韓 雪, 張新敏, 陳岱莉, 曹 君, 黃曉雷△

1 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科,廣州 510120 2吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科,長(zhǎng)春 130061 3南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院麻醉科,深圳 518028

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是造成腸缺血/再灌注(intestinal ischemia/reperfusion,II/R)損傷的重要病理生理機(jī)制之一[1]。組織器官低灌注導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞缺血缺氧;當(dāng)血液再流通(再灌注)時(shí),大量生成的活性氧(reactive oxygen species,ROS)造成氧化應(yīng)激通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài),進(jìn)而誘導(dǎo)大量促炎介質(zhì)和促凋亡因子釋放,加劇再灌注后損傷[2-3]。因此,如何減少再灌注過(guò)程中ROS的生成及氧化應(yīng)激損傷一直是防治II/R損傷的研究熱點(diǎn)。

有氧運(yùn)動(dòng)(aerobic exercise)是一種全身性的生理性鍛煉過(guò)程[4],目前關(guān)于其對(duì)II/R損傷的研究并不多見(jiàn)。近期的隨機(jī)對(duì)照研究顯示[5-6],規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力和抗氧化系統(tǒng)水平,在抗氧化應(yīng)激方面發(fā)揮預(yù)防作用。然而,對(duì)于急危重癥或限期手術(shù)患者來(lái)說(shuō),術(shù)前的有氧訓(xùn)練干預(yù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此,尋找有氧運(yùn)動(dòng)保護(hù)作用的分子機(jī)制顯得尤為重要。叉頭框家族蛋白O3a(forkhead box O3a,FoxO3a)是叉頭框蛋白家族的O亞型,具有修復(fù)受損DNA、抗氧化應(yīng)激等生理調(diào)節(jié)作用[7]。FoxO3a增加錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase,MnSOD)的表達(dá)保護(hù)靜止細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[8];同時(shí),FoxO3a可以通過(guò)與過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPAR-γ)共激活因子1α(PPAR-γ coactivator 1α,PGC1α)的直接相互作用來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[9]。FoxO3a的活性主要受上游通路引起的磷酸化/去磷酸化、乙?；?去乙?；确g后修飾調(diào)控。修飾后的FoxO3a亞細(xì)胞定位發(fā)生改變,通過(guò)調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮病理生理作用[10]。然而,FoxO3a在II/R損傷中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道,MnSOD及PGC1α作為FoxO3a下游主要的抗氧化酶在II/R損傷過(guò)程中是否被激活目前尚未知。本研究擬將游泳訓(xùn)練作為II/R前干預(yù)手段,研究有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)C57BL/6小鼠II/R后小腸組織氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用,同時(shí)觀察小腸細(xì)胞內(nèi)FoxO3a活性和亞細(xì)胞定位變化,為防治II/R提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)C57BL/6小鼠[雄性,6～8周齡,(17.89±2.01)g]由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1周進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)環(huán)境,普通飼料喂養(yǎng),自由飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在符合動(dòng)物福利條件下施行。

C57BL/6小鼠隨機(jī)分為靜息+假手術(shù)(Sedentary+Sham,SS)組、靜息+II/R(Sedentary+II/R,SI)組、游泳訓(xùn)練+II/R(Training+II/R,TI)組和游泳訓(xùn)練+II/R+FoxO3a磷酸化激活劑(Training+SC79,TSC)組(n=7～9)。TI和TSC組進(jìn)行為期5周的游泳訓(xùn)練,SS和SI組不進(jìn)行游泳訓(xùn)練。游泳訓(xùn)練結(jié)束后3 d,SI、TI、TSC組小鼠接受II/R手術(shù),SS組為不進(jìn)行血管夾閉的假手術(shù)組。TSC組小鼠于再灌注前1 h腹腔注射0.04 mg/g SC79(FoxO3a磷酸化激動(dòng)劑,溶于2%DMSO),其余組注射等體積溶劑[11]。

1.2 游泳訓(xùn)練

游泳訓(xùn)練[12]在特制的有機(jī)玻璃游泳箱(110 cm×70 cm×60 cm的無(wú)蓋長(zhǎng)方體)中進(jìn)行,環(huán)境背景為光線、溫度、濕度等因素高度一致的密室。參考前人研究方法,訓(xùn)練為期5周,第1周為訓(xùn)練適應(yīng)階段,第1天10 min,此后每日增加10 min,直至訓(xùn)練時(shí)間達(dá)50 min。正式游泳訓(xùn)練自第2周開(kāi)始,小鼠每日進(jìn)行游泳訓(xùn)練1次,每次達(dá)50 min,每周連續(xù)訓(xùn)練6 d,第7天為休息日。每組小鼠于游泳訓(xùn)練開(kāi)始前1日(Day 0)和每周休息日(Day 7、14、21、28、35)稱量并記錄體重。SS和SI組小鼠不進(jìn)行游泳訓(xùn)練,TI和TSC組小鼠在訓(xùn)練前后的飼養(yǎng)條件與SS和SI組一致。

1.3 II/R模型

各組小鼠術(shù)前12 h禁食,2 h禁水。參照前期研究方法[13],腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 μL/10 g麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)備皮消毒,經(jīng)腹正中切口剪開(kāi)入腹,鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery,SMA),無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉后,觀察動(dòng)脈搏動(dòng)消失,腸管顏色迅速變蒼白。60 min后取出動(dòng)脈夾,恢復(fù)血供,將腸管放回腹腔后逐層關(guān)腹。SS組僅分離SMA但不夾閉。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)中全程保溫,術(shù)后于小動(dòng)物溫箱中等待蘇醒,觀察無(wú)異常后,回籠飼養(yǎng)。再灌注后2 h處死小鼠,取距回腸末端5 cm小腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定,另取鄰近小腸組織投入液氮冷凍保存以進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.4 小腸黏膜形態(tài)學(xué)觀察

石蠟包埋小腸標(biāo)本、超薄切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色后,光鏡下觀察小腸黏膜組織病理學(xué)改變,以Chiu′s評(píng)分評(píng)價(jià)黏膜機(jī)械損傷程度。

1.5 ROS含量的測(cè)定

DHE染色法檢測(cè)小腸組織中ROS水平。小腸冰凍切片經(jīng)復(fù)溫、蒸餾水清洗去除冰凍切片包埋劑(optimal cutting temperature compound,OCT)后,與10 μmol/L濃度DHE染液37℃避光孵育30 min,PBS洗滌3次,滴加抗熒光淬滅劑后封片。熒光顯微鏡下拍照,觀察熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為535 nm),Image J軟件進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度的半定量分析。

1.6 小腸組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量測(cè)定

取小腸組織稱重后加入預(yù)冷的PBS溶液于冰上研磨成組織勻漿,于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中離心10 min,條件設(shè)定為4℃、15000 r/min。取上清,采用比色法檢測(cè)小鼠小腸組織中MDA含量和CAT活性,采用WST-1法檢測(cè)小腸組織勻漿液中SOD活性,試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.7 Western blot法檢測(cè)小腸組織亞細(xì)胞組分中FoxO3a的表達(dá)

取小腸組織稱重后切成細(xì)小碎片,放入含有蛋白磷酸酶抑制劑的組織勻漿液中,于冰上玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿裂解15 min,核蛋白與胞漿蛋白以試劑盒(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)抽提,具體方法參照說(shuō)明書(shū)。BCA法檢測(cè)濃度,8% ～12%SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白,冰浴恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉,對(duì)應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜:磷酸化的FoxO3aSer253(P-FoxO3aSer253)(1∶1000),FoxO3a(1∶1000),細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參GAPDH(1∶5000),細(xì)胞核蛋白內(nèi)參PCNA(1∶5000)。TBST洗滌后,與對(duì)應(yīng)二抗IgG(1∶2000)室溫孵育2 h,ECL試劑顯影,智能成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片,Image J軟件分析條帶的灰度值。以不同細(xì)胞組分的蛋白與對(duì)應(yīng)內(nèi)參蛋白的吸光度比值代表目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平,以SS組平均值作為標(biāo)準(zhǔn),各樣本讀數(shù)均與之相比,所得結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)計(jì)值。所有抗體均購(gòu)自成都正能生物公司。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

TrizolTMPlus RNA純化試劑盒提取并純化小腸組織RNA。NanoDropTMLite分光光度計(jì)、Gene5軟件測(cè)量樣本RNA濃度,DNaseⅠ去除樣本DNA,參照SuperScriptTMⅢ PlatinumTMSYBRTMGreen一步法試劑盒的操作手冊(cè),使用LightCycler 96 PCR儀讀取樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值,以內(nèi)參基因GAPDH水平為基線對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正處理,根據(jù)Top Tip Bio網(wǎng)站(https://toptipbio.com/delta-delta-ct-pcr/)提供的計(jì)算模板,采用2-ΔΔCt法(差值比較法),計(jì)算得出目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)定量。所需試劑盒均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司,引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR experiment

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況

在游泳訓(xùn)練過(guò)程中,各組小鼠進(jìn)食、飲水、作息均無(wú)明顯差別,體重均逐漸增加。其中,TI和TSC組小鼠體重的增長(zhǎng)幅度小于SS及SI組。在游泳訓(xùn)練第21天(Day 21)和第35天(Day 35),TI和TSC組小鼠體重較SS和SI組呈現(xiàn)明顯下降(均P<0.05),但未見(jiàn)明顯消瘦(表2)。在II/R術(shù)前,接受游泳訓(xùn)練的小鼠毛發(fā)整齊光潔,目光有神,活動(dòng)自如。

表2 各組小鼠體重變化和小腸黏膜Chiu′s評(píng)分Table 2 Weight gains and Chiu′s scores of intestinal mucosae in mice of each group

2.2 小腸病理?yè)p傷及Chiu′s評(píng)分

如圖1所示,光鏡下見(jiàn)SS組小腸黏膜完整、排列整齊,絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)正常無(wú)脫落;SI組小腸黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂,間隙水腫,視野內(nèi)可見(jiàn)明顯絨毛剝脫,間質(zhì)出血,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等;TI組小腸組織病理改變較SI組顯著減輕,絨毛形態(tài)相對(duì)完整,與SS組相似;TSC組損傷程度較TI組則明顯加重,與SI組相似。各組Chiu′s評(píng)分與組織學(xué)改變一致(表2)。

圖1 II/R后腸黏膜病理學(xué)改變和DHE染色Fig.1 Pathological changes of intestinal mucosa and DHE staining after II/R

2.3 小腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)改變

如圖1和表3所示,與SS組相比,SI組小鼠小腸組織ROS產(chǎn)量(DHE染色熒光強(qiáng)度)明顯增加(P<0.01),氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量明顯上調(diào)(P<0.01),抗氧化酶CAT和SOD活性下降(P<0.05,P<0.01)。與SI組相比,TI組小鼠小腸組織ROS水平明顯下降(P<0.01),氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量明顯下降(P<0.05),抗氧化酶CAT和SOD活性增加(P<0.05和P<0.01)。SC79逆轉(zhuǎn)了游泳訓(xùn)練的抗氧化應(yīng)激作用,與TI組相比,TSC組小鼠小腸組織ROS水平增加(P<0.05),抗氧化酶CAT和SOD活性下降(均P<0.05)。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)變化Table 3 Changes of oxidative stress indicators in mice of each

2.4 小腸組織細(xì)胞內(nèi)FoxO3a表達(dá)變化

如圖2所示,與SS組相比,SI組小鼠小腸組織胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253表達(dá)上調(diào)(P<0.05),細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。與SI組相比,TI組小鼠的小腸組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253含量明顯下降(P<0.01),細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a含量明顯上升(P<0.01)。SC79逆轉(zhuǎn)了游泳訓(xùn)練的作用,與TI組相比,TSC組小腸細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253表達(dá)明顯增加(P<0.01),細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

A:細(xì)胞質(zhì)P-FoxO3aSer253和FoxO3a蛋白表達(dá)電泳條帶;B:細(xì)胞質(zhì)P-FoxO3aSer253表達(dá)半定量分析;C;細(xì)胞質(zhì)FoxO3a表達(dá)半定量分析;D;細(xì)胞核P-FoxO3aSer253和FoxO3a蛋白表達(dá)電泳條帶;E;細(xì)胞核P-FoxO3aSer253表達(dá)半定量分析;F;細(xì)胞核FoxO3a表達(dá)半定量分析。與SS組比較,*P<0.05 **P<0.01;與SI組比較,#P<0.05 ##P<0.01;與TI組比較,△P<0.05 △△P<0.01圖2 II/R后各組小鼠小腸組織細(xì)胞內(nèi)FoxO3a表達(dá)變化(n=7～9)Fig.2 Changes of FoxO3a level in small intestinal tissues of mice in each group after II/R(n=7～9)

2.5 抗氧化基因表達(dá)變化

如圖3所示,與SS組相比,SI組小鼠小腸細(xì)胞內(nèi)MnSOD和PGC1α mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05和P<0.01);與SI組相比,TI組小鼠小腸組織MnSOD和PGC1α mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05和P<0.01);SC79逆轉(zhuǎn)了游泳訓(xùn)練的作用,與TI組相比,TSC組小腸細(xì)胞內(nèi)MnSOD和PGC1α的表達(dá)量顯著降低(均P<0.01)。

3 討論

目前大量回顧性分析和臨床前瞻性試驗(yàn)表明,長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可降低人群血液樣本中氧化應(yīng)激產(chǎn)物基線水平并提高抗氧化酶含量,是提高機(jī)體對(duì)I/R耐受性[14-17]的有效方法。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在II/R前施行為期5 d的跑步運(yùn)動(dòng),II/R后的小腸組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物如MPO、MDA的水平下調(diào)[18]。與前人的報(bào)道一致,在本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠在II/R前施行為期5周的游泳訓(xùn)練,II/R后小腸組織ROS的生成和MDA含量明顯下調(diào),抗氧化酶CAT和SOD的活性提高,II/R損傷減輕,證明有氧運(yùn)動(dòng)提高機(jī)體對(duì)II/R損傷的耐受性與其抗氧化應(yīng)激的作用相關(guān)。但是,從臨床應(yīng)用角度來(lái)講,危急重癥或限期手術(shù)的患者無(wú)法在缺血打擊前實(shí)施運(yùn)動(dòng)干預(yù),因此尋找有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)揮作用的分子機(jī)制則顯得更為重要。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在II/R打擊后,小鼠小腸組織細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxO3a表達(dá)下調(diào),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253表達(dá)水平增加;接受游泳訓(xùn)練干預(yù)的小鼠II/R后小腸組織細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a表達(dá)量更高,而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253水平下降。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FoxO3a的磷酸化修飾和轉(zhuǎn)錄激活可能參與了有氧運(yùn)動(dòng)的腸保護(hù)機(jī)制。在Ma等[19]的研究中也證實(shí)了原兒茶酸可以通過(guò)激活FoxO3a減輕II/R損傷。FoxO3a同時(shí)也被證實(shí)在II/R損傷導(dǎo)致的急性肺損傷中起到重要作用,腫瘤壞死因子α(TNF-α)通過(guò)激活JNK/FoxO3a通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡延遲并促進(jìn)II/R相關(guān)肺損傷[20]。

FoxO3a的活性受其上游(如insulin/PI3K/Akt、SIRT、AMPK通路等)調(diào)節(jié),關(guān)鍵位點(diǎn)(如Thr32、Ser253、Ser315)的磷酸化或乙酰化等翻譯后修飾決定了其活性,同時(shí)也直接影響到FoxO3a入核及轉(zhuǎn)錄激活[21]。當(dāng)Ser253位點(diǎn)被磷酸化后,P-FoxO3aSer253與核輸出蛋白14-3-3結(jié)合,由胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中,同時(shí)其核定位信號(hào)被隱藏,阻止FoxO3a再次入核,最終使得磷酸化的FoxO3a富集在胞質(zhì)中,轉(zhuǎn)錄活性受到抑制[22]。我們的結(jié)果提示,促進(jìn)FoxO3a磷酸化后,可通過(guò)上調(diào)小鼠腸組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)P-FoxO3aSer253,降低細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a蛋白水平,增加小腸組織內(nèi)ROS蓄積,同時(shí)降低抗氧化酶CAT、SOD等的含量,腸道組織氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯。而游泳訓(xùn)練對(duì)腸道的保護(hù)作用與降低FoxO3a磷酸化水平及促進(jìn)FoxO3a轉(zhuǎn)錄激活相關(guān),發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和減輕II/R損傷的作用。對(duì)于FoxO3a如何調(diào)控下游抗氧化通路,我們的研究證實(shí)了FoxO3a可以通過(guò)激活MnSOD及PCG1α基因促進(jìn)其表達(dá)。

值得注意的是,本研究中有氧運(yùn)動(dòng)類型選擇了游泳訓(xùn)練模型,其它類型的運(yùn)動(dòng)是否也是同樣作用及游泳訓(xùn)練如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a,需要進(jìn)一步闡明;同時(shí),FoxO3a的其它表觀遺傳學(xué)修飾是否參與II/R損傷,及有氧運(yùn)動(dòng)的腸保護(hù)機(jī)制也有待驗(yàn)證。

綜上所述,本研究通過(guò)在體實(shí)驗(yàn),以游泳訓(xùn)練作為II/R的干預(yù)手段,證實(shí)有氧運(yùn)動(dòng)減輕II/R后小腸組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練這項(xiàng)有氧運(yùn)動(dòng)主要是通過(guò)抑制FoxO3a蛋白的磷酸化,阻止其由細(xì)胞核轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì),并促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)FoxO3a調(diào)節(jié)抗氧化基因MnSOD和PGC1α的表達(dá),這可能是有氧運(yùn)動(dòng)減輕II/R損傷的關(guān)鍵機(jī)制。本研究通過(guò)闡述有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)的保護(hù)機(jī)制,為以FoxO3a為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)干預(yù)藥物,有望為防治II/R提供新的思路。