夏延貞, 霍寅萍, 王龍珍, 商雄躍

肺癌是全球最常見的癌癥類型和癌癥死亡原因[1-2],世界衛(wèi)生組織估計全球的肺癌死亡率仍將繼續(xù)升高[3]。目前,手術(shù)切除配合放化療是肺癌主要的治療方法,但患者預(yù)后仍不理想[4]?？诉蛱婺崾且环N多靶點蛋白激酶抑制劑,其可作用于間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、c-ros原癌基因1受體酪氨酸激酶(c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1)、肝細胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,c-Met)等位點,對肺癌具有顯著的臨床療效[5],但患者容易產(chǎn)生獲得性耐藥,限制了克唑替尼的應(yīng)用[6]。尋求增強克唑替尼抑癌效果的方法有利于肺癌的治療。環(huán)狀RNA(circular ribonucleic acid,circRNA)是一種具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,參與包括癌癥在內(nèi)的多種病理過程,對肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥起著重要的調(diào)控作用[7-8]。有研究表明circ-FOXM1可促進肺癌的增殖、遷移和侵襲[9]?？诉蛱婺峥赏ㄟ^抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路而抑制肺癌細胞侵襲[10]。本研究旨在探討過表達和沉默circ-FOXM1是否可改變克唑替尼對肺癌細胞的抑制效果,以及PI3K/AKT信號通路在其中的作用機制,為克唑替尼耐藥肺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑與儀器 人正常肺上皮細胞株BEAS-2B、肺癌細胞株H2228均購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibico公司。克唑替尼購自美國Sigma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。circ-FOXM1過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-circ-FOXM1)及陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1)、circ-FOXM1小干擾RNA(si-circ-FOXM1)及亂序無意義陰性對照(si-NC)、circ-FOXM1、GAPDH引物均購自上海吉康生物科技有限公司。LipofectamineTM2000、Trizol試劑和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。鼠抗人單克隆抗體磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase,p-PI3K)、PI3K、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、AKT均購自美國Santa Cruz公司。Epoch全波長酶標儀購自美國Bio-Tek公司。CytomicsTMFC 500流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。Transwell小室,規(guī)格:24孔,孔徑8 μm,購自美國康寧公司。CX-43光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2細胞培養(yǎng)及克唑替尼耐藥肺癌細胞的構(gòu)建 H2228細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。構(gòu)建克唑替尼耐藥肺癌細胞時,在培養(yǎng)基內(nèi)添加終濃度為5 nmol/L的克唑替尼,當H2228細胞穩(wěn)定生長時將克唑替尼的濃度加倍,重復(fù)此步驟,歷時8個月。MTT實驗檢測克唑替尼對H2228細胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)的變化,計算H2228細胞的耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。IC50指對細胞增殖的抑制效果達到細胞正常增殖水平50%時的藥物濃度。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。RI的分級:<5為低度耐藥;5～15為中度耐藥;>15為高度耐藥。本研究構(gòu)建的克唑替尼耐藥肺癌細胞達到中度耐藥,記為H2228/CR細胞。

1.3細胞分組及干預(yù)處理 將H2228細胞隨機分為過表達組和過表達對照組。將H2228/CR細胞隨機分為沉默組和沉默對照組。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別將circ-FOXM1過表達質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒、circ-FOXM1小干擾RNA、亂序無意義陰性對照轉(zhuǎn)染進過表達組、過表達對照組、沉默組、沉默對照組細胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后過表達對照組和過表達組細胞用187.56 nmol/L的克唑替尼處理。另將克唑替尼換為等量DMSO處理過表達對照組和過表達組細胞作為對照。沉默對照組和沉默組細胞用400 nmol/L的克唑替尼處理。另將克唑替尼換為等量DMSO處理沉默對照組和沉默組細胞作為對照。在細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h后收集各組細胞,檢測相關(guān)指標。

1.4qRT-PCR法檢測circ-FOXM1表達 用Trizol法提取細胞總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以cDNA為模板進行qRT-PCR。引物序列見表1。實驗條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,總共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算circ-FOXM1的相對表達量。重復(fù)6次獨立實驗。

表1 circ-FOXM1和GAPDH的引物序列

1.5MTT法檢測細胞存活率 將細胞分別以5×103cells/孔接種至96孔板,每組設(shè)置6個復(fù)孔。應(yīng)用不同濃度(0、50、100、200、400、800、1 600 nmol/L)的克唑替尼處理,細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入10 μl MTT試劑,孵育4 h,棄上清,加入150 μl DMSO重懸后用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值(OD值)。計算細胞存活率與克唑替尼的IC50。細胞存活率=[(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 按Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測。收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞。4 ℃、1 000 r/min離心10 min,棄上清。加入1×Binding Buffer重懸細胞,調(diào)整細胞密度至1×106cells/ml。取100 μl細胞懸液,加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI,混勻后室溫避光孵育15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer,1 h內(nèi)上機檢測凋亡率。重復(fù)6次獨立實驗。

1.7Transwell法檢測細胞遷移水平 在Transwell小室上室加入無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將各組細胞培養(yǎng)于上室。培養(yǎng)24 h后除去小室上表面未穿過室膜的細胞,予無水甲醇固定,1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察細胞遷移情況,隨機選取5個視野進行計數(shù)并拍照。重復(fù)6次獨立實驗。

1.8Western blot法檢測細胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組細胞,應(yīng)用RIPA裂解液提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉處理后加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的一抗稀釋液(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,加入HRP標記的二抗稀釋液(1∶5 000),室溫孵育2 h,磷酸緩沖鹽溶液洗膜,加入ECL試劑,暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參,應(yīng)用Quantity One軟件分析目標蛋白的相對表達量。重復(fù)6次獨立實驗。

2 結(jié)果

2.1克唑替尼耐藥肺癌細胞H2228/CR的構(gòu)建結(jié)果 MTT實驗結(jié)果顯示,隨著克唑替尼濃度的增加,H2228和H2228/CR細胞的存活率逐漸降低,克唑替尼對H2228細胞和H2228/CR細胞的IC50分別為(195.24±16.89)nmol/L、(1546.83±125.73)nmol/L,克唑替尼對H2228/CR細胞的IC50顯著高于H2228細胞(t=26.097,P<0.001)。RI=7.90±0.63,符合耐藥株的要求。見圖1。

?MTT法檢測不同濃度克唑替尼對H2228和H2228/CR細胞存活率的影響;?克唑替尼對H2228和H2228/CR細胞的IC50比較;*P<0.05圖1 克唑替尼耐藥肺癌細胞H2228/CR構(gòu)建結(jié)果圖

2.2circ-FOXM1在BEAS-2B、H2228和H2228/CR細胞中的表達水平比較 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,H2228/CR細胞circ-FOXM1表達水平顯著高于BEAS-2B細胞和H2228細胞(P<0.05)。H2228細胞circ-FOXM1表達水平顯著高于BEAS-2B細胞(P<0.05)。circ-FOXM1表達水平在三種細胞間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=183.232,P<0.001)。見圖2。

與BEAS-2B比較,*P<0.05;與H2228細胞比較,#P<0.05圖2 circ-FOXM1在BEAS-2B、H2228和H2228/CR細胞中的表達水平比較圖

2.3過表達和沉默circ-FOXM1的細胞模型的構(gòu)建結(jié)果 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,過表達組H2228細胞circ-FOXM1表達水平顯著高于過表達對照組(t=12.253,P<0.001),沉默組H2228/CR細胞circ-FOXM1表達水平顯著低于沉默對照組(t=14.858,P<0.001)。結(jié)果提示過表達和沉默circ-FOXM1的細胞模型構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 過表達和沉默circ-FOXM1的細胞模型的circ-FOXM1檢測結(jié)果圖(*P<0.05)

2.4circ-FOXM1過表達降低克唑替尼對H2228細胞的抑制效果 MTT實驗結(jié)果顯示,隨著克唑替尼濃度的增加,過表達對照組和過表達組H2228細胞存活率逐漸降低,克唑替尼對過表達組的IC50顯著高于過表達對照組(t=22.442,P<0.001)。選擇過表達對照組H2228細胞的IC50(187.56 nmol/L)用于后續(xù)實驗。以克唑替尼對過表達對照組和過表達組H2228細胞進行干預(yù)處理,結(jié)果顯示過表達組的凋亡率顯著低于過表達對照組(t=11.865,P<0.001),過表達組的細胞遷移數(shù)顯著高于過表達對照組(t=-6.922,P<0.001)。見圖4。

?不同濃度克唑替尼干預(yù)處理后,過表達組及過表達對照組H2228細胞的存活率比較;?克唑替尼對過表達對照組和過表達組H2228細胞的IC50比較;??流式細胞術(shù)檢測187.56 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,過表達對照組和過表達組的細胞凋亡率比較;??Transwell實驗檢測187.56 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,過表達對照組和過表達組的細胞遷移數(shù)比較;*P<0.05圖4 circ-FOXM1過表達降低克唑替尼對H2228細胞的抑制效果圖

2.5circ-FOXM1過表達對克唑替尼干預(yù)的H2228細胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果 Western blot實驗結(jié)果顯示,經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,過表達組p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值均顯著高于過表達對照組(t=7.813,P<0.001;t=6.834,P<0.001)。見圖5。

?Western blot實驗結(jié)果圖;?兩組p-PI3K/PI3K比值比較;?兩組p-AKT/AKT比值比較;*P<0.05圖5 circ-FOXM1過表達對克唑替尼干預(yù)的H2228細胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果圖

2.6沉默circ-FOXM1增強克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制效果 MTT實驗顯示,隨著克唑替尼濃度增加,沉默對照組和沉默組H2228/CR細胞存活率逐漸降低,克唑替尼對沉默組的IC50顯著低于沉默對照組(t=20.088,P<0.001)。選擇對沉默對照組H2228/CR細胞抑制率較低的克唑替尼濃度(400 nmol/L)用于后續(xù)實驗。經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,沉默組的細胞凋亡率顯著高于沉默對照組(t=12.353,P<0.001),沉默組的細胞遷移數(shù)顯著低于沉默對照組(t=7.543,P<0.001)。見圖6。

?不同濃度克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組H2228/CR細胞存活率比較;?克唑替尼對沉默對照組和沉默組H2228/CR細胞的IC50比較;??流式細胞術(shù)檢測400 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組細胞凋亡率比較;??Transwell實驗檢測400 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組的細胞遷移數(shù)比較;*P<0.05圖6 抑制circ-FOXM1表達增強克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制效果圖

2.7抑制circ-FOXM1表達對克唑替尼干預(yù)的H2228/CR細胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果 Western blot實驗結(jié)果顯示,經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,沉默組的p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值均顯著低于沉默對照組(t=12.247,P<0.001;t=8.542,P<0.001)。見圖7。

?Western blot實驗結(jié)果圖;?兩組p-PI3K/PI3K比值比較;?兩組p-AKT/AKT比值比較;*P<0.05圖7 抑制circ-FOXM1表達對克唑替尼干預(yù)的H2228/CR細胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果圖

3 討論

3.1克唑替尼是常用的肺癌靶向治療藥物,但由于肺癌容易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致克唑替尼的抑癌效果降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn),用濃度遞增的克唑替尼長期處理肺癌細胞后,克唑替尼對肺癌細胞的IC50顯著增加,這與相關(guān)文獻結(jié)果一致[12],表明長期使用克唑替尼可使對克唑替尼敏感肺癌細胞H2228轉(zhuǎn)變對克唑替尼耐藥的肺癌細胞H2228/CR。探究肺癌對克唑替尼耐藥的機制對改善肺癌患者的治療效果具有重要意義。

3.2circRNA是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一,其可通過調(diào)控基因、信號通路、微小RNA參與包括癌癥在內(nèi)的各種病理進程[13]。circRNA也參與癌細胞化療耐藥的調(diào)控,癌細胞耐藥性的轉(zhuǎn)變與circRNA表達水平的改變密切相關(guān)[14]。circ-FOXM1是一種新發(fā)現(xiàn)的與癌癥有關(guān)的circRNA,其定位于chr12:2966846-2983691位點,源自FOXM1基因[15]。circ-FOXM1在肺癌中高表達,可通過調(diào)控多種信號通路促進肺癌進展,抑制circ-FOXM1表達則可抑制肺癌細胞的生長。抑制circ-FOXM1表達可通過靶向miR-149-5p調(diào)控自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5,Atg5)表達,從而抑制肺癌細胞增殖、遷移、自噬并誘導(dǎo)細胞凋亡[16]。抑制circ-FOXM1表達可通過調(diào)控miR-132-3p/跨膜蛋白14A(transmembrane protein 14A,TMEM14A)軸抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。circ-FOXM1也可能與癌細胞對某些化療藥物耐藥性的改變有關(guān)。circ-FOXM1可作為miR-1324的分子海綿上調(diào)甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)表達,促進肝癌細胞對索拉非尼的耐藥[18]。本研究發(fā)現(xiàn),circ-FOXM1在肺癌細胞H2228中的表達水平顯著高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B,且在克唑替尼耐藥肺癌細胞H2228/CR中的表達水平顯著高于克唑替尼敏感肺癌細胞H2228,提示circ-FOXM1可能與肺癌的克唑替尼耐藥有關(guān)。

3.3為驗證circ-FOXM1表達水平對肺癌細胞克唑替尼耐藥性的影響,本研究以克唑替尼敏感肺癌細胞H2228和克唑替尼耐藥肺癌細胞H2228/CR為實驗對象。結(jié)果顯示,circ-FOXM1過表達后,克唑替尼對H2228細胞的IC50顯著增加,并顯著降低克唑替尼干預(yù)后H2228細胞的凋亡率,增加細胞遷移數(shù)。表明circ-FOXM1過表達可降低克唑替尼對H2228細胞的抑制效果,circ-FOXM1表達水平上升可能是肺癌細胞對克唑替尼由敏感向耐藥轉(zhuǎn)變的一個原因。另外,本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),沉默circ-FOXM1后,克唑替尼對H2228/CR細胞的IC50顯著降低,沉默circ-FOXM1可顯著增加克唑替尼作用下H2228/CR細胞的凋亡率并降低細胞遷移數(shù)。表明沉默circ-FOXM1可增加克唑替尼對H2228/CR細胞的抑制效果,circ-FOXM1可能成為提高克唑替尼的抑癌效果的一個靶點。

3.4PI3K/AKT是一條與磷脂酰肌醇有關(guān)的信號通路,參與對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡、糖酵解等方面的調(diào)控,在許多癌癥中發(fā)揮致癌作用,針對PI3K/AKT信號通路的抑制劑是抗癌藥物研究的熱點[19]。PI3K/AKT信號通路可通過調(diào)控多種耐藥基因的表達影響化療耐藥[20]。有研究表明,克唑替尼通過抑制PI3K/AKT信號通路調(diào)控相關(guān)蛋白表達抑制肺癌細胞增殖、遷移并誘導(dǎo)細胞凋亡[10,21]。本研究結(jié)果顯示,克唑替尼可降低肺癌細胞H2228和H2228/CR細胞中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值,表明克唑替尼可抑制肺癌細胞PI3K/AKT信號通路,這與相關(guān)研究結(jié)果一致。許多circRNA對癌癥進程的調(diào)控及對化療耐藥的調(diào)控也都涉及PI3K/AKT信號通路。circRNA circ_103809通過激活PI3K/AKT信號通路加速乳腺癌的細胞周期進程并抑制細胞凋亡[22]。circRNA circ_PTN通過miR-542-3p/PIK3R3途徑激活PI3K/AKT信號通路,促進膠質(zhì)母細胞瘤的順鉑耐藥[23]。本研究發(fā)現(xiàn),circ-FOXM1過表達可上調(diào)克唑替尼干預(yù)后H2228細胞的PI3K/AKT信號通路,沉默circ-FOXM1則可下調(diào)克唑替尼干預(yù)后H2228/CR細胞的PI3K/AKT信號通路,由此推測circ-FOXM1可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響克唑替尼對肺癌細胞的抑制效果。

綜上所述,circ-FOXM1可降低克唑替尼對肺癌細胞的抑制效果,其機制可能與circ-FOXM1激活PI3K/AKT信號通路有關(guān),但本研究僅進行了細胞實驗,相關(guān)機制還有待進一步完善。由于化療耐藥的產(chǎn)生是多種基因、信號通路、circRNA等同時進行調(diào)控的復(fù)雜過程,且一個circRNA可同時調(diào)控多種基因、微小RNA、蛋白質(zhì)、信號通路;反之,circRNA亦可受各種分子的調(diào)控,故今后的研究將深入下游機制,并進行動物實驗,為減輕克唑替尼耐藥提供參考。