王 娜，紀立凱，王 建，嚴亞賢

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240；2.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 200240）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起不同年齡段豬嚴重腹瀉病的主要病毒性病原體，感染豬以嘔吐、水樣腹瀉和食欲下降為主要病癥，具有發(fā)病急、傳播快、仔豬致死率高等特點[1-3]。我國最早于1984年發(fā)現(xiàn)PEDV在豬場中存在，隨后暴發(fā)的豬腹瀉病疫情中，PEDV均呈現(xiàn)出較高的陽性[4]。為防控PEDV的傳播，PEDV疫苗被廣泛使用并取得了較好的效果。2010年以來我國再次暴發(fā)豬流行性腹瀉病，并呈現(xiàn)出不斷擴散的流行趨勢，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[5-6]。病原學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PEDV基因組發(fā)生了突變，導(dǎo)致高致病性變異毒株出現(xiàn)，且存在地區(qū)間差異性，強毒株的出現(xiàn)降低了早期疫苗的保護效果，使得防控難度越來越大，嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[7]。基于目前對PEDV基因遺傳變異研究，PEDV可分為G1和G2兩個基因型。G1群是以CV777株為主的PEDV經(jīng)典毒株，并可分為經(jīng)典野毒株G1-a亞群和經(jīng)典弱毒株G1-b亞群。G2群為近年的流行毒株，分為變異毒株G2-a亞群和重組毒株G2-b亞群。不同基因型在致病性、毒力以及交叉保護等方面存在差異[8-9]。因此，掌握我國各地區(qū)當(dāng)前流行毒株變異情況，制備特異性疫苗成為防控PEDV持續(xù)傳播的關(guān)鍵[10]。

本研究從2019年上海地區(qū)豬臨床腹瀉樣品中成功分離了1株P(guān)EDV毒株，基于MEGA 7.0、BLAST等軟件對該分離株與國內(nèi)外流行毒株進行同源性比對和遺傳進化分析該毒株的遺傳變異情況，將為了解該地區(qū)流行毒株的變異趨勢，制備高效疫苗和制定防控策略提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬腹瀉樣品與細胞株 2019年2月采集自上海地區(qū)的臨床豬腹瀉PEDV陽性樣品（糞便或小腸內(nèi)容物），由本實驗室置于-80℃凍存；非洲綠猴腎細胞系（Vero E6細胞）購自ATCC，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Gibco高糖DMEM培養(yǎng)基、Gibco 0.25%胰酶、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Sigma公司；Primer STARTM聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；凝膠回收試劑盒與無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；Alexa Fluor488標記山羊抗鼠熒光抗體、細胞核染料DAPI、免疫染色通透液（Triton X-100）、4%多聚甲醛均購自上海碧云天生物科技有限公司；抗PEDV S蛋白單克隆抗體由本實驗室制備和保存。

1.3 病毒的分離及TCID50測定 將PEDV陽性的糞便和小腸內(nèi)容物分別經(jīng)無菌化處理后，接種至單層生長的Vero E6細胞，維持培養(yǎng)基含10 μg/mL胰酶，盲傳3代后，將病毒液再次接種到Vero E6細胞，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞病變。收集病變明顯的細胞樣品反復(fù)凍融3次后，1500 ×g離心15 min，收集上清液，繼續(xù)接種于Vero E6細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)。取擴增培養(yǎng)的PEDV上海分離株，利用含10 μg/mL胰酶的維持培養(yǎng)基將病毒按照10倍倍比稀釋至10-11，每個稀釋度設(shè)置8孔重復(fù)，以未感染的Vero E6細胞作為對照組，連續(xù)觀察72 h，記錄每個稀釋度的病變孔數(shù)，利用Karber法計算病毒的TCID50。根據(jù)病毒的TCID50和細胞的計數(shù)，按照如下公式：MOI=（0.7×TCID50×V）/N（V：病毒體積，N：細胞數(shù)）計算獲得病毒的MOI。

1.4 間接免疫熒光試驗 (indirect immunoinfluscent assay,IFA) 將Vero E6細胞傳代到12孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至單層，感染待檢病毒24 h左右，在顯微鏡下觀察細胞有明顯的多合胞體病變現(xiàn)象且細胞未脫落，使用PBS輕柔清洗細胞板兩遍，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS輕柔清洗兩遍，使用免疫染色通透液（Triton X-100）通透10 min，PBS輕柔清洗兩遍，使用1%胎牛血清進行室溫封閉1 h，抗PEDV S蛋白單克隆抗體4℃孵育過夜后使用PBS清洗4～5遍，常溫孵育Alexa Fluor488標記山羊抗鼠熒光抗體2 h，使用PBS清洗4～5遍，DAPI染色2 min，棄掉染液加PBS在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。

1.5 電鏡觀察 將感染PEDV的Vero E6細胞培養(yǎng)板反復(fù)凍融3次后收集細胞上清液，4℃、3000 ×g離心30 min，去除細胞碎片，收集上清液4℃，150 000 ×g冷凍超速離心3 h，離心完成后用ddH2O重懸沉淀，用磷酸鎢負染后在120 kV透射電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.6 全基因組測序及分析 以分離毒株的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑制備cDNA，根據(jù)GenBank上發(fā)表的PEDV的基因序列，分別設(shè)計了15對特異性PEDV引物序列（表1），對分離毒株進行全基因組分段擴增，將擴增得到的DNA產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進行純化，純化產(chǎn)物連接pTOPO載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，PCR鑒定為陽性的菌液送北京六合華大基因科技有限公司上海分公司進行測序。

表1 擴增PEDV全基因組引物序列Table 1 The primers sequence of the whole PEDV genome

1.7 病毒的進化與變異分析 基于NCBI國內(nèi)外PEDV流行毒株的基因組參考序列，利用Clustal Omega對全基因組核苷酸序列或S基因序列進行多序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹?；赟蛋白的多序列比對結(jié)果分析上海分離株的突變位點。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng)與電鏡觀察 在長滿單層的Vero E6細胞接種適量的病毒液感染一段時間后，在顯微鏡下觀察，與未感染細胞比較，感染細胞可見明顯的多合胞體病變現(xiàn)象，隨著感染時間的增加，細胞脫落死亡。利用Karber法測定擴增后的病毒TCID50為10-6.25/0.1 mL。將病毒液經(jīng)超速離心后，利用磷酸鎢負染后，在120 kV透射電鏡下觀察，具有典型的冠狀病毒粒子形態(tài)，直徑為95～190 nm（平均130 nm）的病毒粒子（圖1D）。以上結(jié)果表明該分離毒株為一種冠狀病毒。

圖1 PEDV/CHSH/2019株接種Vero E6細胞后產(chǎn)生的細胞病變及電鏡觀察結(jié)果Fig.1 The CPE of the PEDV/CHSH/2019 strain on Vero E6 cells and electron micrograph

2.2 IFA鑒定PEDV上海分離株結(jié)果 將分離的病毒分別按照MOI=0.05、MOI=0.1、MOI=1接種于Vero E6細胞，感染24 h后，利用間接免疫熒光方法檢測PEDV S蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，未感染組細胞未見明顯的細胞病變和熒光信號；隨著感染劑量的增加，熒光信號增強，明場下觀察到細胞融合形成的多核包體更加明顯（圖2）。進一步證實了該分離毒株為PEDV，并將其命名為PEDV/CHSH/2019株。

圖2 PEDV/CHSH/2019株的間接免疫熒光檢測Fig.2 Immunofluorescence assay of PEDV/CHSH/2019 isolate strain

2.3 PEDV/CHSH/2019株的全基因組測序及注釋 本研究參考PEDV CHN/SH-2012毒株基因組序列，合成15對特異性引物對分離毒株進行全基因組分段擴增（圖3）。將獲得的片段經(jīng)第二代測序后進行拼接，獲得了PEDV/CHSH/2019毒株基因組全長為28 038 bp。如表2所示，完成了該毒株的全基因組注釋，依次包含5'UTR-ORF1a/ORF1b-S-ORF3-E-MN-3'UTR。

圖3 PEDV/CHSH/2019各片段的RT-PCR擴增結(jié)果Fig.3 Amplification of all fragments of PEDV/CHSH/20191 by RT-PCR

2.4 基于PEDV/CHSH/2019全基因組及S基因的系統(tǒng)進化分析 參考國內(nèi)外共34株P(guān)EDV毒株的基因組序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于全基因組序列的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示：PEDV/CHSH/2019位于中國近年來流行毒株分屬一支，屬于G2-b亞群，與該亞群參考毒株的同源性為97.71%～99.96%，其中與2012年上海地區(qū)的鑒定毒株CHN/SH-2012同源性為99.56%，而與CV777等經(jīng)典毒株所屬的G1群存在顯著的分支差異（圖4）。進一步基于不同毒株S基因序列，利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示與全基因組進化分類具有一致性（圖5）。以上結(jié)果表明，PEDV/CHSH/2019毒株與近年來國內(nèi)外流行的PEDV強毒株親緣關(guān)系較近，與早期經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠，是1株P(guān)EDV流行性強毒株。

圖4 PEDV/CHSH/2019株全基因組序列系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the complete genome sequences of PEDV/CHSH/2019 strain

圖5 PEDV/CHSH/2019株 S基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of the S gene sequences of PEDV/CHSH/2019 strain

2.5 PEDV/CHSH/2019 S蛋白的突變分析 PEDV S蛋白分為S1和S2兩個亞基，其中S1位于病毒衣殼外側(cè)，包含了病毒的主要抗原特征。因此，本研究對PEDV/CHSH/2019毒株S1亞基的氨基酸序列進行分析，結(jié)果顯示：PEDV/CHSH/2019的S1蛋白與近年來中國、美國、韓國分離的變異毒株親緣關(guān)系較近，S1氨基酸序列一致性較高，其中與中國地區(qū)目前流行株之間的同源性為97.82%～99.59%，與韓國、美國的流行毒株的同源性為98.77%～99.05%?；谕葱蛄斜葘Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，PEDV/CHSH/2019與較早時期的GDS30-China-2014存在多位點的氨基酸插入（第58～61位、第139位）和缺失（第161～162位）；而與上海地區(qū)2012年流行性強毒株CHN/SH-2012相比，僅在第610位氨基酸發(fā)生了單點突變現(xiàn)象，且該位點突變后與其它地區(qū)流行的強毒株保持一致（表3）。這些變異毒株與經(jīng)典疫苗株的S1氨基酸序列已有差異較大，親緣關(guān)系較遠，與CV777、DR13、LZC、CH/S等經(jīng)典毒株的序列一致性較低為89.56%～92.58%，存在顯著的插入、缺失以及單位點的氨基酸突變等變異（表3）。以上結(jié)果表明2019年上海地區(qū)PEDV流行毒株S蛋白發(fā)生了一定的突變，且與其他地區(qū)流行性強毒株序列趨于一致。

表3 S1亞基氨基酸突變位點分析Table 3 Alignment of amino acid sequences of S1 genes

3 討論

PEDV是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病原體，近年來PEDV已在我國很多省份廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)乃至全球公共衛(wèi)生事業(yè)造成巨大的損害和威脅[11-12]。本研究成功分離獲得了上海地區(qū)最新的流行毒株P(guān)EDV/CHSH/2019，感染Vero E6細胞可引起明顯的多合胞體樣細胞病變，且能夠被PEDV S蛋白的特異性單克隆抗體所識別，病毒效價較高可達10-6.25TCID50/0.1 mL。上海地區(qū)最新PEDV流行毒株的體外成功分離，為探究PEDV在該地區(qū)的毒株特征，制備特異性弱毒或滅活疫苗提供的材料基礎(chǔ)。

基于全基因組多序列比對分析得出PEDV/CHSH/2019株屬于G2-b基因型，與近年來國內(nèi)流行的PEDV毒株親緣關(guān)系較近，與PEDV國外流行毒株和經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠。該結(jié)果表明上海地區(qū)PEDV毒株可能源于其附近地區(qū)之間的交互傳播。PEDV/CHSH/2019株與經(jīng)典PEDV毒株進化上已有較大距離，表明其發(fā)生了較大的基因組變異，也是臨床豬場中使用的常用疫苗保護效果不佳的原因。因此，應(yīng)該根據(jù)上海地區(qū)流行毒株的特征選擇進化關(guān)系最近的疫苗毒株實施免疫保護豬群。此外，由于PEDV傳播途徑多樣，且與其他致豬腹瀉病病毒（如傳染性胃腸炎病毒和豬丁型冠狀病毒）混合感染情況嚴重，增加了防控難度。因此，各豬場應(yīng)嚴格執(zhí)行生物安全防控措施，加強我國各地區(qū)之間生豬流通的防疫、檢測，切斷病毒傳播途徑。

冠狀病毒S蛋白是識別宿主細胞受體蛋白的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它的變異往往與病毒毒力的改變密切相關(guān)[13-15]。PEDV S蛋白由S1和S2兩個亞基組成，研究發(fā)現(xiàn)S1較S2更容易發(fā)生突變[16]。對PEDV/CHSH/2019株 S1蛋白的多序列比對分析顯示S1蛋白與近年來中國、美國、韓國分離的變異毒株親緣關(guān)系較近，而這些變異毒株與經(jīng)典疫苗株的S1氨基酸序列已有差異較大，存在多處氨基酸突變和缺失（表3），這些突變和缺失可能會影響S蛋白的構(gòu)象，以及病毒對宿主的致病作用，影響疫苗效果或引起免疫逃避，造成免疫失敗，使得PEDV的防控難度不斷加大。綜上對上海地區(qū)最新流行毒株全基因組及S基因的變異分析，將有助于了解PEDV在該地區(qū)的遺傳變異趨勢，為特異性疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。