陳 蕓，劉 旗，張曼玉，耿小玲，蔣 蔚，王 權(quán)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii,T.gondii）為一種專性胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲，可感染幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞[1]。全世界大約三分之一的人口感染了弓形蟲[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)的弓形蟲感染率為7.9%，低于世界平均水平，但呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[3]。弓形蟲主要有三種感染途徑：經(jīng)口感染，經(jīng)血液感染及先天性感染[4]。當(dāng)機(jī)體感染弓形蟲后，通常表現(xiàn)為隱性感染，但免疫力低下者（如艾滋病患者、惡性腫瘤患者、服用免疫抑制藥物的患者等）感染弓形蟲后會(huì)導(dǎo)致全身急性感染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。此外，孕期感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎以及新生兒先天性弓形蟲病等[5]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)上，弓形蟲可感染多種家畜，影響其生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖，并導(dǎo)致肉/奶產(chǎn)品質(zhì)量下降，直接或間接帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且食用被感染動(dòng)物的肉制品或奶制品，也可將弓形蟲傳播給人類，嚴(yán)重威脅人類健康[6]。

弓形蟲危害嚴(yán)重與其具有逃逸宿主的天然免疫的功能相關(guān)[7]。棒狀體蛋白（rhoptries,ROPs）在入侵宿主過程中由弓形蟲棒狀體分泌，經(jīng)蟲體頂端釋放至納蟲泡（parasitophorous vacuole,PV）或者宿主細(xì)胞胞質(zhì)中，主要參與調(diào)節(jié)蟲體入侵，增殖及PV形成等[8]。ROP18是一種高度多態(tài)性的棒狀蛋白激酶，具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)[9]，能特異性結(jié)合宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫相關(guān)GTP酶（immunityrelated GTPases,IRGs），主要磷酸化IRGs中的Irga6的第102位、108位蘇氨酸，防止Irga6在納蟲泡膜上積累并破壞納蟲泡的完整性[10]。此外，ROP18還可以靶向激活轉(zhuǎn)錄因子（activating transcription factor 6 beta,ATF6-β），導(dǎo)致其降解，從而干擾ATF6-β相關(guān)的免疫反應(yīng)[11]，還可抑制宿主的NF-κB信號(hào)通路[12]。近年來還發(fā)現(xiàn)弓形蟲ROP18可通過線粒體凋亡途徑抑制宿主細(xì)胞凋亡，維持線粒體膜電位和完整性，阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中[13-14]。ROP5是由一組串聯(lián)的、重復(fù)的高度多態(tài)性基因組成的假激酶[15]，與ROP18協(xié)同作用可增加ROP18的磷酸化活性[16]。此外，ROP5也可直接與納蟲泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）上的IRGs結(jié)合，當(dāng)弓形蟲缺乏ROP18基因時(shí)，ROP5在逃逸宿主免疫方面發(fā)揮重要作用[17]。此外，Zheng等[18]發(fā)現(xiàn)ROP5的重組蛋白疫苗可以誘導(dǎo)細(xì)胞和體液（Th1/Th2）免疫應(yīng)答，延長(zhǎng)感染RH株小鼠的存活時(shí)間。Yuan等[19]研究發(fā)現(xiàn)ROP18核酸疫苗可增強(qiáng)昆明鼠對(duì)弓形蟲特異性Th1型應(yīng)答，并顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間。

上述表明ROP5、ROP18均為弓形蟲重要的毒力因子，具有調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)的功能，可能還具有其他尚待發(fā)現(xiàn)的功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建弓形蟲RH株ROP5的單基因缺失株，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建ROP5與ROP18的雙基因缺失株，為進(jìn)一步研究ROP5與ROP18的作用機(jī)制及基因缺失弱毒株疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、蟲株、質(zhì)粒與小鼠 Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室液氮保存，復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基；弓形蟲RH株由本實(shí)驗(yàn)保存；弓形蟲ROP18缺失株（ROP18-KO）由本實(shí)驗(yàn)前期試驗(yàn)構(gòu)建并保存于液氮中；質(zhì)粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT與質(zhì)粒pDHFR:UPRT-D為本實(shí)驗(yàn)室保存；pCas9-CAT質(zhì)粒（Addgene,cat.no.80323）購(gòu)自addgene；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；清潔級(jí)雌性昆明鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰酶均購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自BI公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Phanta Max Super-Fidelity與ClonExpress MultiS One step Cloning Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；結(jié)晶紫染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；CFDA SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒和同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)獲取弓形蟲RH株ROP5基因全長(zhǎng)序列（GenBank：HQ916455.1），利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)在線網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu）設(shè)計(jì)ROP5的sgRNA引物，選取得分較高的sgRNA序列，并將sgRNA引物送金唯智公司合成。以pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質(zhì)粒為模板，將pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質(zhì)粒以3個(gè)片段的形式擴(kuò)增（引物見表1），并將質(zhì)粒中的sgRNA序列替換為ROP5的sgRNA序列。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收純化，再通過ClonExpress MuLtiS One step Cloning Kit進(jìn)行連接。將同源重組后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，再涂布于含有氨芐青霉素（Ampicillin,AMP）的固體培養(yǎng)基上，篩選單克隆菌落，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。以pUPRT::DHFR-D質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增pROP5::DHFR-D質(zhì)粒骨架部分及DHFR抗性基因部分，以RH株DNA為模板擴(kuò)增ROP5的5'UTR及3'UTR片段，并通過ClonExpress MuLtiS One step Cloning Kit進(jìn)行連接，構(gòu)建pROP5::DHFR-D質(zhì)粒（引物見表2），轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，分別擴(kuò)增5'UTR與DHFR片段連接處，3'UTR與DHFR片段連接處、驗(yàn)證質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，引物見表3。以相同方法構(gòu)建pROP18::CAT-D質(zhì)粒，其中以pCas9/CAT質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增氯霉素抗性基因（CAT）。

表1 構(gòu)建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5的引物Table 1 The primers for construction of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5

表2 構(gòu)建pROP5::DHFR-D的引物Table 2 The primers for construction of pROP5::DHFR-D

表3 驗(yàn)證pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5與pROP5::DHFR-D的引物Table 3 The primers for identification of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5 and pROP5::DHFR-D

1.4ROP5缺失株的構(gòu)建及驗(yàn)證 收集新鮮逸出的RH株速殖子，經(jīng)孔徑為5 μm的濾器過濾純化后，用電轉(zhuǎn)液Cytomix洗滌兩遍并重懸蟲體。將質(zhì)粒pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5和pROP5::DHFR-D各30 μg（1∶1的比例）加入至1×107個(gè)純化后的弓形蟲RH株中，再加入一定量的電轉(zhuǎn)液，使最終體積為300 μL，混勻后加入至2 mm間距的電擊杯中，用Gene Pulser Xcell電穿孔系統(tǒng)（Bio-rad伯樂）按照以下參數(shù)電轉(zhuǎn)：電壓為1500 V，電容為25 μF，電阻為50 ?。電轉(zhuǎn)后的蟲體轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)滿80%Vero細(xì)胞的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，將培養(yǎng)基更換為含有3 μmol/L息瘧定的培養(yǎng)基，對(duì)弓形蟲進(jìn)行藥物篩選，并將繼續(xù)增殖的弓形蟲轉(zhuǎn)移至含80%Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行單克隆篩選，連續(xù)篩選3代后，擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆蟲株，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物見表4。

表4 用于鑒定ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的引物Table 4 The primers for identification of ROP5-KO strain and ROP5/ROP18-KO strain

1.5ROP5與ROP18雙基因缺失株的構(gòu)建及驗(yàn)證 將pSAG1:CAS9::TgU6:ROP18質(zhì)粒和pROP18::CAT-D質(zhì)粒各30 μg（1∶1的比例）加入至1×107個(gè)純化的ROP5-KO弓形蟲懸液中，總體積為300 μL，充分混勻后加入至間距為2 mm的電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)條件與參數(shù)同上，電轉(zhuǎn)后繼續(xù)放置于含Vero細(xì)胞的6孔板中培養(yǎng)，并用40 μmol/L的氯霉素進(jìn)行藥物篩選，再在96孔板中進(jìn)行3次亞克隆。篩選后的單克隆蟲株在6孔板中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取基因組DNA，擴(kuò)增ROP5基因片段及ROP18基因片段，驗(yàn)證雙基因缺失株是否構(gòu)建成功（引物見表4）。

1.6 入侵試驗(yàn) 將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株、ROP5/ROP18-KO株用CFDA SE標(biāo)記（具體試驗(yàn)步驟見說明書），標(biāo)記完成后，將各蟲株加入至含90%Vero細(xì)胞的6孔板中，每孔接種1×106個(gè)CFDA SE標(biāo)記的弓形蟲速殖子，37℃培養(yǎng)2 h后，PBS清洗未入侵Vero細(xì)胞的速殖子，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，用Beckman Coulter Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀檢測(cè)弓形蟲入侵Vero細(xì)胞的入侵率。

1.7 弓形蟲增殖試驗(yàn) 將每種蟲株（各5×105個(gè)速殖子）分別接種于含Vero細(xì)胞的6孔板中，每個(gè)蟲株設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。37℃培養(yǎng)12 h 后，PBS清洗除去未入侵細(xì)胞的蟲體，并加入新鮮的含2%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)假包囊，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)假包囊中含有的速殖子個(gè)數(shù)。

1.8 噬斑試驗(yàn) 分別將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株及ROP5/ROP18-KO株的速殖子（500個(gè)）接種于Vero細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，用PBS洗滌兩遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min，再用結(jié)晶紫室溫染色20 min，PBS洗去殘留的結(jié)晶紫后，顯微鏡下觀察各種蟲株所形成的空斑大小。

1.9 對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn) 本試驗(yàn)選取6～8周齡雌性昆明鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)分4組，每組10只昆明鼠，分別接種0.5 mL生理鹽水（對(duì)照組）、RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株、ROP5/ROP18-KO株各1000個(gè)速殖子，記錄并統(tǒng)計(jì)各組小鼠的死亡時(shí)間及死亡只數(shù)。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。如果與對(duì)照組有差異再對(duì)不同試驗(yàn)組進(jìn)行方法分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質(zhì)粒與pROP5::DHFR-D質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證 利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)查詢弓形蟲ROP5基因序列信息，可知ROP5基因具有三個(gè)亞型，分別是ROP5A（GenBank:HQ916451.1），ROP5B（GenBank: HQ916448.1），ROP5C（GenBank: HQ916455.1）。本實(shí)驗(yàn)首先以RH株DNA為模板，擴(kuò)增ROP5基因全長(zhǎng)并測(cè)序，經(jīng)BLAST對(duì)比得知，所擴(kuò)增的ROP5基因與ROP5B、ROP5C的相似性均99%。將pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT經(jīng)3個(gè)片段擴(kuò)增（圖1A），并將UPRT的sgRNA替換成ROP5的sgRNA，環(huán)化連接構(gòu)建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增含sgRNA片段并測(cè)序（圖1B）。為了構(gòu)建同源重組質(zhì)粒，以弓形蟲基因組DNA為模板，擴(kuò)增ROP5的5'UTR、3'UTR，以pUPRT::DHFR-D質(zhì)粒為模板擴(kuò)增質(zhì)粒骨架片段及DHFR抗性基因片段（圖1C），連接成功后，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定（圖1D）。結(jié)果顯示，用于敲除的兩個(gè)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

圖1 pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質(zhì)粒與pROP5::DHFR-D質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig.1 Construction and verification of pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5 and pROP5::DHFR-D

2.2ROP5基因敲除株的篩選與鑒定 將pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP5質(zhì)粒和pROP5::DHFR-D質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染至弓形蟲RH株速殖子中并經(jīng)息瘧定篩選，獲得單克隆蟲株。提取弓形蟲DNA進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)以RH株為對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明，以RH株DNA為模板擴(kuò)增出ROP5基因的901 bp，且條帶單一，但ROP5缺失株中無條帶。此外，ROP5-KO株擴(kuò)增出5'UTR與DHFR片段連接處1113 bp片段，3'UTR與DHFR片段連接處1470 bp片段，說明DHFR基因已重組至ROP5靶基因處，說明ROP5-KO株構(gòu)建成功（圖2）。

圖2 ROP5基因缺失株的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of ROP5-KO strain

2.3ROP5/ROP18雙基因缺失株的篩選及鑒定 本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已成功構(gòu)建pSAG1:CAS9::TgU6:sgROP18質(zhì)粒和pROP18::CAT-D質(zhì)粒。將兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)電轉(zhuǎn)至構(gòu)建成功的ROP5-KO株速殖子中，并通過40 μmol/L的氯霉素篩選。單克隆蟲株擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)以RH株為對(duì)照。結(jié)果顯示，RH株中存在ROP5及ROP8基因，而基因缺失蟲株中無條帶，說明ROP5與ROP18的雙基因缺失株構(gòu)建成功（圖3）。

圖3 ROP5/ROP18雙基因缺失株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of ROP5/ROP18-KO strain

2.4 體外入侵及增殖試驗(yàn) 為了研究ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的表型變化，我們?cè)u(píng)估了ROP5-KO株和ROP5/ROP18-KO株的入侵能力、增殖能力。通過流式細(xì)胞儀分析可以得出（圖4），RH株對(duì)Vero細(xì)胞的感染率為43.7%，而ROP5-KO株的感染率為34.8%，ROP18-KO株的感染率為29.3%，ROP5/ROP18-KO株的感染率為26.8%，說明缺失ROP5基因和ROP18基因均可導(dǎo)致弓形蟲體外入侵細(xì)胞的能力降低。同時(shí)缺失ROP5及ROP18基因后，弓形蟲的入侵能力明顯低于RH株，也低于ROP5-KO株及ROP18-KO株。增殖試驗(yàn)結(jié)果可以看出，入侵36 h后，RH株假包囊中多為16個(gè)速殖子，而ROP5-KO株和ROP18-KO株，ROP5/ROP18-KO株中多為8個(gè)速殖子，且雙缺失蟲株的含16個(gè)速殖子的假包囊個(gè)數(shù)顯著少于兩種單基因缺失株，說明ROP5與ROP18雙基因缺失后，顯著降低弓形蟲的增殖速率（圖5）。

圖4 流式細(xì)胞儀測(cè)弓形蟲的入侵率Fig.4 Detection of T.gondii invasion rate by flow cytometry

圖5 體外增殖試驗(yàn)Fig.5 Proliferation experiment in vitro

2.5 噬斑試驗(yàn) 噬斑試驗(yàn)的結(jié)果同樣可以看出，連續(xù)培養(yǎng)7 d后，ROP5-KO株、ROP18-KO株和ROP5/ROP18-KO株所形成的空斑面積小于RH株，且ROP5/ROP18-KO株所形成的空斑面積最?。▓D6）。說明ROP5與ROP18雙基因缺失后，速殖子的生存能力降低，與體外入侵及增殖能力的試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 噬斑試驗(yàn)Fig.6 Plaque assay

2.6 小鼠毒力試驗(yàn) 將RH株、ROP5-KO株、ROP18-KO株和ROP5/ROP18-KO株分別對(duì)昆明鼠進(jìn)行腹腔接種，接種劑量為1×103個(gè)，記錄各組昆明鼠的死亡時(shí)間。結(jié)果表明：RH株感染小鼠后，小鼠在第7 d全部死亡，但接種ROP5-KO株和ROP18-KO后，小鼠的存活時(shí)間均延長(zhǎng)，且接種ROP5/ROP18-KO株后，小鼠的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)至9 d，說明當(dāng)兩者同時(shí)敲除后，可顯著降低弓形蟲的毒力（圖7）。

圖7 缺失株對(duì)小鼠存活時(shí)間的影響Fig.7 Effects of mutant strains on the survival time of mice

3 討論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由CRISPR 序列元件與Cas9基因組成，然后通過一段序列特異性的guide-RNA分子引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶（Cas9）到特異靶點(diǎn)，從而定向完成基因組的編輯[20]。目前，CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)已成功應(yīng)用于瘧原蟲[21]、利什曼原蟲[22]、弓形蟲[23-25]等多種寄生蟲，提高了對(duì)寄生蟲基因的編輯效率，有助于功能基因的分析及疫苗候選分子的篩選等。隨著敲除技術(shù)的不斷發(fā)展，針對(duì)單個(gè)sgRNA難以剪切的基因，可通過改造pSAG1:CAS9::TgU6:sgUPRT質(zhì)粒，設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因上下游的兩個(gè)sgRNA，從而完成對(duì)整個(gè)目的基因片段進(jìn)行剪切，提高基因敲除效率[26]。此外，為了進(jìn)一步探索兩個(gè)基因的協(xié)同作用，可構(gòu)建針對(duì)目的基因的雙基因缺失株，用不同的藥物對(duì)陽(yáng)性蟲株進(jìn)行篩選。目前已發(fā)現(xiàn)可用于弓形蟲陽(yáng)性篩選的藥物有息瘧定、氯霉素、霉酚酸等，用于陰性篩選的藥物有5-氟尿嘧啶脫氧核苷（5-fluorodeoxyuracil）、6-硫黃嘌呤（6- thioxanthine）等。此外，Long等[27]還對(duì)基因敲除質(zhì)粒進(jìn)行改造，加入熒光標(biāo)簽蛋白（GFP和mCherry），通過熒光顯微鏡篩選陽(yáng)性蟲株。為了更利于探索弓形蟲各基因之間的相互作用，CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷優(yōu)化和升級(jí)，提高了基因編輯的效率及應(yīng)用范圍，促進(jìn)對(duì)弓形蟲各基因作用機(jī)制的研究，加快了對(duì)弓形蟲特異性疫苗的研究。

本試驗(yàn)通過息瘧定與氯霉素這兩種藥物對(duì)弓形蟲缺失株進(jìn)行陽(yáng)性篩選，并成功構(gòu)建了ROP5-KO株及ROP5/ROP18-KO株。表型試驗(yàn)結(jié)果表明，與RH相比，ROP5基因和ROP18基因單獨(dú)缺失后，弓形蟲的入侵及增殖能力、對(duì)小鼠毒力等方面均有明顯下降，且ROP5/ROP18-KO株的入侵及增殖能力降低更為顯著，且對(duì)小鼠毒力明顯降低。在早期研究中，F(xiàn)ox等[28]對(duì)Ⅱ型弓形蟲的多個(gè)ROP基因進(jìn)行敲除，并發(fā)現(xiàn)ROP5和ROP18基因缺失后顯著降低弓形蟲對(duì)IRGs的抵抗力，并增加小鼠的存活率，說明ROP5和ROP18都是Ⅱ型弓形蟲重要的毒力基因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明敲除RH株ROP5與ROP18后同樣會(huì)導(dǎo)致RH株毒力降低，但RH株為強(qiáng)毒株，缺失株感染只延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間，不能阻止小鼠死亡。Michael等[29]通過對(duì)Ⅱ型蟲株ME49和強(qiáng)毒蟲株VAND株進(jìn)行基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ROP5是導(dǎo)致強(qiáng)毒株和Ⅱ型蟲株差異的主要毒力因子，且缺失ROP5基因可導(dǎo)致VAND蟲株毒力顯著減弱。Saeij等[30]也發(fā)現(xiàn)ROP18對(duì)小鼠毒力的差異主要表現(xiàn)在其表達(dá)水平不同，ROP18在Ⅰ型與Ⅱ型蟲株體內(nèi)表達(dá)量高，而在Ⅲ型蟲株體內(nèi)表達(dá)量低，當(dāng)Ⅲ型蟲株過表達(dá)ROP18Ⅰ或者ROP18Ⅱ，可恢復(fù)弓形蟲對(duì)小鼠的毒力，說明ROP5與ROP18都是弓形蟲重要的毒力因子。

目前，對(duì)弓形蟲ROP5及ROP18的研究主要集中在IRGs方面。當(dāng)弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時(shí)，宿主天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，產(chǎn)生大量的IFN-γ[31]，IFN-γ進(jìn)一步通過多種作用途徑抑制弓形蟲增殖并殺滅弓形蟲[32-33]。IRGs可以聚集于納蟲泡膜表面，導(dǎo)致納蟲泡膜變形、穿孔甚至破裂，是宿主細(xì)胞抵抗胞內(nèi)弓形蟲的主要作用之一[34]，一旦納蟲泡膜損壞，弓形蟲將容易被宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)溶解，從而清除弓形蟲[35]。Zhao等[36]研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株可以抵抗IRGs在PVM上聚集，從而避免被清除，中等毒力的Ⅱ型和無毒力的Ⅲ型寄生蟲不能阻止IRGs的招募。造成這一顯著差異的主要原因是不同蟲株的ROP18和ROP5基因序列存在差異[37]。ROP18對(duì)阻止IRGs在納蟲泡上裝配等方面發(fā)揮重要作用[38]，它可磷酸化宿主Irga6核苷酸結(jié)合區(qū)域的兩個(gè)蘇氨酸，導(dǎo)致GTPase失去生物活性，抑制其在弓形蟲空泡膜上的積累。ROP5在阻斷IRG介導(dǎo)的免疫清除方面與ROP18具有協(xié)同作用[39]。此外，在缺乏ROP18時(shí)，ROP5可直接作用于IRGs，減少IRGs在PVM上富集[17]。

除了在抵抗IRGs方面發(fā)揮重要作用外，ROP5和ROP18還能抑制MHC-I對(duì)弓形蟲抗原的遞呈、減少CD8+T細(xì)胞識(shí)別和清除弓形蟲[40]。此外，ROP18具有抑制宿主細(xì)胞凋亡的作用[14]。由此猜測(cè)這兩者可能在其他方面也具有協(xié)同作用。構(gòu)建ROP5與ROP18的雙缺失株可為進(jìn)一步研究?jī)烧叩墓δ艿於ɑA(chǔ)。