烏東高娃，溫永勝，郭 昊，劉春羽，趙洪哲，王鳳雪，溫永俊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古元山生物科技有限公司，呼和浩特 010018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，也是全球最重要的動(dòng)物病原體之一[1-2]。其臨床癥狀為母豬嚴(yán)重的繁殖障礙，斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率增加[3-4]。自從發(fā)現(xiàn)該病毒以來(lái)，在流行病學(xué)和分子學(xué)研究方面已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但是尚無(wú)有效的防治措施來(lái)消除這種病毒的感染[5]。在PRRSV中，全長(zhǎng)單鏈基因組RNA的長(zhǎng)度為15 kb左右，帶有5'帽子結(jié)構(gòu)和3'聚腺苷酸化尾巴結(jié)構(gòu)。具有10個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7），分別編碼PP1a、PP1ab、GP2a、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M和N蛋白，兩側(cè)為5'和3'非翻譯區(qū)[6-9]。

GP2a蛋白由ORF2a編碼，分子量為29～30 kDa[10]，GP2a與GP2為同一種蛋白，只是不同文章的表述差異。GP2a為具有Ⅰ端信號(hào)序列和C端膜錨的推定的Ⅰ類整合膜蛋白，包含兩個(gè)預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)[11]。PRRSV GP2通過(guò)二硫鍵和GP3、GP4在包膜表面組裝形成同源或異源多聚體（GP2-GP3-GP4復(fù)合物），對(duì)于病毒進(jìn)入易感宿主細(xì)胞至關(guān)重要[10]。與GP3、GP4等其他結(jié)構(gòu)蛋白相比，GP2蛋白的異質(zhì)性較低。它由預(yù)測(cè)的N端信號(hào)序列，168個(gè)殘基的胞外域，一個(gè)跨膜（TM）螺旋和20個(gè)殘基的內(nèi)域組成[12]。

Bautista等[13]使用痘苗病毒為表達(dá)載體，驗(yàn)證了GP2多肽可以誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。Das等[14]研究表明小包膜糖蛋白GP2a和GP4與受體CD163特異性相互作用。Welch等[15]利用感染性基因克隆的研究缺失ORF2基因，發(fā)現(xiàn)GP2蛋白對(duì)病毒的復(fù)制必不可少。劉益民[16]發(fā)現(xiàn)GP2羧基端10個(gè)氨基酸的缺失，不影響重組病毒Marc-145細(xì)胞上的生長(zhǎng)復(fù)制，也不改變重組病毒的中和抗原，推斷GP2蛋白可能與PRRSV侵染宿主細(xì)胞和調(diào)控宿主免疫反應(yīng)有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 Marc-145細(xì)胞、HEK293FT細(xì)胞、慢病毒載體pLV-EF1a -EGFP-2A、pMD2.G質(zhì)粒、pSPAX2質(zhì)粒均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TOLOBIO公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase購(gòu)自NEB公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen公司；TIANamp Genomic DNA Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、細(xì)胞培養(yǎng)基MEM、新生胎牛血清GIBCON FBS購(gòu)自Invitrogen公司；胎牛血清FBS（CLARK）購(gòu)自Bioscience公司；0.25%胰酶、0.05%胰酶購(gòu)自Biological Industries公司。

1.3 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)慢病毒載體pLVEF1a-EGFP-2A序列選取單一的酶切位點(diǎn)NotⅠ和BamHⅠ，并根據(jù)PRRSV感染性克隆pJXwn06設(shè)計(jì)ORF2的特異性擴(kuò)增引物：ORF2-F：5'-AAGGA AAAAAGCGGCCGCATGAAATGGGGTCTATGC AA-3'，ORF2-R：5'-CGCGGATCCTCACCATGA GmTTCAAAAG-3'，下劃線為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。以感染性克隆pJXwn06為模板，通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增PRRSVORF2基因序列。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；68℃再延伸7 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的條帶。將慢病毒載體pLV-EF1a-EGFP-2A以及膠回收產(chǎn)物用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化于Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL涂布于氨芐抗性的LB培養(yǎng)平板。12 h后挑取單個(gè)菌落接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌，菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽(yáng)性樣品進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pLVEF1a-EGFP-2A-GP2。

1.4 慢病毒的包裝 將HEK293FT細(xì)胞接種到T25小瓶，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置pLVEF1a-EGFP-2A質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，按照Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明，將pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2（10 μg）、pMD2.G（5 μg）、psPAX2（5 μg）三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，6 h后更換新鮮2%FBS DMEM維持液。觀察48 h，收集病毒上清液后更換新鮮維持液，72 h再次收集病毒上清液。離心去除細(xì)胞殘?jiān)?，?80℃保存。

1.5 測(cè)定嘌呤霉素的殺滅曲線 嘌呤霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的推薦使用濃度為1～10 μg/mL，不同細(xì)胞嘌呤霉素的工作濃度也不同，因此需要?dú)缜€來(lái)確定。將Marc-145細(xì)胞接種到24孔板，12 h后棄掉原培養(yǎng)基，加入新鮮的不同濃度嘌呤霉素（1～10 μg/mL，共設(shè)置10個(gè)梯度濃度）篩選培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d更換一次含有嘌呤霉素的10%FBS MEM培養(yǎng)基。每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞存活率，從而篩選4～6 d內(nèi)有效殺死所有非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的嘌呤霉素最低工作濃度。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞克隆 將狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將收集的慢病毒液放置冰上慢慢融化，棄掉6孔板中原有的培養(yǎng)基，加入混有1/2病毒原液的新鮮培養(yǎng)基感染細(xì)胞，37℃感染4 h，補(bǔ)齊培養(yǎng)基。24 h后棄掉孔內(nèi)的原有培養(yǎng)基，加入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)。感染48 h后棄去原培養(yǎng)基，更換為新鮮的含有嘌呤霉素的10%FBS MEM培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待陰性對(duì)照的細(xì)胞全部死亡后終止篩選。將篩選出來(lái)的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取樣進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色和計(jì)數(shù)。取部分細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋并加入96孔板，使細(xì)胞含量分別2個(gè)/孔、1個(gè)/孔和0.5個(gè)/孔。每天觀察細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)情況，選擇只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的孔，棄掉兩個(gè)以上和沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的孔，兩周后將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并傳代，傳至10代后對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。

1.7 細(xì)胞系的PCR鑒定 將Marc-145 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用TIANamp Genomic DNA Kit提取Marc-145細(xì)胞以及細(xì)胞系的DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定ORF2基因是否成功整合到宿主細(xì)胞染色體。PCR 反應(yīng)條件參考步驟1.3。將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物混合10× loading buffer進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析結(jié)果。

1.8 細(xì)胞系的蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定 本實(shí)驗(yàn)設(shè)置空載轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞及Marc-145細(xì)胞作為對(duì)照。挑選PCR鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞系，用高效RIPA裂解液裂解，混合 5×loading buffer 高溫煮樣后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉4 h，PBS洗滌3遍，GP2單克隆抗體（1∶1000倍稀釋）37℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每次15 min。HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶2000 倍稀釋）37℃孵育1 h，PBST洗滌3遍，每次15 min。用凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及包裝 以pJXwn06為模板擴(kuò)增ORF2基因序列并純化回收。用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切純化后的PCR產(chǎn)物以及pLV-EF1a-EGFP-2A載體，膠回收酶切產(chǎn)物后連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌并進(jìn)行搖菌，菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行NotⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，并設(shè)置pLV-EF1a-EGFP-2A為陰性對(duì)照，雙酶切得到約9452 bp和771 bp的條帶（圖1），成功獲得重組的慢病毒質(zhì)粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。將慢病毒pLV-EF1a-EGFP-2A質(zhì)粒設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照，將重組的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVEF1a-EGFP-2A-GP2與輔助質(zhì)粒pMD2.G、pSPAX2共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。24 h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察熒光，如觀察到綠色熒光則表明慢病毒載體中GFP表達(dá)，慢病毒包裝成功。

圖1 質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Plasmid double restriction digestion verification

2.2 嘌呤霉素殺滅曲線的確定 將Marc-145細(xì)胞接種到24孔板孵育過(guò)夜，棄掉原培養(yǎng)基并加入不同濃度嘌呤霉素（1～10 μg/mL）篩選培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d更換一次新鮮的含有嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基。最終確定4～6 d內(nèi)有效殺死非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最低嘌呤霉素濃度為6 μg/mL。

2.3 慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞系的篩選 將包裝好的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)Marc-145細(xì)胞，用6 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行篩選，通過(guò)有限稀釋法，將篩選后的細(xì)胞稀釋到96孔板中，挑選只有1個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的孔繼續(xù)孵育培養(yǎng)，兩周左右細(xì)胞已克隆成團(tuán)后可以擴(kuò)大培養(yǎng)，成功篩選得到目的細(xì)胞株。

2.4 細(xì)胞系的PCR及Western blot鑒定 提取細(xì)胞系的DNA，PCR擴(kuò)增ORF2基因序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在771 bp左右處有特異性條帶（圖2）。裂解細(xì)胞系，提取細(xì)胞系總蛋白并進(jìn)行Western blot鑒定，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)顯示在28 kDa左右處有目的條帶（圖3）。PCR、Western blot鑒定結(jié)果表明成功獲得穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP2蛋白的Marc-145細(xì)胞系。

圖2 PCR檢測(cè)細(xì)胞系中ORF2基因Fig.2 PCR amplification of ORF2 gene in cell lines

圖3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞系中GP2蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detection of GP2 protein expression in cell lines

3 討論

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是一種可用于人類基因治療的有吸引力的工具。目前所應(yīng)用的慢病毒屬于復(fù)制缺陷型病毒，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，慢病毒載體還可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而實(shí)現(xiàn)持久表達(dá)，是一種理想的用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移載體[17-18]。建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，在研究基因功能、藥物開(kāi)發(fā)等生物研究中具有重要作用[17]。

針對(duì)PRRSV相關(guān)細(xì)胞系的研究，Lee等[19]建立了可以穩(wěn)定表達(dá)CD163的PAM細(xì)胞系，該細(xì)胞株完全允許1型和2型PRRSV株。這種允許PRRSV的PAM細(xì)胞系將不僅是促進(jìn)病毒繁殖的重要工具，而且是推進(jìn)病毒發(fā)病機(jī)理的體外研究的寶貴工具。Song等[20]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)N蛋白的BHK-21細(xì)胞系，同時(shí)構(gòu)建缺失部分ORF7的PRRSV感染性克隆，通過(guò)反式互補(bǔ)成功拯救出復(fù)制缺陷型的PRRSV病毒。Pujhari等[21]利用星形孢菌素處理誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)Marc-2a細(xì)胞系中凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，推測(cè)GP2蛋白可能有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

慢病毒過(guò)表達(dá)載體pLV-EF1a-EGFP-2A可以使EGFP蛋白和GP2蛋白在同一個(gè)啟動(dòng)子下表達(dá)，但互不影響分別發(fā)揮作用。因此我們可以通過(guò)觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)情況確定轉(zhuǎn)染是否成功以及GP2是否整合到宿主染色體中。

在本研究中，我們旨在生成一組穩(wěn)定的Marc-145-GP2細(xì)胞系，通過(guò)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞呈綠色熒光。利用ORF2特異性引物PCR擴(kuò)增到ORF2序列，表明ORF2基因已成功整合到靶標(biāo)染色體中。采用Western blot技術(shù)，利用GP2單克隆抗體證實(shí)GP2蛋白的恒定高水平表達(dá)。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP2蛋白的Marc-145細(xì)胞系，為研究PRRSV蛋白的結(jié)構(gòu)功能，特別是研究GP2蛋白的免疫學(xué)特性和功能奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)為研制抗PRRS的新型復(fù)制缺陷型疫苗奠定了基礎(chǔ)。