王樹生，楊軍文，鄧重梨，張金渝，楊美權(quán)，鄧國賓*

（1.西南林業(yè)大學 生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205）

仙 茅（Curculigo orchioidesGaertn）為 石 蒜 科（Amaryllidaceae） 草本植物，分布于我國四川和云南等地，是我國傳統(tǒng)藥用植物之一。仙茅常以其根莖入藥，用于腎虛陽痿、滑精遺精、精冷不育、腰膝冷痛、寒濕痹痛、尿頻遺尿等癥狀的治療［1-2］。現(xiàn)代藥理研究表明，仙茅主要化學成分有酚類、酚苷類、木脂素類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類等［3］，具有抗氧化、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫和抗骨質(zhì)疏松等作用［4］。近年來，仙茅已經(jīng)逐漸被開發(fā)為各種臨床用藥和保健品，這使得野生仙茅資源面臨枯竭。人工栽培代替野生藥材已成發(fā)展趨勢，但盲目的人工栽培導致其品質(zhì)參差不齊、質(zhì)量穩(wěn)定性差，難以滿足藥材內(nèi)在質(zhì)量的要求。因此，如何在滿足市場需求的同時保證仙茅藥材的質(zhì)量成為仙茅藥材栽培的重要任務(wù)。研究表明，中藥材品質(zhì)主要與遺傳因素和生長環(huán)境有關(guān)。藥用植物中有效成分的形成與積累受環(huán)境因素的影響較大，除了受氣候季節(jié)變化的影響外，還受土壤中礦物質(zhì)種類和土壤肥力等因素的影響。環(huán)境因素是中藥材形成道地性的重要原因，影響藥材的生長發(fā)育和次生代謝物質(zhì)的積累，對藥材質(zhì)量有重要影響［5-7］。Lang 等研究表明，阿勒泰地區(qū)3 種典型的藥用多年生草本植物甘草、大黃、澤瀉與土壤中的氮、磷、鉀以及有機質(zhì)等存在不同程度相關(guān)性［8］。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH、全氮、全磷和有效磷是影響栽培鐵皮石斛主要藥用品質(zhì)的關(guān)鍵因子［9］。因此，明確土壤因子與仙茅藥材質(zhì)量之間關(guān)系，是揭示藥材有效成分成因和提高品質(zhì)的關(guān)鍵［10-11］。

近年來，對仙茅的研究多集中在化學成分分析和藥理作用等方面［12-13］，鮮見關(guān)于其有效成分含量與土壤因子相關(guān)性的研究報道。鑒于此，本研究以20 個野生種群仙茅及其根際土壤為實驗材料，分析了旨在為仙茅科學種植、品質(zhì)提升和藥用價值保護提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年9月于仙茅采收期在云南文山、臨滄、西雙版納和四川宜賓采集20 個野生種群仙茅根莖及其根際土壤樣品。每個種群采集5株長勢較為均一且健康的仙茅根莖，采樣時先去除土壤表層的腐殖質(zhì)及枯枝落葉層，挖取完整的仙茅根莖，采用抖根法收集根際土壤，將土壤樣品等量混合，混合后的土壤樣品和根莖樣品分別裝入無菌塑封袋內(nèi)。仙茅根莖經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為石蒜科仙茅屬植物仙茅的根莖。把樣品帶回實驗室，土壤樣品自然風干后研磨過篩，密封保存，用于理化性質(zhì)測定；仙茅根莖經(jīng)蒸餾水洗凈后自然風干，稱取質(zhì)量，粉碎后密封保存?zhèn)溆?。其他信息詳見?。

表1 采樣信息Tab.1 Geographic of the sample acquisition information

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

U3000 型Thermo 高效液相色譜儀［賽默飛世爾（中國）有限公司］；SP-7560 型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；LXJ-IIB 型離心機（上海安亭科學儀器廠）；AU-S2 型純水機（四川科瑞峰環(huán)境科技有限公司）；PHS-3C 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；FP6140型火焰光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；WFX-1308型原子吸收分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；K9840 型凱氏定氮儀（濟南海能未來技術(shù)集團股份有限公司）；KQ-500DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW 型分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；HH-S8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；HY-1 型渦旋儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；0.45 μm 微孔濾膜過濾器（天津市騰達過濾器件網(wǎng)）。

試劑：無水乙醇為優(yōu)級純，乙腈和甲醇均為色譜純，以上試劑均購自隴西化工；純水為實驗室自制。蘆丁（批號：MUST-21011510，成都曼斯特生物科技有限公司；純度≥98%），沒食子酸（批號：21080585，壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心；純度≥98%），仙茅苷（批號：B21352，上海源葉生物科技有限公司；純度≥9%）。

1.2.2 仙茅有效成分含量測定

按照《中國藥典》2020 版（一部）仙茅項下的高效液相色譜法對仙茅苷進行測定，色譜條件：C18（5 μm × 4.6 mm × 250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動相，檢測波長為285 nm，理論板數(shù)按仙茅苷峰計算應(yīng)不低于3 000［2］；總黃酮［14］和總多酚［15］均采用紫外分光光度計法進行測定。每個樣品進行2次重復。

1.2.3 土壤因子含量測定

參照《土壤農(nóng)化分析方法》［16］測定土壤樣品中的pH 值、有機質(zhì)、全鉀、速效鉀、緩效鉀、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、交換性鈣和交換性鎂，以上每個樣品進行3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)錄入和整理，分別采用SPSS 23.0、 DPS 7.05 和Origin 2018 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類分析以及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙茅有效成分含量分析

依據(jù)1.2.2 所述方法對20 個不同居群仙茅樣本中仙茅苷、總黃酮和總多酚等有效成分含量進行測定，其結(jié)果見表2。

表2 仙茅有效成分含量測定Tab.2 The determination of the content of active ingredients in C.orchioides

通過對20 個不同居群仙茅有效成分的含量測定發(fā)現(xiàn)（表2），仙茅苷、總黃酮、總多酚3種有效成分含量均存在一定差異（P＜0.05），且不同成分間的差異程度也不同。所有樣品的仙茅苷含量均符合2020 年版《中國藥典》標準（不少于0.10%），其含量在0.10% ～ 0.37%之間，平均值為0.25%，其中YWS-02 樣品中的仙茅苷含量最高，是YBN-01 樣品（最低）的3.7倍?？傸S酮含量在7.97 ～ 23.01 mg/g之間，平均值為14.61 mg/g，其中SYB-01 樣品中的總黃酮含量最高，是YLC-05 樣品（最低）的2.89 倍。總多酚含量在5.81 ～ 17.24 mg/g之間，平均值為9.11 mg/g，其中SYB-01 樣品中的總多酚含量最高，是YLC-05樣品（最低）的2.97 倍。從變異系數(shù)來看，各有效成分變異系數(shù)為27.77% ～ 36.00%，均處于中等變異范圍（10% ～ 100%）內(nèi)，說明不同居群間仙茅有效成分含量濃度存在一定差異，品質(zhì)相對不穩(wěn)定。

2.2 土壤理化性質(zhì)分析

20 個不同居群仙茅土壤因子含量測定結(jié)果見表3。根據(jù)全國第二次土壤普查養(yǎng)分分級標準（表4），分析仙茅生長地土壤的養(yǎng)分特征。結(jié)果顯示：土壤pH 值為3.9 ～ 6.6，平均值為5.01，其中表明所有土壤樣品屬于酸性土壤。有機質(zhì)含量為14.10 ～177.76 g/kg，其中YLC-05 樣品中的有機質(zhì)含量最高，是SYB-01 樣品（最低）的12.60 倍。參考全國土壤養(yǎng)分含量分級標準，除SYB-05、YBN-02、SYB-02和SYB-01外，大部分居群的土壤有機質(zhì)含量為1級或2 級標準，屬于豐富至極豐富水平。有效磷含量為0.20 ～ 16.30 mg/kg，其中YBN-05 樣品中的有效磷含量最高，是YWS-01 樣品（最低）的80.50 倍，僅有YBN-05 樣本為3 級標準屬于中等水平，其余樣本均為4 級至6 級標準，屬于缺乏至極缺乏水平。全磷含量為0.12 ～ 1.62 g/kg，其中YBN-01樣品中的全磷含量最高，是YLC-04 樣品（最低）的13.03 倍，大部分樣本為3 級或4 級標準，屬于中等或缺乏水平。全氮含量為1.22 ～ 163.57 g/kg，其中SYB-03 樣品中的全氮含量最高，是YBN-02 樣品（最低）的134.40 倍，大部分樣本為1 級標準，屬于極豐富水平，部分樣本為2 級或3 級標準，屬于豐富或中等水平。堿解氮含量為0.22 ～ 849.00 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的堿解氮含量最高，是SYB-01 樣品（最低）的3 807.17 倍，除SYB-05、SYB-03、SYB-04、SYB-02 和SYB-01 樣本外，其余樣本均為1 級至3級標準，屬于為中等至極豐富水平。全鉀含量為4.90 ～ 47.00 g/kg，其中YBN-01 樣品中的全鉀含量最高，是YBN-03 樣品（最低）的9.59 倍，僅有YBN-03 樣本為6 級標準，屬于極缺乏水平，其余樣本1 級至5 級均有分布，屬于缺乏至極豐富水平。速效鉀含量為6.33 ～ 228.33 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的速效鉀含量最高，是YBN-03 樣品（最低）的36.05倍，YLC-01 樣本為1 級標準，屬于極豐富水平，YWS-05 和YBN-03 為6 級標準，屬于極缺乏水平，其余樣本集中在2 級至5 級標準，屬于較缺乏至豐富水平。緩效鉀含量為23.33 ～ 2 564.00 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的緩效鉀含量最高，是SYB-03 樣品（最低）的109.89 倍，YWS-05 和YBN-05 為5 級標準，屬于較缺乏水平，YBN-03 和SYB-03 為6 級標準，屬于較缺乏水平，其余樣本為1 級至四級標準，屬于缺乏至極豐富水平。交換性鈣含量為158.37 ～1 526.80 mg/kg，其中SYB-01 樣品中的交換性鈣含量最高，是YLC-04 樣品（最低）的9.64 倍；交換性鎂含量為0.27 ～ 5.23 mg/kg，其中YLC-01 樣本中的交換性鎂含量最高，是SYB-01樣本（最低）的19.16倍。

表3 各土壤因子含量測定Tab.3 Determination of the content of soil factors

表4 土壤養(yǎng)分含量分級標準Tab.4 Grading standards for soil nutrient content

從變異系數(shù)來看，pH 值變異系數(shù)為12.86%，變異程度較小。有機質(zhì)、全磷、全氮、有效磷、堿解氮、全鉀、速效鉀、緩效鉀、交換性鈣、交換性鎂均有不同程度變異，變異范圍為48.90% ～ 170.65%。其中變異程度最大的是全氮，變異系數(shù)為170.67%。結(jié)果表明，野生仙茅主要分布在略偏酸性土壤，且除pH外，其余土壤指標含量在不同居群及同一居群內(nèi)均存在顯著差異。

2.3 土壤聚類分析

以20 個不同居群仙茅11 個土壤因子含量為變量，采用系統(tǒng)聚類法對居群進行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)當閾值為10 時，20 個不同居群土壤因子可以分為3組：第一類是將 YLC-01 單獨聚為一類，第二類為YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05，第三類將其余樣本分為一類。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)， YLC-01 樣品的堿解氮、速效鉀、緩效鉀和交換性鎂的含量顯著高于其他樣本，所以單獨聚為一類；而YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05 樣本的有機質(zhì)、堿解氮、和交換性鎂含量較高，全磷和交換性鈣含量較低，所以聚為第二類；第三類樣本中各土壤因子含量互有高低，而且并無規(guī)律所以聚為一類。

圖1 土壤因子聚類分析Fig.1 Cluster analysis of soil factors

2.4 土壤因子相關(guān)性分析

對11 個土壤因子含量進行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示（圖2），交換性鈣與全氮、全鉀均呈極顯著正相關(guān)；緩效鉀與速效鉀呈極顯著正相關(guān)；交換性鎂與全磷、交換性鈣呈極顯著負相關(guān)，與速效鉀、緩效鉀呈極顯著正相關(guān)；有機質(zhì)與交換性鈣呈顯著正相關(guān)，與交換性鎂呈顯著負相關(guān)；堿解氮與全氮呈顯著負相關(guān)，與交換性鈣呈極顯著負相關(guān)，與速效鉀呈顯著正相關(guān)，與緩效鉀、交換性鎂、有機質(zhì)均呈極顯著正相關(guān)；pH與全氮呈顯著負相關(guān)。綜上所述，土壤養(yǎng)分之間存在顯著或極顯著相關(guān)性，說明仙茅土壤因子間可能存在著不同程度的促進或抑制作用。

圖2 土壤因子相關(guān)性Fig.2 Pearson analysis of soil factors

2.5 仙茅有效成分含量和土壤因子灰色關(guān)聯(lián)度分析

利用數(shù)據(jù)分析軟件DPS 7.05 對仙茅有效成分含量與土壤因子進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見圖3。仙茅有效成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)值越高，說明這些土壤因子與仙茅的各個有效成分含量關(guān)系越密切。

圖3 仙茅有效成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)值Fig.3 Grey correlation value between chemical composition contents and soil factors of C. orchioides

結(jié)果顯示，影響仙茅苷含量的土壤因子關(guān)聯(lián)度從高到低依次為：海拔＞pH＞速效鉀＞有效磷＞全鉀＞有機質(zhì)＞交換性鎂＞交換性鈣＞全磷＞水解性氮＞緩效鉀＞全氮；從總黃酮含量來看：pH＞全磷＞全鉀＞交換性鈣＞海拔＞緩效鉀＞速效鉀＞有效磷＞有機質(zhì)＞水解性氮＞交換性鎂＞全氮；從總多酚含量來看：pH＞全磷＞交換性鈣＞全鉀＞海拔＞有機質(zhì)＞水解性氮＞速效鉀＞緩效鉀＞有效磷＞交換性鎂＞全氮。綜合來看，海拔、pH、全鉀、全磷、有機質(zhì)、交換性鈣是影響仙茅有效成分的重要影響因素。

2.6 仙茅有效成分含量和土壤因子相關(guān)性分析

為進一步確定影響仙茅有效成分的土壤因子，在灰色關(guān)聯(lián)度分析的基礎(chǔ)上，對仙茅的3 個有效成分含量與11 個土壤因子含量進行Pearson 相關(guān)性分析。由圖4可知，仙茅苷與全磷、交換性鈣呈顯著負相關(guān)，與海拔呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總黃酮與有機質(zhì)呈顯著負相關(guān)，與全鉀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總多酚與土壤因子相關(guān)性不顯著。研究結(jié)果顯示，全鉀和海拔對促進仙茅有效成分的形成和積累有積極作用，有機質(zhì)、全磷和交換性鈣對仙茅有效成分的形成和積累則是抑制作用。

3 討論與結(jié)論

仙茅的化學成分主要為酚及酚苷類、木脂樹及其三苷類、黃酮類、生物堿、多糖等［18］。仙茅根莖中很多化學成分都具有藥理活性，如仙茅苷具有抗炎［19］、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松等藥理作用［20］；仙茅素A具有一定的補腎壯陽作用［21］；Crassifoside G 等8種酚及酚甘類化合物具有很強的氧化活性［22］；黃酮具有保護心血管、抗氧化、降血糖等多種藥理活性［23］。上述成分是仙茅發(fā)揮藥理作用的有效成分，其含量高低決定了仙茅的品質(zhì)，探討其有效成分形成和積累的影響因素對調(diào)控其有效含量具有重要價值。

生態(tài)因子是影響藥材藥效成分含量的重要因素，包括氣候因子、土壤因子及地理因素等［24］。其中土壤是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，土壤的物理、化學性質(zhì)以及所含的各種元素對藥材生長發(fā)育及次生代謝物積累均具有重要影響［25］。因此，研究土壤因子對藥材質(zhì)量的影響對于高品質(zhì)藥材的生產(chǎn)具有十分重要的意義。該研究對20 個不同居群仙茅有效成分含量及其土壤因子含量進行測定，并對它們之間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果顯示，不同地區(qū)仙茅所生長的土壤呈酸性，該研究結(jié)果與前人研究報道一致［26］。土壤中有機質(zhì)、全氮、堿解氮和緩效鉀含量豐度較高，全磷、全鉀含量豐度中等，有效磷、速效鉀含量豐度較低，且土壤因子之間存在不同程度的相關(guān)。聚類分析表明，20 個不同居群土壤被分為3個組，這種結(jié)果很有可能是由于經(jīng)緯度、海拔和氣候等因素綜合影響，導致各采樣點的土壤屬性等顯現(xiàn)出較大差別。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法結(jié)果顯示，海拔、pH、速效鉀、全鉀、全磷、交換性鈣是影響仙茅有效成分的重要影響因素。相關(guān)性分析表明，全鉀和海拔對促進仙茅有效成分的形成和積累有積極作用，有機質(zhì)、全磷和交換性鈣對仙茅有效成分的形成和積累則是負作用。在影響仙茅有效成分的多個土壤因子中，鉀作為品質(zhì)元素可顯著提升作物的抗性和品質(zhì)，提高藥用植物中黃酮類成分的含量［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，全鉀與總黃酮呈顯著正相關(guān)，說明鉀在仙茅總黃酮的合成和含量累積以及抗逆性方面具有積極作用。土壤中的磷對根的生長發(fā)育具有重要的作用［28］，因此對于仙茅根莖的生長發(fā)育以及有效成分的合成與累積具有重要影響。有機質(zhì)和陽離子交換量反映了土壤肥力水平和保肥能力，是藥用植物生長所需的各種養(yǎng)分的重要來源［7，29］，但有研究表明高肥力不利于地下部品質(zhì)改善和提高［30］，可能是有機質(zhì)含量過高不利于仙茅有效成分積累的原因。海拔是藥用植物生長環(huán)境中的重要生態(tài)因子之一，不同的海拔具有不同的溫度、光照、土壤條件和空氣等其他生態(tài)因子，高海拔利于功效成分的合成與積累［31］，本研究結(jié)果顯示海拔與仙茅有效成分呈正相關(guān)，說明適宜的生長環(huán)境能促進仙茅的生長，從而形成優(yōu)質(zhì)的藥材?？偠喾优c土壤因子相關(guān)性不顯著，其原因需要進一步研究。

綜上所述，仙茅不同有效成分含量受土壤影響程度不同，其主要影響因素也不同，是多個因素綜合影響的結(jié)果。因此，在生產(chǎn)實踐中應(yīng)重視生態(tài)因子和土壤環(huán)境對仙茅藥材質(zhì)量的影響，種植過程中可通過適當控制有機質(zhì)、全磷和交換性鈣的含量，合理增施鉀肥等措施促進仙茅有效成分的形成和含量的積累。