郭長(zhǎng)明，陳懷君，袁 橙，封 琦，王永娟，徐 海，吳 雙，朱善元

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004）

禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli,APEC）屬于腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)[1]，所引起的禽大腸桿菌病可通過多種途徑進(jìn)行傳播，其特征是多器官組織的損傷并伴有肝炎和心包炎等癥狀，是一種復(fù)雜的綜合癥[2]。水禽大腸桿菌感染發(fā)病率和死亡率高，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。使用抗菌藥物仍然是治療水禽大腸桿菌病的主要手段，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，使水禽大腸桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥性日益嚴(yán)重，多重耐藥菌株增多，為臨床上防控和治療該病帶來極大的挑戰(zhàn)[3]。同時(shí)，不合理的使用抗菌藥物，也導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)抗菌藥物的殘留，細(xì)菌的耐藥性可以通過動(dòng)物源性食品傳給人類,從而威脅到人類的健康[4-5]。

禽大腸桿菌血清型數(shù)量眾多且復(fù)雜，并隨著時(shí)間和地域改變，使用疫苗對(duì)該病進(jìn)行防治存在難度。我國(guó)各地分離到的APEC血清型達(dá)50余種，常見的O抗原血清型為O2、O76、O78、O92和O93等[6]。研究表明，通過系統(tǒng)進(jìn)化分群對(duì)禽大腸桿菌進(jìn)行分類，其主要類型為B2和D型[6]。毒力相關(guān)因子在禽大腸桿菌感染的過程中發(fā)揮重要作用，如與宿主組織定植相關(guān)的黏附素（F1菌毛、P菌毛）、參與攝鐵的耶爾森菌強(qiáng)毒力島（high pathogenicity island,HPI）、腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島（locus of enterocyte effacement pathogenicity island,LEE）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)2（ETT2毒力島）、溶血素（hemolysin E,HlyE）、自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溫度敏感性血凝素（temperature-sensitive hemagglutinin,TSH）等。研究表明，部分毒力因子之間相互作用影響菌株的致病力，通常含有4個(gè)以上毒力因子的禽大腸桿菌具有致病性[6]。

2020年1月—2020年9月本實(shí)驗(yàn)室（江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）在江蘇省部分地區(qū)的水禽養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行采樣，并分離鑒定出禽大腸桿菌24株。通過對(duì)分離株進(jìn)行分子進(jìn)化分群、O抗原血清型、毒力基因和耐藥情況的檢測(cè)，旨在明確江蘇省水禽大腸桿菌病的流行情況和為有效防治大腸桿菌病提供參考。加強(qiáng)對(duì)水禽致病性大腸桿菌流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)和防控，對(duì)水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和獸醫(yī)公共衛(wèi)生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 24株禽大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室于2020年1月—2020年9月從江蘇部分地區(qū)水禽養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病死亡水禽的肝臟、心臟、腦中分離獲得。

1.2 主要試劑 2× RapidTaqMaster Mix、2×TaqMaster Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；大腸桿菌O抗原單因子血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離及16S rDNA PCR鑒定 用接種環(huán)在無菌條件下蘸取病死水禽的心臟、肝臟、腦組織，劃線于麥康凱平板上，37℃培養(yǎng)16 h，挑取單個(gè)紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，挑取金屬光澤疑似大腸桿菌單菌落，接種于LB培養(yǎng)基，置于搖床180 rpm、37℃恒溫培養(yǎng)6 h。分別取新鮮菌液1 mL，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]合成大腸桿菌16S rDNA PCR鑒定引物（表1），對(duì)24株分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，53℃退火15 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2.0 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

表1 16S rDNA和毒力相關(guān)基因引物序列Table 1 Primers for 16S rDNA and virulence-related genes

1.4 O抗原血清型鑒定 按照大腸桿菌O抗原定型血清說明書制備抗原，取抗原和血清各50 μL于載玻片上混勻，涂成直徑約2 cm的圓膜，1 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集顆粒判定為陽(yáng)性。同時(shí)以抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

1.5 毒力相關(guān)基因PCR鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-13]合成fimA、papC、irp2、eaeA、ECs3703、ECs3737、tsh、hlyE共8對(duì)毒力相關(guān)基因的檢測(cè)引物。對(duì)24株分離株進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，退火（退火溫度見表1）15 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2.0 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.6 細(xì)菌分子進(jìn)化分群PCR鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]合成大腸桿菌分子進(jìn)化分群引物（引物信息見表2），采用三重PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)分群鑒定，大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群判定標(biāo)準(zhǔn)見圖1。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2× RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，3對(duì)上、下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。

圖1 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化分群判定標(biāo)準(zhǔn)Fig.1 Standard for the determination of the Escherichia coli phylogenetic group

表2 大腸桿菌分子分群引物序列Table 2 Molecular clustering primer sequence of Eschorichia coli

1.7 藥敏試驗(yàn) 選取24種抗菌藥依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的抗生素藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，用Kirly-Baue紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株耐藥性。取100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液涂板、貼藥敏片，37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果并量取抑菌圈大小，依據(jù)抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離及16S rDNA PCR鑒定 用麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)大腸桿菌，再通過PCR鑒定，共分離到24株大腸桿菌。分離株在麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)見圖2，部分菌株16S rDNA PCR鑒定結(jié)果見圖3。

圖2 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基（A）和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的形態(tài)（B）Fig.2 Morphology of Escherichia coli on MacConkey (A)and Eosin-methylene Blue medium (B)

圖3 部分菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rDNA gene of some strains

2.2 O抗原血清型鑒定 對(duì)24株分離菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定，鑒定結(jié)果如表3所示。其中，血清型為O16、O68、O87、O126、O138、O164型的菌株各1株，O65血清型菌株共8株，占全部菌株的33.3%，其他血清型10株。

表3 24株禽致病性大腸桿菌的血清型分布Table 3 Serotype distributions of 24 strains of APEC

2.3 毒力基因的鑒定 通過PCR分別檢測(cè)了24株禽大腸桿菌分離株8種毒力基因，由檢測(cè)結(jié)果可知，除eaeA、papC、hlyE這3個(gè)毒力基因外，其余5種毒力基因均有檢測(cè)到（圖4～5）。其中fimA基因在所有菌株中被檢出20株（83.3%）、ECs3737基因18株（75%）、ECs3703基因16株（66.7%）、tsh基因8株（33.3%），均有較高的分布率，為重要的APEC毒力基因，而irp2基因檢測(cè)到3株陽(yáng)性，檢出率為4.2%。

圖4 部分菌株毒力基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products of virulence genes of some strains

圖5 8種毒力相關(guān)基因在24株APEC中的分布Fig.5 Distribution of 8 virulence-associated genes in 24 strains of APEC

對(duì)24株分離菌株毒力基因組合分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示，含有4個(gè)毒力基因組合的菌株共7株（29.2%），其中基因組合為fimA+ECs3703+ECs3737+tsh有6株，fimA+ECs3703+ECs3737+irp2組合1株。3種基因組合共9株（37.5%），其中組合fimA+ECs3703+ECs3737有7株。

表4 不同毒力基因組合在分離菌株中的分布Table 4 Distributions of combination of different virulence genes in isolated strains

2.4 細(xì)菌分子進(jìn)化分群鑒定 對(duì)24株水禽大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定，可觀察到特異電泳條帶chuA（279 bp）、yjaA（211 bp）和TspE4.C2（152 bp）（圖6）。系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果可知，非致病群A占45.8%（11/24），低致病群B1占33.3%（8/24），高致病群B2和D分別占8.3%（2/24）和1.3%（3/24）（表5）。

圖6 部分菌株系統(tǒng)進(jìn)化分群電泳結(jié)果Fig.6 Results of phylogenetic electrophoresis of some strains

表5 不同進(jìn)化分群在分離菌株中的分布Table 5 Distribution of different evolutionary clusters in isolated strains

2.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，24株分離菌株對(duì)受試的抗菌藥物表現(xiàn)出多重耐藥。其中分離菌株均對(duì)恩諾沙星、強(qiáng)力霉素（100%）耐藥，對(duì)四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素的耐藥率為91.7%。分離株對(duì)阿莫西林的敏感率僅為16.7%，但對(duì)阿莫西林/棒酸的敏感率為100%（表6）。多重耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，在24株分離菌株中，耐10種以上藥物的菌株占79.2%（19/24）（圖7）。

圖7 24株APEC對(duì)24種抗生素的多重耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.7 Results of multiple drug resistance of the 24 APEC isolates to 24 antibiotics

表6 24 株分離菌株的藥敏試驗(yàn)Table 6 Drug sensitivity assay for 24 isolated strains

3 討論

近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對(duì)肉蛋奶等動(dòng)物相關(guān)產(chǎn)品的需求量也與日俱增，在養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大的同時(shí)伴隨著動(dòng)物疫病頻發(fā)[14]。APEC具有復(fù)雜多樣的血清型，因此，使用疫苗對(duì)該病進(jìn)行預(yù)防較為困難。由于一些養(yǎng)殖場(chǎng)不合理地使用甚至濫用抗菌藥物，致使細(xì)菌耐藥性、多重耐藥性問題日趨嚴(yán)重。若動(dòng)物源食品中含有抗菌藥物殘留，會(huì)給人類和動(dòng)物的健康帶來不利影響。因此，對(duì)APEC進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查十分必要，以便掌握其流行特點(diǎn)及規(guī)律，為精準(zhǔn)防控該病奠定基礎(chǔ)。

本研究分離得到的24株APEC，通過血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)血清型主要為O65，與董向磊[15]報(bào)道的山東地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型結(jié)果一致。但是與國(guó)內(nèi)外其他研究報(bào)道的APEC優(yōu)勢(shì)血清型為O2、O76、O78、O92、O93、O119的結(jié)果差異較大[6,16-17]。研究表明，國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)的禽大腸桿菌分離株O抗原血清型存在一定差異，可能是采樣地點(diǎn)、季節(jié)及時(shí)間的不同所導(dǎo)致。此外，水禽的跨地域銷售運(yùn)輸和疫苗防控也可能使當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)血清型發(fā)生改變[18]。因此，需要針對(duì)各個(gè)地區(qū)流行的APEC血清型及相應(yīng)的環(huán)境氣候采取較為有效的防控措施。

系統(tǒng)進(jìn)化分群是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分型的一種重要的方法，可以追溯大腸桿菌進(jìn)化起源[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，24株分離菌株主要為A和B1進(jìn)化分群，與Kobayashi等[19]研究報(bào)道的巴西某屠宰場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化分群結(jié)果相一致，但與其他國(guó)家及國(guó)內(nèi)某些地區(qū)研究結(jié)果不同，部分研究顯示分離菌株的優(yōu)勢(shì)進(jìn)化分群為B2群[6,20]。分離菌株的進(jìn)化分群類型有所差異可能是由于采樣地點(diǎn)、動(dòng)物來源、飼養(yǎng)環(huán)境及采樣時(shí)間的不同所致。

本研究設(shè)計(jì)合成的8種毒力基因與禽大腸桿菌的致病性、耐藥性存有一定聯(lián)系。fimA基因在所有分離菌株中的檢出率為83.3%，ECs3737基因?yàn)?5%，ECs3703基因?yàn)?6.7%，均有較高的分布率，為重要的禽大腸桿菌毒力基因。而tsh、irp2基因在本研究中檢出率略低，分別為33.3%、4.2%。24株分離菌株同時(shí)也存在多種毒力基因組合形式，含有4個(gè)及以上毒力基因組合的菌株共7株，其中，fimA+ECs3703+ECs3737+tsh基因型有6株，fimA+ECs3703+ECs3737+irp2基因組合為1株。3基因組合共9株，其中fimA+ECs3703+ECs3737基因組合有7株。攜帶毒力基因較多的菌株可能致病性也較強(qiáng)，各分離株的致病性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株均為多重耐藥菌株，其中79.2%（19/24）的菌株耐10種以上藥物，由此可見，目前水禽大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重，這可能與其血清型復(fù)雜、不合理使用抗菌藥物有關(guān)[21]。APEC分離株對(duì)恩諾沙星、強(qiáng)力霉素兩種藥物的耐藥率為100%，出現(xiàn)對(duì)同種藥物耐藥的現(xiàn)象，可能與江蘇地區(qū)各養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥習(xí)慣有關(guān)，這些藥物可能長(zhǎng)期用于水禽大腸桿菌病的防控，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。Dou等[22]研究表明，在中國(guó)東部分離的243株APEC中，對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株占98%。本研究24株分離菌株中對(duì)四環(huán)素耐藥的占91.7%，耐藥率較高，與該研究結(jié)果一致。胡紫萌等[23]研究結(jié)果表明，分離的APEC對(duì)四環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率分別為100%、86%、70%、36%，鐘舒紅等[24]研究報(bào)道，在廣西分離的禽源致病性大腸桿菌中，對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素的耐藥率分別為47.8%、22.8%、26.5%，與本文研究結(jié)果均有所差異，這可能跟分離株的時(shí)空分布、各地的用藥習(xí)慣不同有關(guān)。由本研究結(jié)果可以看出，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的水禽大腸桿菌分離菌株均有不同程度的多重耐藥現(xiàn)象，因此科學(xué)、合理、精準(zhǔn)的使用抗菌藥物對(duì)有效控制水禽大腸桿菌病的發(fā)生、減抗限抗的推廣都具有重要意義。

本研究通過對(duì)江蘇省部分規(guī)?；蒺B(yǎng)殖場(chǎng)分離的24株水禽腸道外致病性大腸桿菌進(jìn)行O抗原血清型測(cè)定、毒力基因及系統(tǒng)進(jìn)化分群檢測(cè)及耐藥性研究，為水禽致病性大腸桿菌致病機(jī)理及防控提供參考，同時(shí)為后續(xù)對(duì)禽大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。