 Comparison of area under the curve between colorectal cancer group and adenoma group and qFIT test

2.4 qFIT檢測與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

從病歷系統(tǒng)查詢患者的臨床資料,將腸癌患者按照年齡分為≤60歲和>60歲組。按照性別分為男性、女性。按照分化程度分為高、中、低組。按照腫瘤的部位分成結(jié)腸組(左半結(jié)腸,右半結(jié)腸)和直腸組。按照Dukes分期分為A、B期和C、D期。本研究以qFIT中位數(shù)259.94為截斷值,將結(jié)直腸癌組48例患者分成高表達組、低表達組。應(yīng)用χ2檢驗,結(jié)果表明qFIT檢測值與年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度、Dukes分期均無明顯相關(guān)性(均P>0.05)。如表3。

表3 qFIT值與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between qFIT value and clinicopathological features of colorectal cancer

3 討論

結(jié)直腸癌(CRC)是作為可以預(yù)防的疾病,早期篩查是至關(guān)重要的,雖然結(jié)腸鏡是診斷結(jié)直腸癌最有效的方法,但不適合于人群篩查。糞便免疫化學(xué)檢測(fecal immunochemical test,FIT)是目前國內(nèi)外推薦結(jié)直腸癌篩查的首選檢查[3],其原理是檢測糞便中的人類血紅蛋白含量。研究表明FIT可減少34%的結(jié)直腸癌發(fā)生率及40%的結(jié)直腸癌死亡率,遠端結(jié)腸發(fā)病率和死亡率下降均高于近端結(jié)腸(發(fā)病率39%vs.16%和CRC死亡率44%vs. 28%)[5]。FIT分為定性和定量FIT(qFIT)。定性FIT具有不穩(wěn)定性和主觀性,且檢測下限較高,導(dǎo)致出血量較少的病變漏診。qFIT是一種自動化的、批量處理的、基于實驗室的定量分析方法,其檢測下限值為10 μg/g,低于定性法檢測下限,可更加客觀、穩(wěn)定、迅速地獲取檢測結(jié)果,更加適合于大樣本的人群篩查。并且截斷值越低,越能篩查出出血量較少的腸道病變,可以提高腺瘤檢出率,優(yōu)于定性FIT,目前在國內(nèi)大規(guī)模人群篩查中應(yīng)用較少[4]。本研究中qFIT預(yù)測結(jié)直腸癌和腺瘤的敏感度為85.4%和28.3%。與文獻報道[10]的qFIT檢測腸癌和腺瘤的敏感度(56.3%～81.3%和13%～30.5%)相一致。本研究qFIT預(yù)測結(jié)直腸癌和腺瘤的曲線下面積分別為0.925,0.630,與Imperiale等[11]的研究結(jié)果相似(腸癌AUC:0.89,腺瘤AUC:0.67)。雖然FIT是目前應(yīng)用最廣泛的CRC篩查手段,但它對早期的CRC和腺瘤的敏感度相對較低[12]。此外,一些因素可能會影響FIT檢測結(jié)果并導(dǎo)致假陽性,一項薈萃分析表明女性與男性相比,假陽性率明顯更高。有消化性潰瘍和肛裂病史的患者由于出血風(fēng)險較高,也往往有假陽性結(jié)果,且使用NSAIDs藥物(如阿司匹林)可能導(dǎo)致較高的假陽性率[13-14]。癌癥篩查必須有足夠的敏感度,因為它的主要目標是篩出癌前病變和早期癌癥。大約85%的結(jié)直腸癌病變源于腺瘤。因此,有效地檢測腺瘤是CRC篩查的關(guān)鍵,同時需要提高腺瘤檢出敏感度,為了彌補FIT的缺陷,可以進行聯(lián)合檢測來提高癌前病變和早期癌癥檢出率。

microRNA(miRNA或微小RNA)被認為在腫瘤細胞的異?；虮磉_中起重要作用,并且具有細胞類型和疾病特異性,因此可能是很好的診斷性生物標志物[15]。糞便miRNA的檢測近年來被認為是一種潛在的更有效的篩查方法,具有較高的敏感度和特異度,特別是對于診斷早期CRC和腫瘤前病變。

本研究共納入48例結(jié)直腸癌患者,僅有24例有手術(shù)標本的病理組織報告,可以進行分期,其中有14例A、B期,10例C、D期。另外將年齡、性別、分化程度、腫瘤發(fā)生部位進行比較,結(jié)果顯示qFIT在結(jié)直腸癌組的表達與年齡、性別、分化程度、腫瘤部位均無明顯相關(guān)性(均P>0.05)。

當(dāng)然本研究納入的樣本量較少,可能存在偏倚,未來可進行多個不同地域的多中心研究,進一步驗證miRNA675-5p聯(lián)合qFIT對結(jié)直腸腺瘤的篩查價值,從而降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率,真正使結(jié)直腸癌成為一種可治愈的疾病。

綜上所述,本研究將miRNA675-5p和qFIT進行聯(lián)合檢測,用于診斷CRC和腺瘤的AUC均高于單獨檢測,且診斷效能較高,因此,糞便miRNA675-5p和qFIT聯(lián)合檢測為CRC早期無創(chuàng)診斷提供了一種新的篩查策略。