周 兵, 付東杰, 姜 蕾△

1武漢大學口腔醫(yī)院,武漢 430079 2武漢大學人民醫(yī)院口腔科,武漢 430060

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全球最常見的頭頸頜面部惡性腫瘤之一,病變可累及口腔、喉、咽和頸部[1],對顏面部的形態(tài)、功能損害較大,死亡率高。診斷過晚,不能及早得到治療是造成OSCC患者的高死亡率的重要因素之一[2],頸部轉移是導致患者預后不良和高死亡率的關鍵因素。轉移是癌細胞從原發(fā)性病灶的遷出和侵襲,通過多個步驟和各種潛在的分子機制進行調節(jié)。OSCC的轉移主要發(fā)生在頸部淋巴結,在OSCC診斷和患者生存當中具有至關重要的作用[3]。盡管手術治療在消除淋巴結轉移方面取得了進展,但OSCC轉移的機制仍不清楚,如何對轉移及預后進行早期預測仍然是困擾臨床醫(yī)師的一個大問題。血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶-2(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospon-din 2,ADAMTS2)不僅具有1、2和3型前膠原蛋白N端前肽的基本功能,還能夠參與多種病理生理過程,包括免疫與炎癥、腫瘤等。

PIK3/Akt信號通路是最重要的細胞信號通路之一,在調節(jié)細胞生長、分化、遷移、代謝和增殖方面發(fā)揮著重要作用。PI3K的激活導致PIP2底物被轉換為PIP3,PIP3與Akt的結合,導致Akt的磷酸化激活;Akt一旦被異常激活,將會引起細胞的蛋白合成、生長分化、代謝一系列異常反應[4]。ADAMTS2作為ADAMTS9同家族成員,具有功能相近的金屬蛋白酶結構域。根據(jù)有關研究[5],有學者推測ADAMTS2也可能通過其活性的金屬蛋白酶結構域對潛在的細胞外基質或膜蛋白進行修飾,致其構像發(fā)生改變,進而影響胞內PIK3/Akt信號通路的改變,從而影響腫瘤的進展。本研究旨在分析ADAMTS2在OSCC組織中的表達并探索ADAMTS2通過PI3K/Akt信號通路調控OSCC細胞轉移的分子機制,從而為OSCC早期診斷以及抗轉移治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)分析

GSE138206和GSE160042來源于Gene Expression Omnibus(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫。根據(jù)GEO2R以│logFC│>2和P<0.05的篩選條件進行了差異基因分析,并通過維恩圖得到了差異表達基因(DEGs)的交集。

1.2 蛋白互作網絡分析

用STRING(http://string-db.org/)來構建蛋白互作網絡(PPI)。通過Cytoscape軟件(www.cytoscape.org/)的“style”對PPI網絡進行外觀的調整及美化;隨后通過Cytoscape的“CytoHubba”功能,根據(jù)degrees計算方法獲得了排名前十位的hubba基因;最后使用“Mcode”功能繼續(xù)進行子網絡的富集,每個Mcode得到一個種子基因。

1.3 關鍵基因表達量和生存分析

Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)被用來對篩選得到的關鍵基因進行表達量的分析,Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)被用來對篩選得到的關鍵基因進行生存曲線的分析。

1.4 ADAMTS2相關性分析

使用LinkedOmics(http://www.linkedomics.org/login.php)來識別ADAMTS2的相關基因并進行相關性分析。

1.5 功能富集分析

將與ADAMTS2正負相關聯(lián)Top 50基因導入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),選擇“Expression Analysis”進行了生物過程,分子功能、細胞成分以及KEGG途徑富集分析,以確定相關基因的生物學功能,篩選標準P<0.05。

1.6 細胞培養(yǎng)

SCC15和HSC3細胞系購自上海細胞典藏庫(中國上海)。根據(jù)標準的細胞培養(yǎng)程序制備和維持細胞培養(yǎng)物。所有培養(yǎng)液均含有10%胎牛血清(美國Gibco)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone,美國)。所有細胞均在37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天更換培養(yǎng)液。

1.7 細胞轉染

陰性干擾對照(NC)和ADAMTS2干擾RNA(si-ADAMTS2)由廣州銳博公司合成,pcDNA3.1和ADAMTS2過表達質粒pcDNA3.1-ADAMTS2由上海生物工程有限公司合成。在6孔板中接種SCC15和HSC3約17～24 h后,上述siRNA或質粒用Lipofectamine 2000(Invitrogeny)根據(jù)制造商的說明書轉染細胞。在轉染48 h后收集細胞提取RNA并準備用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測定評估轉染效率。

1.8 RT-PCR實驗

根據(jù)Trizol試劑(北京天根生物公司)說明書從細胞中提取總RNA。首先使用TaqMan逆轉錄試劑盒(蘇州恒宇生物公司)將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA,然后在Applied Biosystems 7300儀器(美國賽默飛公司)使用SYBR green(蘇州恒宇生物公司)進行qRT-PCR以檢測ADAMTS2水平。GAPDH用作ADAMTS2表達的內源性對照。采用2-ΔΔCt法檢測定量,所用引物ADAMTS2 Forward:5′-GGCTCGCGGGGAACTTT-3′;ADAMTS2 Reverse:5′-TGCACCACAGAGTCATCCAC-3′;GAPDH Forward:5′-AATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3′;GAPDH Reverse::5′-CGTGAGTGGAGTCATACTGGAA-3′。

1.9 Transwell實驗

轉染24 h后,消化并用無血清DMEM的培養(yǎng)液重懸SCC15和HSC3細胞,將1×105個細胞接種到頂部小室(美國BD公司)中。下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液。孵育48 h后,遷移的細胞用4%多聚甲醛固定,室溫下用0.5%結晶紫染色,在光學顯微鏡下選取5個隨機視野觀察拍照(×400 )并使用Image J軟件進行定量。Transwell侵襲實驗,將SCC15和HSC3細胞用胰蛋白酶消化,收集后重懸于無血清培養(yǎng)液中,調整濃度至5×105個細胞/mL,加入培養(yǎng)液以1∶5的比例稀釋Matrigel(美國康寧公司)后,鋪在Transwell小室的上室,室溫晾干,其余按照細胞上述遷移實驗的流程進行。

1.10 葡萄糖和乳酸濃度測定

使用葡萄糖和乳酸檢測試劑盒(南京建成公司)測量培養(yǎng)液中的葡萄糖和乳酸濃度,多功能微孔板讀數(shù)器(BioTek公司,USA)505 nm測量葡萄糖、450 nm測量乳酸。葡萄糖消耗等于DMEM培養(yǎng)液中的初始葡萄糖濃度(450 mg/dL)減去轉染后培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 GSE138206和GSE160042中差異表達的mRNA

GSE138206獲得了208個差異表達的轉錄RNA,其中72個上調,136個下調(圖1A);GSE160042中833個上調,475個下調(圖1B)。差異表達的mRNA通過火山圖可視化。通過維恩圖,在上調的差異表達基因(DEGs)中獲得了48個重疊的mRNA(圖1C),在下調的DEGs中獲得了34個重疊DEGs(圖1D)。

A:GSE138206數(shù)據(jù)集有72個上調,136個下調差異表達基因;B:GSE160042數(shù)據(jù)集有833個上調,475個下調差異表達基因;C:GSE138206和GSE160042數(shù)據(jù)集上調表達基因中獲得了48個重疊基因;D:GSE138206和GSE160042數(shù)據(jù)集下調表達基因中獲得了34個重疊DEGs圖1 GSE138206和GSE160042中差異表達的mRNAFig.1 Differentially expressed mRNAs in GSE138206 and GSE160042

2.2 PPI網絡構建及關鍵基因篩選

STRING構建了PPI網絡(圖2A),紅色方形代表表達水平升高的基因,綠色方形代表表達水平降低的基因。

利用Cytoscape中的CytoHubba插件通過degree計算方式進行Hubba gene分析(圖2B),排名前5的分別是COL1A1、MMP9、MMP3、MMP1和COL5A1。用MCODE插件進行模塊分析,得到4個模塊,種子基因分別是MMP1、ADAMTS2、LAMA3和PPP1R3C(圖2C)。

2.3 關鍵基因表達量分析

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對Huba基因以及種子基因進行進一步分析,結果顯示COL1A1、MMP9、MMP3、MMP1、COL5A1、ADAMTS2和LAMA3在OSCC中的表達量都顯著升高,而PPP1R3C在OSCC中的表達量降低(表1)。

表1 通過Starbase數(shù)據(jù)庫分析OSCC組織中篩選得到關鍵基因的表達量Table 1 The expression levels of key genes screened in OSCC tissues were analyzed by Starbase database

2.4 關鍵基因生存分析

對關鍵基因進行生存分析,分析結果顯示COL1A1、ADAMTS2和PPP1R3C與OSCC的預后相關。高表達COL1A1和ADAMTS2的患者預后較差,而高表達PPP1R3C的患者預后較好(圖3)。我們對以上3個基因進行了文獻調研,多項成果顯示表明,COL1A1在OSCC中表達水平升高,且促進口腔鱗癌細胞的侵襲和遷移等;PPP1R3C相關研究顯示它在腎細胞癌中高表達[6],在結腸癌中異常甲基化[7],在OSCC中的研究較為少見;已有研究顯示ADAMTS2在OSCC中高表達[8],但是具體如何影響OSCC的預后尚不是完全清楚;因此,為了探究影響OSCC預后的機制,我們選擇ADAMTS2作為我們下一步的研究目標。

圖3 通過Kaplan-Meier Plotter分析OSCC組織中篩選得到關鍵基因COL1A1、MMP9、MMP3、MMP1、COL5A1、ADAMTS2、LAMA3和PPP1R3C的生存曲線Fig.3 The survival curves of key genes COL1A1,MMP9,MMP3,MMP1,COL5A1,ADAMTS2,LAMA3 and PPP1R3C in OSCC tissues were obtained by Kaplan-Meier Plotter analysis

2.5 與ADAMTS2相關聯(lián)的基因

根據(jù)LinkedOmics(圖4A)篩選了OSCC中與ADAMTS2相關的差異表達基因;通過Pearson檢驗評估ADAMTS2與OSCC中差異表達基因之間的相關性;熱圖顯示與OSCC中的ADAMTS2呈正相關(圖4B)或負相關(圖4C)的前50個基因。

A:通過Pearson檢驗評估ADAMTS2與OSCC中差異表達基因之間的相關性;B:熱圖顯示OSCC中前50個顯著與ADAMTS2呈正相關的基因;C:與ADAMTS1呈負相關的基因;紅色代表正相關基因;藍色代表負相關基因圖4 根據(jù)LinkedOmics分析OSCC中與ADAMTS2相關的DEGsFig.4 Analysis of ADAMTS2-related DEGs in OSCC according to LinkedOmics

2.6 ADAMTS2相關基因功能富集分析

將與ADAMTS2呈正負相關且關聯(lián)最緊密的Top50的基因載入Matescape進行功能富集分析,分析結果顯示這些基因主要與IL-17信號通路、細胞遷移的正向調節(jié)、血管生成的調節(jié)以及糖原代謝過程等相關(圖5)。

圖5 GO and KEGG通路富集分析顯示Top 50與ADAMTS2相關的基因主要與IL-17信號通路、細胞遷移的正向調節(jié)、血管生成的調節(jié)以及糖原代謝過程相關Fig.5 GO and KEGG pathway enrichment analysis showed that top 50 ADAMTS2-related genes were mainly related to IL-17 signaling pathway,positive regulation of cell migration,regulation of angiogenesis and glycogen metabolism

2.7 ADAMTS2促進OSCC細胞的糖酵解、遷移和侵襲

我們在體外評估了ADAMTS2在OSCC中的作用。si-ADAMTS2和pcDNA3.1-ADAMTS2的轉染效率通過qRT-PCR在OSCC細胞(SCC15和HSC3)中得到驗證,如表2所示,成功構建了干擾和過表達細胞模型。探索敲低ADAMTS2對SCC15和HSC3細胞糖代謝的影響,我們發(fā)現(xiàn),與對照組相比,SCC15和HSC3細胞中,ADAMTS2的敲低大大抑制了其糖酵解活性,減少葡萄糖攝取和乳酸釋放,如表3所示。在細胞遷移和侵襲實驗中,過表達ADAMTS2在SCC15和HSC3細胞系中的遷移和侵襲能力高于陰性對照組,干擾ADAMTS2的表達與陰性對照組相比,得到了相反的結果,表明ADAMTS2促進OSCC細胞遷移和侵襲(圖6)。

表2 si-ADAMTS2和pcDNA3.1-ADAMTS2在SCC15和HSC3細胞中的轉染效率Table 2 Transfection efficiency of si-ADAMTS2 and pcDNA3.1-ADAMTS2 in SCC15 and HSC3 cells

表3 在SCC15和HSC3細胞中敲低ADAMTS2減少了葡萄糖攝取和乳酸釋放Table 3 Knockdown of ADAMTS2 reduces glucose uptake and lactic acid release in SCC15 and HSC3 cells

3 討論

口腔鱗狀細胞癌高轉移和高復發(fā)率的特點極大地影響了患者的預后和生存[9]。因此,尋找與OSCC進展和轉移相關的基因,探索影響OSCC進展和轉移的機制,對于評估OSCC患者的預后,提高其治療效果和生存率具有重要意義。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)過表達ADAMTS2通過PI3K/Akt信號通路影響糖酵解,進而導致OSCC細胞的轉移和侵襲增強。

本研究首先通過生物信息學方法篩選出與OSCC進展相關的關鍵基因ADAMTS2。調研資料發(fā)現(xiàn),ADAMTS2是ADAMTS家族中的重要一員,可被影響細胞外基質形成的腫瘤生長因子-β1(TGF-β1)介導,骨肉瘤細胞在經過TGF-β治療后ADAMTS2表達上調[10]。還有研究顯示ADAMTS2在胃癌高表達,與胃癌的遠處轉移和預后密切相關,是胃癌[11]的獨立預后標志物。

通過對與ADAMTS2正負相關的Top 50基因進行富集分析,我們發(fā)現(xiàn)ADAMTS2與OSCC轉移的正向調節(jié)有關。我們在體外對ADAMTS2的功能進行了驗證,Transwell實驗結果證實了ADAMTS2與OSCC細胞轉移和侵襲的相關性。因此,我們認為ADAMTS2的高表達與OSCC的轉移相關,進而可能導致其預后不良。這些結果說明ADAMTS2可能在OSCC的進展中發(fā)揮促癌基因的作用。這些結果與數(shù)據(jù)庫分析結果以及以往研究結果一致。

盡管腫瘤轉移的具體分子機制尚不清楚,但ADAMTS2功能富集結果顯示其影響糖原代謝過程和參與遷移的正向調節(jié),文獻調研結果證明PI3K/Akt與糖原代謝、腫瘤轉移之間有密切關系[12]。PI3K/Akt信號通路與肝癌、胃癌、結腸癌等多種惡性癌癥密切相關[13]。有趣的是,通過調研發(fā)現(xiàn)FAM83A通過提高PI3K的p85亞基與Akt的結合,進而活化PI3K/Akt信號傳導,從而加快腫瘤的侵襲和轉移[14]?；谶@些發(fā)現(xiàn),我們假設ADAMTS2通過與PI3K p85相互作用激活PI3K/Akt通路誘導糖酵解,從而促進OSCC細胞的轉移。這些發(fā)現(xiàn)證實了我們的假設并補充了之前的研究結果。但是由于實驗動物資源的限制,我們尚未能用動物實驗進一步驗證我們的結果。

總之,我們的研究結果發(fā)現(xiàn)了ADAMTS2在OSCC中發(fā)揮促癌作用,并通過直接與PI3K相互作用激活Akt磷酸化促進糖酵解,從而促進OSCC轉移的分子機制。此外,ADAMTS2與OSCC患者的總生存時間相關。因此,ADAMTS2既是OSCC預后不良的危險因素,也是治療OSCC轉移的候選治療靶點。