朱玲玲，孫敏華，胡 怡，汪 婷，徐 歡，汪 威，殷世彬，汪招雄

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣州 510640）

鴨傳染性漿膜炎（infectious serositis of duck）是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer,RA）感染鴨引起的一種高度接觸性敗血性傳染病[1-2]。該病多見于1～8周齡雛鴨，發(fā)病率和死亡率都非常高，其特征癥狀為肝周炎、纖維素性心包炎、腦膜炎和氣囊炎，是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的細(xì)菌性傳染病之一，每年給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。在生產(chǎn)實(shí)踐中由于抗生素的長(zhǎng)期大量使用，越來越多的RA表現(xiàn)出耐藥性，其耐藥譜廣泛且不同的菌株耐藥性存在極大的差異[5]。目前已對(duì)RA檢測(cè)到氯霉素、氟苯尼考、紅霉素等抗生素的耐藥基因，耐藥株的廣泛出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了抗生素防治該病的臨床效果[6-7]。

本試驗(yàn)從湖北不同地區(qū)規(guī)?；唸?chǎng)采集了鴨傳染性漿膜炎疑似病例肝臟，分離鑒定了34株RA菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行了耐藥譜分析，測(cè)定了氟苯尼考flor基因，為今后湖北省RA的藥物防控提供了近期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為flor耐藥性機(jī)制的研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料和主要試劑 從湖北荊州、潛江、荊門等地多個(gè)患病鴨場(chǎng)采集疑似鴨傳染性漿膜炎肝臟，病鴨均表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，解剖可見典型的纖維性心包膜炎、肝周炎等病理變化。胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）均購自美國BD Bifco公司；藥敏片購自中國藥物研究所。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)RAOmpA基因序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，RA-OmpA-F為ATGTTG ATGACTGGACTTGGT，RA-OmpA-R為CTTCAC TACTGGAAGGTCAGA，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1119 bp；根據(jù)RAflor基因序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，上游引物flor-F為ATGACCACCACACGC，下游引物為RAOmpA-R為TTAGACGACTGGCGACT，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1215 bp。引物序列均由華大基因有限公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離 無菌采集鴨傳染性漿膜炎疑似病例肝臟，在TSA培養(yǎng)基上劃線接種，37℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落于TSB中，37℃振蕩培養(yǎng)16～40 h。

1.4 細(xì)菌革蘭氏染色 挑取純化過的單菌落，涂抹于干凈的載玻片，用細(xì)菌革蘭氏染色法進(jìn)行染色，在油鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.5 生化試驗(yàn) 對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，靛基質(zhì)、VP試驗(yàn)、硝酸鹽還原、硫化氫產(chǎn)生、甲基紅、觸酶、氧化酶等試驗(yàn)。

1.6 RA的PCR鑒定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作為模板備用，構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性8 min；94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸1 min。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像下觀察。

1.7 藥敏試驗(yàn) 取200 μL菌液均勻涂布于TSA平板上，待菌液吸收后，在平皿上均勻貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)16 h，測(cè)量、記錄結(jié)果。

1.8 RA氟苯尼考耐藥基因PCR鑒定 取50 μL菌液在沸水中煮5 min作為模板備用，構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性8 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸1 min。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像下觀察。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)特性 分離的菌株在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，菌落為白色圓形，大小1～2 mm，表面光滑。在含有胰蛋白酵母的肉湯中37℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基中呈現(xiàn)輕微渾濁現(xiàn)象，管底出現(xiàn)少量沉淀。

2.2 形態(tài)及染色 革蘭氏染色可見分離菌株呈現(xiàn)典型的兩極著色紅色短小桿菌。多數(shù)單個(gè)存在，少數(shù)成雙或短鏈排列（圖1）。

圖1 RA革蘭氏染色形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of RA

圖2 RA OmpA基因 PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The detection of RA OmpA gene by PCR

圖3 RA氟苯尼考flor基因PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of flor gene in RA

2.3 分離菌株的生化鑒定 對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果表明34株分離菌株不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。枸櫞酸鹽、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)均為陰性，氧化酶、尿素反應(yīng)為陽性。

2.4 分離菌株特異性PCR鑒定 34株菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物菌呈現(xiàn)特異性條帶，大小與目的基因片段一致。將PCR膠回收產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，與RA的OmpA基因序列同源性高達(dá)99%。

2.5 RA耐藥性分析 藥敏試驗(yàn)顯示，34株分離株耐藥性較強(qiáng)，對(duì)頭孢噻肟、大觀霉素和阿米卡星敏感性比較高，對(duì)新霉素和諾氟沙星耐藥性最強(qiáng)，對(duì)氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素的耐藥性介于二者之間。

表1 34株鴨疫里默氏桿菌對(duì)12種抗生素耐藥性分析Table 1 Drug resistance of 34 strains of Riemerella anatipestifer to 12 antibiotics

2.6 RA氟苯尼考flor基因的PCR鑒定及序列分析 對(duì)34株RA進(jìn)行氟苯尼考耐藥基因flor、fexA、fexAv、fexB、cfr進(jìn)行PCR測(cè)定，結(jié)果只有flor基因顯示目的條帶，其他基因均不顯示。其中16株RA擴(kuò)增出與目的片段大小一致的特異性片段，膠回收產(chǎn)物送至擎生物科技有限公司測(cè)序，所得序列與flor全基因序列比對(duì)，相似性高達(dá)100%。

3 討論

本研究從湖北省鴨場(chǎng)采集了鴨傳染性漿膜炎疑似感染鴨病料，分離和鑒定了34株鴨疫里默氏桿菌。藥物敏感性試驗(yàn)表明，34株分離株耐藥性普遍較強(qiáng)，耐藥譜較廣，很多分離的菌株對(duì)3種以上的抗生素產(chǎn)生了耐性性。對(duì)12種抗生素耐藥性比較分析顯示，頭孢噻肟、大觀霉素和阿米卡星對(duì)大部分分離菌株比較敏感，但是分離菌株對(duì)新霉素和諾氟沙星耐藥性最強(qiáng)，超過三分之二的菌株產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素的耐藥性介于兩者之間。對(duì)耐藥性統(tǒng)計(jì)表明在臨床上用于治療RA的常規(guī)藥物品種有限，有些藥物在較低的濃度下基本上失去作用，預(yù)示著加大了臨床藥物防治該病的難度，穿梭用藥、聯(lián)合用藥以及使用高成本藥物勢(shì)必會(huì)增加養(yǎng)殖成本，將進(jìn)一步提高RA對(duì)少數(shù)品種藥物耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)[8-11]。

氯霉素類藥物具有抗菌譜廣、吸收快的特點(diǎn)，廣泛分布于體內(nèi)，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都是該類藥物里的經(jīng)典藥物等。氟苯尼考價(jià)格低廉，近些年在鴨場(chǎng)被廣泛用來防控RA，近年來分離出來的具有氟苯尼考抗性的RA比例逐漸增加，呈現(xiàn)越來越廣泛的趨勢(shì)[12-13]。本研究在藥物敏感試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)34株分離株測(cè)定了氟苯尼考flor基因，發(fā)現(xiàn)其中16株分離株攜帶該基因，進(jìn)一步驗(yàn)證了RA對(duì)氟苯尼考耐藥的廣泛性和嚴(yán)重性。