陳金霞，張 寬，張玉嬌，杜楠楠，鄭海紅，李麗薇,2，周艷君,2，虞凌雪,2，童 武,2，鄭 浩,2，童光志,2，高 飛,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），俗稱為“藍(lán)耳病”，是一種能夠引起母豬繁殖功能和仔豬呼吸功能障礙的嚴(yán)重接觸性傳染病。自1996年在我國(guó)暴發(fā)后，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，同屬病毒還有馬動(dòng)脈炎病毒（Equine arteritis virus,EAV）。PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約15 kb，具有5'帽狀結(jié)構(gòu)和3' poly（A）尾結(jié)構(gòu)，基因組兩端具有5'非翻譯區(qū)（5'-untranslated region，5'UTR）和3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'UTR）[1-2]。同大多數(shù)的套式病毒一樣，基因組以非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄的方式合成亞基因組（subgenomic mRNA,sg mRNA）[3-4]，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5a、GP5、GPM和N[1-2]。在非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄機(jī)制中，基因組中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcription-regulating sequences,TRS）發(fā)揮重要的作用，據(jù)研究證明，在合成負(fù)鏈的body TRS的時(shí)候，其與基因組上的正鏈leader TRS相結(jié)合，如同接受到一個(gè)信號(hào)，發(fā)生Leader-Body junction[5]。負(fù)鏈的body TRS轉(zhuǎn)而去結(jié)合正鏈的leader TRS，然后繼續(xù)延伸負(fù)鏈的leader序列，這就產(chǎn)生了負(fù)鏈的亞基因組mRNA。再以負(fù)鏈亞基因組mRNA為模板，產(chǎn)生一系列正鏈的亞基因組mRNA，用以翻譯結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]。在此過程中，負(fù)鏈的body TRS和正鏈的leader TRS的一級(jí)核心寡核苷酸序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)至關(guān)重要。有研究證明，PRRSV的ORF1b和ORF2之間，是非常有效的外源基因插入位點(diǎn)，在該位點(diǎn)，將CSFV囊膜蛋白（E2）蛋白的編碼基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6 cassette插入該位點(diǎn)，經(jīng)過鑒定驗(yàn)證，該重組突變病毒能夠正常表達(dá)PRRSV核衣殼蛋白（nucleocapsid protein,N）和CSFV E2蛋白并穩(wěn)定遺傳[8]。在此基礎(chǔ)上，該研究，基于rPRRSV-E2的感染性克隆，在ORF7與3'UTR之間插入表達(dá)綠色熒光蛋白的編碼基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP），并對(duì)拯救出的重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP進(jìn)行驗(yàn)證，為開發(fā)PRRSV作為活載體疫苗提供了一個(gè)新的構(gòu)建策略和新的插入位點(diǎn)，并為今后研發(fā)多價(jià)疫苗奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與病毒 非洲綠猴腎細(xì)胞（MARC-145）和乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）由本實(shí)驗(yàn)室保存。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征HuN4細(xì)胞傳代致弱株pHuN4-F112，表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組PRRSV：rPRRSV-E2的全長(zhǎng)感染性克隆prPRRSV-E2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司公司；化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C試劑、突變PCR用高保真聚合酶為pfuⅡDNA Polymerase、OPTI-MEM、熒光二抗Alexa Fluor 488/568-labeled goat anti-mouse IgG（H+L）購(gòu)自Agilent公司；PRRSV的N蛋白的單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV E2蛋白的單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 在prPRRSV-E2全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上，通過SOE-PCR的方法，利用MluⅠ和SwaⅠ限制性酶切位點(diǎn)在ORF7和3'UTR之間插入由TRS6 cassette引導(dǎo)的EGFP基因，構(gòu)建rPRRSV-E2-EGFP重組全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒pA-E2-EGFP。利用QIAprep Spin Miniprep試劑盒提取突變體質(zhì)粒。本文中所用到的引物見表1，構(gòu)建方法示意圖見圖1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Oligonucleotides of primers used in this study

圖1 重組突變?nèi)L(zhǎng)克隆pA-E2-EGFP的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representative for the construction of the full-length cDNA clone pA-E2-EGFP with recombinant mutant

1.4 病毒拯救和傳代 利用SwaⅠ酶將全長(zhǎng)突變質(zhì)粒線性化（圖2C），然后用QIAquick PCR Purification試劑盒純化回收線性化的全長(zhǎng)感染性克隆。以純化后的線性化質(zhì)粒為模板，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到pA-E2-EGFP的RNA（圖2D），以等量的轉(zhuǎn)染試劑DMRIE-C混合大約1 mL OPTI-MEM轉(zhuǎn)染至細(xì)胞密度大概為60%的BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后傳代于細(xì)胞密度80%的MARC-145細(xì)胞[9]，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect,CPE），直至觀察到細(xì)胞病變達(dá)到80%左右，收取病毒上清液，標(biāo)記為P1，保存于-80℃。將P1病毒上清液按照1∶1000稀釋，并接于新鮮的MARC-145細(xì)胞，細(xì)胞病變達(dá)到80%，收取上清液，標(biāo)記為P2并保存于-80℃，以同樣的方法將病毒傳代至P5、P6。

圖2 重組突變?nèi)L(zhǎng)克隆pA-E2-EGFP的構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant mutant full-length clone pA-E2-EGFP

1.5 間接免疫熒光 將P3代病毒感染MARC-145細(xì)胞48 h后，棄去維持液培養(yǎng)基。冰甲醇固定10 min，1%BSA室溫封閉30 min，用1∶600倍比稀釋的PRRSV N蛋白的特異性單克隆抗體（SR30A,rural technology,LTD），1∶1000倍比稀釋的CSFV E2蛋白的特異性單克隆抗體，1∶1000倍比稀釋EGFP特異性抗體，37℃孵育2 h，再分別加入Alexa Fluor 488/568 -labeled羊抗鼠的熒光二抗（1∶800倍比稀釋），37℃孵育1 h，PBS洗5遍后，倒置熒光顯微鏡觀察[10-11]。

1.6 Western blot鑒定 將P3代病毒以0.01 MOI接種于6孔板中的MARC-145細(xì)胞，病毒感染36 h后收集細(xì)胞中的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，用金斯瑞快速轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)印好的膜放入5%脫脂乳中封閉2 h后，用TBST清洗細(xì)胞3遍，每次10 min。加入一抗，室溫孵育2 h，用TBST洗滌3遍，每次10 min，再加入1∶6000稀釋的二抗，室溫振蕩孵育60 min后，用TBST洗3遍，每次10 min。用ECL發(fā)光液A液和B液按1∶1比例混合顯色[10-11]，用Tanon-5200自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

1.7 一步生長(zhǎng)曲線繪制 將P3代重組病毒以1 MOI接種于T25培養(yǎng)瓶中的MARC-145細(xì)胞（細(xì)胞個(gè)數(shù)約為2.5×105個(gè)），37℃孵育1 h后，棄去上清液，加入5 mL 2%FBS的MEM培養(yǎng)基，每隔2 h收取200 μL細(xì)胞上清液的同時(shí)補(bǔ)加200 μL 2%FBS MEM培養(yǎng)基，持續(xù)收取至接毒后24 h。測(cè)定收取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度（TCID50），用GraphPad軟件繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線。

1.8 空斑形態(tài)學(xué)分析 將P3代拯救病毒用DMEM系列稀釋后，取300 μL感染6孔板中的MARC-145細(xì)胞，37℃孵育1 h后，棄掉病毒液，加入等比例的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2×MEM，再加入4%FBS（5 mL/孔）于6孔細(xì)胞板中。室溫凝固后，于37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4～5 d，待出現(xiàn)空斑后，在孔中加入2 mL 4%的甲醛溶液固定后甩掉凝膠，用5%結(jié)晶紫溶液染色。

2 結(jié)果

2.1 重組全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建和病毒的拯救 基于表達(dá)CSFV E2蛋白的高致病性PRRSV的傳代致弱株rPRRSV-E2的全長(zhǎng)感染性克隆平臺(tái)，在ORF7和3'UTR之間插入由TRS6 cassette引導(dǎo)的綠色熒光蛋白編碼基因與PRRSV相應(yīng)基因組嵌合的片段1595 bp，然后將該片段與rPRRSV-E2的感染性克隆分別用MluⅠ和SwaⅠ進(jìn)行雙酶切，將目的條帶與載體相連接，構(gòu)建新的重組嵌合感染性克隆質(zhì)粒pA-E2-EGFP（圖1）。將構(gòu)建的全長(zhǎng)感染性克隆用MluⅠ和SwaⅠ進(jìn)行雙酶切，可以看到pA-E2-EGFP出現(xiàn)大小為1500 bp的條帶，說明表達(dá)綠色熒光蛋白的編碼外源基因成功插入（圖2）。將構(gòu)建成功的重組突變體克隆pA-E2-EGFP進(jìn)行線性化，并在驗(yàn)證后做體外轉(zhuǎn)錄。體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染并傳代于MARC-145細(xì)胞，拯救出的病毒命名為rPRRSVE2-EGFP（圖3）。

圖3 重組突變?nèi)L(zhǎng)克隆pA-E2-EGFP的拯救Fig.3 Rescue of the full-length cDNA clone pA-E2-EGFP

2.2 重組突變病毒與親本病毒蛋白表達(dá)水平的比較 為了比較重組突變病毒與親本病毒的蛋白表達(dá)水平，將親本病毒HuN4-F112和rPRRSV-E2以及重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP以0.01 MOI接于新鮮的MARC-145細(xì)胞，做間接免疫熒光檢測(cè)PRRSV核衣殼蛋白（nucleocapsid protein,N）和CSFV囊膜蛋白（E2）是否表達(dá)，直接熒光觀察重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP中EGFP外源蛋白的表達(dá)。由結(jié)果可知，重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP能夠正常地表達(dá)PRRSV N蛋白，CSFV E2蛋白以及所插入的外源EGFP編碼蛋白，并且相同蛋白的表達(dá)水平相當(dāng)（圖4），說明重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP和親本病毒HuN4-F112，rPRRSV-E2具有相似的復(fù)制轉(zhuǎn)錄能力。

圖4 間接免疫熒光分析rPRRSV-E2-EGFP重組突變病毒感染MARC-145細(xì)胞后的蛋白表達(dá)Fig.4 IFA of protein expression of rPRRSV-E2-EGFP recombinant mutant virus infected MARC-145 cells

用Western blot檢測(cè)驗(yàn)證病毒感染細(xì)胞后表達(dá)相關(guān)蛋白的水平，結(jié)果可知，重組突變病毒rPRRSVE2-EGFP能夠正常表達(dá)基因組中插入的外源基因，并且與親本病毒相比表達(dá)蛋白量差異不顯著（圖5）。

圖5 重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP感染MARC-145細(xì)胞后進(jìn)行Western blot鑒定蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot analysis of protein expression of recombinant mutant virus rPRRSV-E2-EGFP infected MARC-145 cells

2.3 重組病毒與親本病毒的病毒生物學(xué)特性水平分析對(duì)重組突變病毒rPRRSV-E2-EGFP和親本病毒進(jìn)行空斑形態(tài)學(xué)比較分析（圖6），結(jié)果表明，重組突變病毒在空斑形態(tài)、數(shù)目上與親本病毒無顯著差異。一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，重組突變病毒rPRRSVE2-EGFP與親本病毒HuN4-F112、rPRRSV-E2均無明顯差異，在4～8 h均會(huì)出現(xiàn)毒價(jià)降低的現(xiàn)象，16～22 h均處于平臺(tái)期，病毒含量未出現(xiàn)明顯波動(dòng)（圖7）。

圖6 重組突變病毒與親本病毒空斑形態(tài)學(xué)比較Fig.6 Plaque morphology comparison for the mutant virus and parental virus

圖7 重組突變病毒與親本病毒的一步生長(zhǎng)曲線Fig.7 One-step growth curve for the mutant virus and parental virus

3 討論

反向遺傳技術(shù)的成熟使我們對(duì)RNA病毒基因組的操作變得較為簡(jiǎn)便。作為套式病毒目成員，動(dòng)脈炎病毒與冠狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)相比，其基因組RNA更加的緊湊和精簡(jiǎn)，基因組中有很多重疊區(qū)（overlap）。將外源基因插入動(dòng)脈炎病毒基因組中，形成穩(wěn)定的重組嵌合病毒，難度較大。

2000年，Groot等[12]將編碼流感病毒HA蛋白的9個(gè)氨基酸表位的一段短序列插入PRRSV基因組ORF7基因的兩端，HA標(biāo)簽和N蛋白的融合蛋白在重組病毒中成功表達(dá)，但是病毒增殖被阻滯，并且在病毒的后續(xù)傳代過程中，HA標(biāo)簽逐漸丟失，直至完全缺失。de Vries等[13]對(duì)EAV表達(dá)外源序列進(jìn)行了研究，在拉開了重疊序列ORF5和ORF6之后，插入帶有EAV特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的GFP，轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后能夠獲得病毒，但是在連續(xù)傳代之后，GFP基因開始出現(xiàn)逐步的缺失。2010年，Zheng等[14]分別在pAPRRS的ORF1和ORF2之間，ORF5和ORF6之間，ORF6和ORF7之間插入PCV2的ORF2基因，發(fā)現(xiàn)了由于人為引入基因組中的類TRS序列導(dǎo)致PRRSV TRS cassette及其側(cè)翼序列的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而進(jìn)一步導(dǎo)致了重組病毒的遺傳不穩(wěn)定性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了PRRSV基因組可以利用外源類TRS序列作為啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

以上結(jié)果表明動(dòng)脈炎病毒基因組存在不穩(wěn)定性，單純的插入外源基因融合表達(dá)的策略并不可行，重組病毒可能增殖能力下降，甚至完全無法拯救病毒。另外，外源基因插入位點(diǎn)的選擇也非常重要。

2009年，Pei等[15]選擇PRRSV基因組ORF1b和ORF2作為外源序列插入位點(diǎn)，插入了EGFP基因，并使EGFP位于TRS的調(diào)控之下，作為新的sgmRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，構(gòu)建的重組病毒能夠至少在體外穩(wěn)定傳代37次。本團(tuán)隊(duì)前期研究中構(gòu)建的rPRRSV-E2至少能夠在連續(xù)20次的細(xì)胞傳代過程中保持遺傳穩(wěn)定，在體內(nèi)體外穩(wěn)定表達(dá)CSFV的E2基因[16]。由此可見，ORF1b和ORF2之間是PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白基因和結(jié)構(gòu)蛋白之間的間隙，選擇該基因間區(qū)，并將外源基因作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄本在TRS的調(diào)控之下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)的策略對(duì)于保持重組病毒的遺傳穩(wěn)定性有重要意義。

ORF7和3'UTR之間是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與非翻譯區(qū)分界。2017年，Wang等[17]利用反向遺傳技術(shù)針對(duì)不同的TRS cassette引導(dǎo)EGFP在ORF7和3'UTR之間的表達(dá)進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)TRS6 cassette引導(dǎo)外源基因的表達(dá)效率十分有效。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，也通過充分的實(shí)驗(yàn)研究證明了在ORF1b和ORF2之間，TRS6 cassette對(duì)于外源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率最高。2010年，Sun等[18]將基因1型PRRSV毒株3'UTR替換PRRSV2型基因毒株中，嵌合cDNA克隆，仍然可以成功拯救出嵌合病毒，該實(shí)驗(yàn)也證明了雖然PRRSV 1型和2型毒株的3'UTR一級(jí)核苷酸序列差異大，但其高級(jí)結(jié)構(gòu)具有相似的功能，并且2型PRRSV的N蛋白C端4個(gè)氨基酸活性不會(huì)受到影響[19]。以上一系列針對(duì)PRRSV作為活病毒載體在不同基因調(diào)控位點(diǎn)的研究，啟發(fā)我們利用本實(shí)驗(yàn)室已有的rPRRSV-E2的感染性克隆，嘗試同時(shí)在其基因組ORF7和3'UTR之間插入了由轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率最高的TRS6 cassette引導(dǎo)的EGFP基因，成功拯救了該重組突變病毒，并進(jìn)行了該重組突變病毒蛋白翻譯的分析鑒定。我們發(fā)現(xiàn)該病毒與親本病毒相比除了能正常表達(dá)基因組載體PRRSV N蛋白外，也能夠表達(dá)在其基因組兩個(gè)位點(diǎn)中插入的外源基因CSFV E2蛋白和EGFP編碼蛋白。病毒生長(zhǎng)特性與親本病毒分析發(fā)現(xiàn)，該重組突變病毒與親本病毒在生長(zhǎng)特性、病毒空斑形態(tài)數(shù)目上無顯著性差異。這些試驗(yàn)結(jié)果為研究PRRSV作為表達(dá)外源基因的活病毒載體提供了構(gòu)建思路，也為以后研究多價(jià)疫苗奠定了一定的理論基礎(chǔ)。