霍云飛, 高明慧, 豆雙雙, 寇卜心, 柴夢音, 劉曉霓, 石 英

RelA(p65)是核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)家族的一員。NF-κB通路包括典型的NF-κB通路和非典型的NF-κB通路,其中RelA作為重要的轉錄因子參與典型的NF-κB通路[1-2]。在穩(wěn)定狀態(tài)下,RelA被NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,I-κB)抑制,隔離在細胞質中。當?shù)湫偷腘F-κB通路被激活后,I-κB被磷酸化,失去了抑制RelA的能力,RelA進入細胞核中參與下游基因的轉錄,以響應炎癥、免疫反應、細胞增殖、分化等多種外部刺激[1,3-5]。此外,也有研究表明RelA參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,特別是在肝癌中發(fā)揮重要作用。Xu等[6]發(fā)現(xiàn)當肝臟發(fā)生慢性炎癥反應后,肝細胞RelA表達上調,并激活RelA的Ser536磷酸化位點,繼而激活下游絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine protein kinase,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究團隊的前期研究也發(fā)現(xiàn),RelA的磷酸化促進了小鼠肝癌的發(fā)生[7]。因此,抑制RelA的表達可能可以抑制肝癌的進展。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[8]。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達,持續(xù)數(shù)周甚至更久[9]。慢病毒載體也可用于小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達,其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞以進行基因沉默的研究,避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩(wěn)定[9]。本研究旨在構建靶向RelA基因的慢病毒載體,抑制肝癌細胞中RelA的表達,為后續(xù)RelA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑 質粒小量快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司;限制性核酸內切酶購自美國Thermo公司;慢病毒包裝試劑盒購自北京和元生物科技有限公司;細胞基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;RNA提取試劑盒Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMII 1ST Strand cDNA Synthesis Kit、熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒TB Green Premix Ex TaqTM購自日本Takara公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;遺傳霉素G418購自碧云天生物科技有限公司;GAPDH抗體、RelA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;CCK-8試劑購自美國AbMole公司。

1.2慢病毒載體及細胞 慢病毒載體pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE購自上海和元生物科技有限公司。HepG2細胞及293T細胞由本實驗室保存,均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設置為37 ℃、5% CO2。

1.3主要實驗儀器 MCO-18AIC恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司;Ti-E全電動倒置熒光顯微鏡、Ts2倒置顯微鏡均購自日本Nikon公司;EPS-3000電泳儀購自上海TANON公司;T100 PCR儀購自美國BioRad公司;ViiA7實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;MULTISKAN GO全波長酶標儀購自美國Thermo公司。

1.4實驗方法

1.4.1 目的基因干擾靶點的設計 根據(jù)美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中RelA基因的核酸序列,設計siRNA靶向序列和陰性對照序列。見表1。

表1 siRNA靶向序列

1.4.2 shRNA的合成及退火 shRNA由上海和元生物科技有限公司進行合成。在合成的shRNA中,loop莖環(huán)結構為CTCGAG,3′端加入TTTTTT終止信號,5′端和3′端分別加入Age I和EcoR I酶切位點。見表2。將合成的單鏈shRNA用oligo annealing buffer溶解成20 μM,互補單鏈各取30 μl進行混合,置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min,然后室溫冷卻,形成雙鏈oligo片段。取1 μl雙鏈oligo片段用于后續(xù)的連接反應,其余-20 ℃保存。

1.4.3 線性化表達載體的制備 取2 μg載體質粒pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE,在Age I和EcoR I酶的作用下于37 ℃水浴鍋中孵育2 h進行酶切,使其線性化。通過瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切效果并回收大小約為8 688 bp的正確條帶。

1.4.4 載體質粒與退火的shRNA連接 將上述線性化表達載體與退火的雙鏈oligo序列的連接反應體系(見表3)于16 ℃過夜連接,完成慢病毒基因沉默質粒構建。見圖1。

圖1 RelA基因沉默慢病毒質粒示意圖

表3 連接反應體系

1.4.5 轉化、菌落PCR鑒定及測序 用構建完成的RelA基因沉默慢病毒質粒轉化DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含有氨芐西林抗性的LB固體培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上長出的轉化子重懸于10 μl LB培養(yǎng)液中,取1 μl作為模板進行菌落PCR鑒定,并將得到的陽性克隆進行測序驗證(測序引物序列:F:TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG;R:CTATTAATAACTAATGCATGGC)。經(jīng)測序驗證正確的陽性克隆,用質粒小量快速提取試劑盒提取質粒,將提取出的質粒用于慢病毒的包裝。

1.4.6 慢病毒包裝 接種5×106cells 293T細胞于10 cm培養(yǎng)皿中,過夜培養(yǎng)后使用慢病毒包裝試劑盒進行慢病毒包裝系統(tǒng)轉染。轉染48 h后,收集上清,與濃縮試劑按照5∶1的比例在4 ℃溫度下進行混合,過夜,離心收集沉淀并使用PBS重懸,即得到病毒濃縮液,-80 ℃保存。

1.4.7 慢病毒滴度測定 接種1×105cells 293T細胞于12孔板中,過夜培養(yǎng)后進行病毒滴度測定。分別取0.1 μl、1 μl、10 μl病毒加入到12孔板中,同時添加終濃度為8 μg/ml的促感染試劑Polybrene。培養(yǎng)72 h后拍照記錄病毒感染后的情況并利用細胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,用于實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測。根據(jù)公式TU ml-1=(C×N×D×1 000)/V計算出每毫升慢病毒液中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù),即為慢病毒滴度,C為平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù);N為感染時細胞的數(shù)目;D為病毒載體的稀釋倍數(shù),V為加入的稀釋病毒的體積數(shù)(μl)。

1.4.8 慢病毒轉染HepG2細胞及干擾效果鑒定 接種1×105cells HepG2細胞于6孔板中,過夜培養(yǎng)后再加入慢病毒和終濃度為8 μg/ml的Polybrene。每孔所加病毒量(μl)=MOI×感染時的細胞數(shù)/病毒滴度×1 000,其中HepG2的MOI值為10～30。轉染24 h后更換不含慢病毒的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,熒光顯微鏡下觀察感染情況并拍照記錄。更換含有遺傳霉素G418的新鮮培養(yǎng)基篩選轉染成功的細胞,當未轉染慢病毒的細胞在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中全部死亡后即可認為所有細胞均感染成功。收集轉染成功的細胞,通過Western blot實驗觀察RelA基因在蛋白質水平上的表達情況,篩選干擾效果最好的細胞,通過CCK-8法檢測細胞增殖活力,增殖活力=(A1-Ab)/(A0-Ab),A1為細胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后測得的OD450值,A0為細胞培養(yǎng)0 h時測得的初始OD450值,Ab為空白對照孔的OD450值。

2 結果

2.1RelA基因沉默慢病毒質粒載體構建及鑒定結果 在Age I和EcoR I酶的作用下,載體質粒pCLenti-U6-shRNA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPRE被切割成線性化載體,瓊脂糖凝膠電泳顯示環(huán)狀載體和切割后的線性化載體在8 000～10 000 bp之間出現(xiàn)條帶,與載體實際大小8 688 bp一致,提示線性化載體切割成功。見圖2?。通過aKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒進行膠回收,得到的線性化載體在T4 DNA ligase的作用下與退火的雙鏈oligo序列進行連接,然后進行菌落PCR。瓊脂糖凝膠電泳顯示,Y4056、Y21318、Y21319、Y21320四種慢病毒載體條帶大小均略低于500 bp,與實際的474 bp一致,提示成功篩選出陽性克隆。見圖2?。DNA測序后通過Vector NTI軟件比對,顯示各重組質粒載體序列與設計序列一致。見圖3。綜合上述結果提示pCLenti-U6-shRelA-CMV-mCherry-F2A-Neo-WPREo質粒(Y4056、Y21318、Y21319、Y21320)構建成功。

?載體酶切結果,1:DNA ladder marker;2:H5739載體;3:H5739載體酶切后片段。?菌落PCR鑒定結果,M:DL2000 DNA marker;1～3:Y21318挑取的3個轉化子;4～6:Y21319挑取的3個轉化子;7～9:Y21320挑取的3個轉化子;10～12:Y4056挑取的3個轉化子圖2 RelA基因沉默慢病毒質粒載體凝膠電泳及菌落PCR鑒定結果圖

?Y4056;?Y21318;?Y21319;?Y21320圖3 RelA基因沉默慢病毒質粒測序比對結果圖

2.2慢病毒Lenti-shRelA包裝及滴度檢測結果 采用慢病毒包裝試劑盒和293T細胞將基因沉默慢病毒質粒包裝后并進行滴度測定。轉染72 h后,熒光顯微鏡觀察到四種慢病毒的熒光強度隨病毒含量升高均逐漸升高。見圖4。提取293T細胞的基因組DNA,通過qRT-PCR測定各慢病毒滴度,舍去誤差較大的結果,最終得出四種慢病毒滴度分別為3.13×108TU/ml(Y4056)、2.97×108TU/ml(Y21318)、2.51×108TU/ml(Y21319)、3.40×108TU/ml(Y21320)。見表4～7。

?Y4056;?Y21318;?Y21319;?Y21320圖4 慢病毒轉染293T細胞熒光圖(×100)

表4 Y4056滴度測定結果

表5 Y21318滴度測定結果

表7 Y21320滴度測定結果

2.3Lenti-shRelA對HepG2細胞的干擾效果 使用上述四種慢病毒轉染HepG2細胞,當未轉染慢病毒的細胞在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中全部死亡后,熒光顯微鏡下觀察到所有細胞均表達mCherry紅色熒光,提示轉染成功。見圖5?。Western blot實驗結果顯示,發(fā)現(xiàn)與對照Y4056相比,Y21318、Y21319和Y21320三種慢病毒感染的HepG2細胞的RelA在蛋白質水平上的表達均顯著降低(P<0.05),其中Y21320干擾效果最好。見圖5??。選擇干擾效果最好的Y21320慢病毒進行后續(xù)實驗。

?熒光顯微鏡觀察HepG2細胞經(jīng)慢病毒感染后的mCherry紅色熒光表達情況(×100);??Western blot實驗驗證HepG2細胞經(jīng)慢病毒感染后RelA蛋白的表達,與Y4056比較,*P<0.05圖5 Lenti-shRelA對HepG2細胞的干擾效果圖

2.4RelA敲降抑制HepG2細胞增殖 通過CCK-8實驗檢測RelA敲降后對細胞增殖活力的影響,結果顯示,RelA敲降后細胞增殖活力降低。見圖6。提示RelA在調控細胞增殖上發(fā)揮著重要作用。

圖6 RelA敲降對HepG2細胞增殖活力影響的結果圖(*P<0.05)

3 討論

3.1RNAi是指在進化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象[8]。由于shRNA表達載體可以穩(wěn)定抑制靶基因,已經(jīng)成為腫瘤領域常用的科學研究手段[10]。慢病毒載體是一類由人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)改造的病毒載體,優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究,避免由于質粒轉染效率低而帶來的不便,而且轉染效果更加穩(wěn)定[9,11]。本研究采用慢病毒載體介導的RNAi技術穩(wěn)定沉默HepG2細胞的RelA基因。

3.2RelA作為NF-κB家族的一個重要的轉錄因子,可通過影響下游靶基因的表達調控細胞的增殖、炎癥反應、免疫、分化等,對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在胰腺癌中,沉默含F(xiàn)YVE、Rho GEF和PH結構域蛋白3(FYVE,RhoGEF and PH domain-containing 3,FGD3)可上調RelA表達而促進胰腺癌細胞增殖和轉移[12]。在肺癌中,NF-κB亞單位p50/p65激活可以促進肺腺癌細胞H1650對吉非替尼的耐藥[13]。在乳腺癌中,RelA是F-盒和含蛋白2的WD重復結構域(F-box and WD repeat domain-containing protein 2,FBXW2)的底物,兩者表達水平呈負相關。當敲降FBXW2表達后,RelA表達升高,從而促進了腫瘤的生長。在FBXW2敲降的基礎上敲降p65,腫瘤的生長可被抑制[14]。

3.3RelA在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計,在所有癌癥的發(fā)病率和死亡率中,肝癌分別位于第6位和第3位[15],而目前對于肝癌的治療方法,包括手術、介入、靶向藥物和免疫檢測點藥物治療等,仍存在疾病復發(fā)率高、患者生存率低等問題[16]。因此,尋找肝癌新的治療靶點尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),通過抑制RelA的核易位,減少氧化應激和炎癥,可改善肝纖維化[17];抑制NF-κB p65的磷酸化可以改善肝損傷,抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[18-19];RelA表達水平升高促進了小鼠肝癌的發(fā)生[20]。上述研究結果提示抑制RelA的表達或磷酸化,可能有助于抑制腫瘤的進展。

3.4在腫瘤中某些基因的異常表達常常引起RelA表達或磷酸化水平的異常,進而影響腫瘤的增殖、遷移等[21-23]。本研究團隊的前期研究發(fā)現(xiàn),二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)可以通過激活NF-κB通路,使RelA磷酸化水平上升,誘導促炎因子的表達,從而促進肝癌的發(fā)生,而NF-κB通路抑制劑QNZ可以逆轉這種作用[7]。提示RelA在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用,但其具體生物學機制仍未被完全闡明。鑒此,本研究設計合成了RelA干擾序列并連接到H5739載體上,獲得了滴度分別為3.13×108TU/ml(Y4056)、2.97×108TU/ml(Y21318)、2.51×108TU/ml(Y21319)、3.40×108TU/ml(Y21320)的慢病毒載體。實驗結果顯示,本研究所構建的RelA shRNA慢病毒載體在體外可高效轉染HepG2細胞,經(jīng)過遺傳霉素G418的篩選,死亡細胞較少,且95%以上細胞呈現(xiàn)紅色熒光。Western blot實驗結果顯示,shRelA慢病毒載體干擾效率較高,并篩選出了干擾效果最好的Y21320進行后續(xù)研究。CCK-8實驗結果顯示,敲降RelA表達可顯著抑制HepG2細胞的增殖,提示RelA在調控細胞增殖上可能發(fā)揮著重要作用,但其機制仍需進一步探究。

綜上所述,本研究成功構建了RelA基因shRNA慢病毒載體,獲得了穩(wěn)定沉默RelA基因的HepG2細胞,為進一步研究RelA基因在肝癌發(fā)展中的機制奠定了基礎。