何勤,任婷婷,羅青,徐棟花,陳朋,曹哲,王國穎,王振華

雄激素性脫發(fā)是一種表現(xiàn)為進行性脫發(fā)的慢性疾病,其特點是毛囊微型化,生長初期的毛囊減少,靜止期毛囊的數(shù)量增加[1]。常用的非那雄胺被批準用于男性,而外用米諾地爾被批準用于男性和女性[2]。這兩種藥物需要長期使用,且并非每個人都有顯著的療效,可能還會出現(xiàn)某些副作用。因此有必要進一步研究治療雄激素性脫發(fā)的新方法[2]。

濃縮生長因子(concentrated growth factor,CGF)是從自體血提取出來的富含血小板和多種生長因子的新型血液制品,經(jīng)反復(fù)改變離心速度制備,通過激活血小板α顆粒,釋放大量的生長因子,促進傷口愈合和組織再生[3]。近年來其應(yīng)用于臨床治療脫發(fā)取得了一定的效果,其作用機制仍有待研究。毫火針是將針置于酒精燈火焰上燒紅后快速刺入人體一定穴位和部位的方法,毫火針改良了傳統(tǒng)火針針頭粗的缺點,減少疼痛及減輕瘢痕形成。已有少量基礎(chǔ)研究表明毫火針可通過激活β-catenin信號促進動物的毛發(fā)生長[4]。臨床上通過比較CGF聯(lián)合毫火針治療組和單一CGF治療對照組治療前后雄激素性脫發(fā)患者的臨床照片、皮膚鏡下的毛發(fā)檢測指標和總有效率,得出CGF聯(lián)合毫火針治療雄激素性脫發(fā)對毛發(fā)的生長更有效,但未對CGF聯(lián)合毫火針治療雄激素性脫發(fā)的作用機制進行進一步探索研究。本研究通過建立雄激素性脫發(fā)小鼠動物模型,觀察CGF聯(lián)合毫火針治療雄性小黑鼠(C57 black 6,C57BL/6)的治療效果,探索其作用機制,為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會批準(倫理編號:KYLL20210318-1)。

1 材料與方法

1.1動物 C57BL/6(雄性,6周齡)小鼠,18～22 g,購于山東省濟南朋悅動物繁育有限公司,實驗動物許可證號:SCXK(魯)20190003。飼養(yǎng)于濰坊市人民醫(yī)院中心實驗室,所有小鼠在溫度、濕度和光線適宜環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模,實驗期間小鼠自由進食、飲水和活動。

1.2主要試劑及儀器 BCA 蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司);GAPDH、β-catenin 、GSK-3β一抗、HRP標記的山羊抗兔二抗(proteintech 公司);Wnt10b一抗(affinity公司);蘇木精-伊紅染液、睪酮、Mayer’蘇木素染液、分化液G1862 、返藍液G1866 、5X蛋白上樣緩沖液 、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(1X)(solarbio公司);5%米諾地爾(浙江萬晟藥業(yè)有限公司);兔二步法檢測試劑盒(PV-9001)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光底物(特超敏)、脫脂奶粉(bioshap公司);0.30 mm × 25 mm 毫火針(濰坊市人民醫(yī)院皮膚科提供);蛋白垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad);普通光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司);生物組織攤片烤片機(湖北伯納醫(yī)療科技有限公司)。

1.3CGF的制備 采集人的靜脈血24～36 mL,經(jīng)KJLC-I Centrifuge變速離心機離心約12 min,離心結(jié)束后試管內(nèi)血樣分層:最下層為呈紅色的紅細胞層,中間層為呈橙黃色的CGF纖維蛋白層,最上層為淡黃色血清層,在無菌超凈臺中進行分離中間層,每8 mL靜脈血保留中間層2 mL CGF。

1.4小鼠雄激素性脫發(fā)模型建立與實驗分組 將36只C57BL/6雄性小鼠采用隨機數(shù)法隨機分為6組,每組6只,分別為模型組、空白組、米諾地爾組、CGF組、CGF+毫火針組、毫火針組。造模開始的前1 d,先用寵物剃毛器在小鼠背部以背脊線為中線,剃出一塊2 cm×2 cm的區(qū)域,均勻涂上脫毛膏,3 min后用溫水將脫毛膏洗去。自實驗動物脫毛24 h后開始給藥。具體給藥方式如下:除空白組小鼠不給藥,其余各組小鼠從脫毛后第1天起,每天在脫毛區(qū)域以10 mg/kg的劑量涂抹0.2%(W/V)睪酮乙醇溶液(其中睪酮溶于50%乙醇溶液),直至第28天,建立小鼠雄激素性脫發(fā)模型。并于脫毛后第1天起,CGF組于脫毛區(qū)域給予注射CGF 0.1 mL,每3 d注射1次,直至第28天。米諾地爾組每天在脫毛區(qū)域以250 mg/kg的劑量涂抹5%米諾地爾溶液,直至第28天。CGF+毫火針組在脫毛區(qū)域每3 d注射1次CGF加毫火針針刺1次,直至第28天。毫火針組在脫毛區(qū)域每3 d針刺1次,火針針刺點平均間距為1.5 mm, 深度至真皮淺層,直至第28天。

1.5肉眼評估 實驗過程中密切觀察實驗動物背部皮膚顏色變化及毛發(fā)生長情況,并于第7、14、21、28天進行拍照記錄,對比不同治療組的作用效果。

1.6蘇木精-伊紅染色 首先制作皮膚石蠟切片,于給藥第28天后,將各組小鼠處死,使用脫毛膏脫毛,用無菌組織剪剪取各組小鼠脫毛區(qū)皮膚組織。將皮膚組織用生理鹽水漂洗2次后,置于裝有4%多聚甲醛的離心管里,固定24 h以上。經(jīng)脫水、透明、透蠟、浸蠟包埋、切片、烤片、脫蠟復(fù)水等一系列操作后,進行HE染色。蘇木素染液染色2 min。自來水沖洗2 min。返藍3 s,自來水沖洗2 min,蒸餾水2 min,伊紅3 min,經(jīng)梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。觀察比較毛囊數(shù)量及分辨毛囊。

1.7免疫組織化學(xué) 組織切片制作參考蘇木精-伊紅染色。然后經(jīng)烤片,脫水和水化,抗原修復(fù),滴加一抗β-catenin (1∶2 000)、GSK-3β(1∶200)、Wnt10b(1∶200),滴加二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片后,光學(xué)顯微鏡下進行結(jié)果判讀。陰性對照用 PBS 代替一抗,其余操作同前。切片在顯微鏡下隨機選取小鼠皮膚組織不重復(fù)的6個視野拍照。使用Image J 圖像軟件對采集的圖像進行一系列分析,得到反映目標物質(zhì)的單位面積濃度的平均光密度值(average optical density, AOD),并對各組AOD值進行分析比較。

1.8Western blot檢測 以上6組實驗小鼠皮膚組織取材,收集總蛋白,進行 10% SDS-PAGE 電泳(80 V, 30 min; 120 V, 60 min),濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到 PVDF 膜(200 mA),5% 脫脂奶粉封閉 2 h,一抗 β-catenin(1∶ 10 000)、GSK-3β(1∶1 000)、Wnt10b(1∶1 500),4 ℃ 孵育過夜,次日 TBST 洗 10 min × 3次,辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG( 1∶ 10 000)室溫孵育 1 h。TBST 洗 10 min × 3 次,BIO-RAD曝光儀上曝光。

2 結(jié)果

2.1實驗動物大體情況觀察 造模28 d后,模型組小鼠背部皮膚仍呈粉紅色,未見新生毛發(fā)長出,HE染色結(jié)果顯示,該組毛囊數(shù)量少,毳毛比重大,毛母質(zhì)萎縮,毛乳頭縮小。上述結(jié)果說明,睪酮誘導(dǎo)的雄激素性脫發(fā)小鼠模型基本成功。各組小鼠給予28 d不同的治療后,空白組毛發(fā)生長濃密,烏黑光澤;模型組背部無新生毛發(fā)長出;其余各組背部皮膚治療區(qū)覆蓋率尚可,毛發(fā)生長致密,且CGF+毫火針組及米諾地爾組小鼠毛發(fā)生長致密程度優(yōu)于CGF組和毫火針組,表明4種治療方法均能促進毛發(fā)生長,且CGF+毫火針組聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于CGF組和毫火針組治療(圖1)。

圖1 各組小鼠毛發(fā)生長情況Fig.1 Hair growth of mice in each group

2.2各組小鼠背部皮膚HE染色 在視野范圍內(nèi),模型組毛囊數(shù)量最少;空白組、米諾地爾陽性對照組、CGF+毫火針組毛囊數(shù)量明顯增多,密度大;火針組及CGF組次之。各治療組及空白組毛囊以終毛為主,毛乳頭體積增大,毛母質(zhì)增多,上方出現(xiàn)較多黑色素顆粒。模型組以毳毛為主,毛干色素淺或無,直徑小于內(nèi)毛根鞘。說明本實驗中使用的4種治療方法均能增加小鼠毛囊尤其是終毛毛囊的數(shù)量,促進毛發(fā)生長,且CGF+毫火針組聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于單用CGF或單用毫火針治療效果(圖2)。

Minoxidil group; CGF group; CGF + fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group圖2 治療后各組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚組織病理 (HE×100)Fig.2 Histology of the skin of the dorsal depilated area of mice in each group after treatment (HE×100)

2.3各組小鼠的免疫組織化學(xué)結(jié)果 β-catenin、GSK-3β、Wnt10b陽性表達呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。米諾地爾組、CGF+毫火針組、空白組小鼠皮膚毛囊組織中Wnt10b陽性表達高于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);CGF+毫火針組小鼠皮膚毛囊組織中Wnt10b陽性表達高于CGF組和毫火針組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);米諾地爾組小鼠皮膚毛囊組織中Wnt10b陽性表達高于CGF組和毫火針組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。米諾地爾組、CGF組及CGF+毫火針組小鼠皮膚毛囊組織中β-catenin陽性表達高于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);CGF+毫火針組小鼠皮膚毛囊組織中β-catenin陽性表達高于CGF組、毫火針組、空白組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001);米諾地爾組小鼠皮膚毛囊組織中β-catenin陽性表達高于CGF組、毫火針組、空白組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。毫火針組、模型組小鼠皮膚毛囊組織中GSK-3β陽性表達高于CGF+毫火針組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);空白組小鼠皮膚毛囊組織中GSK-3β陽性表達高于CGF+毫火針組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。米諾地爾組小鼠皮膚毛囊組織中GSK-3β陽性表達低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明CGF+毫火針組可能通過Wnt/β-catenin通路刺激毛發(fā)生長(圖3～5,表1)。

表1 各組小鼠背部脫毛區(qū)皮膚組織中Wnt10b、β-catenin、GSK-3β平均光密度值對比Tab.1 Comparison of average optical density values of Wnt10b, β-catenin and GSK-3β in skin tissues of dorsal hair removal areas of mice in each

Minoxidil group; CGF group; CGF+fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group圖3 各組小鼠的毛囊組織中Wnt10b的表達情況 (×200)Fig.3 Expression of Wnt10b in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

Minoxidil group; CGF group; CGF+fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group圖4 各組小鼠的毛囊組織中β-catenin的表達情況 (×200)Fig.4 Expression of β-catenin in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

Minoxidil group; CGF group; CGF + fire needling group; Fire needling group; Model group; Blank group圖5 各組小鼠的毛囊組織中GSK-3β的表達情況 (×200)Fig.5 Expression of GSK-3β in the hair follicle tissue of each group of mice (×200)

2.4CGF聯(lián)合毫火針激活 Wnt /β-catenin 信號通路 用各處理方法(CGF聯(lián)合毫火針組、毫火針組、CGF組、米諾地爾組、空白組與模型組)得出的Wnt10b蛋白表達含量不同,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.795,P=0.001 1)。在之后的兩兩比較中,Wnt10b蛋白表達在米諾地爾組、CGF+毫火針組、毫火針組高于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。β-catenin蛋白表達在米諾地爾組、CGF組、CGF+毫火針組、空白組高于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),β-catenin蛋白表達在CGF+毫火針組高于毫火針組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GSK-3β蛋白表達在米諾地爾組低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);GSK-3β蛋白表達在CGF+毫火針組低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。GSK-3β蛋白表達在CGF+毫火針組低于CGF組和毫火針組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示,CGF+毫火針可能通過激活 Wnt /β-catenin 信號通路促進毛發(fā)生長,毫火針能增強CGF促進相關(guān)蛋白的表達,改善毛發(fā)生長問題(圖6)。

Note:1 indicated minoxidil group; 2 indicated CGF group; 3 indicated CGF+fire needling group; 4 indicated fire needling group; 5 indicated model group; 6 indicated blank group; compared with the model group, *P<0.05;**P<0.01,***P<0.001; compared with CGF+ fire needling group,#P<0.05.Western blot; Expression of Wnt10b protein; Expression of β-catenin protein;Expression of GSK-3β protein圖6 各組小鼠毛囊組織中Wnt10b、GSK-3β、β-catenin蛋白表達情況Fig.6 Expression of Wnt10b, GSK-3β and β-catenin proteins in hair follicle tissues of mice in each group

3 討論

雄激素性脫發(fā)是一種由雙氫睪酮(DHT)介導(dǎo)的脫發(fā)疾病。雙氫睪酮誘導(dǎo)毛囊小型化,導(dǎo)致終毛轉(zhuǎn)化為毳毛,其作用機制可能與DHT和毛囊上的雄激素受體之間的相互作用抑制了典型的Wnt/β-catenin通路有關(guān)[5]。在小鼠模型中,DHT還顯示通過阻斷生長因子如胰島素樣生長因子1 (IGF-1)的作用來抑制毛發(fā)生長[6]。目前米諾地爾和非那雄胺是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)唯一批準治療脫發(fā)的藥物[7]。但因其副作用以及部分人不敏感等原因,需要更方便、副作用更小、療效更佳的治療方式。CGF是由Sacco 于2006年首次開發(fā)并在臨床應(yīng)用,是利用特制的變速離心機,依靠物理性加速度和減速度充分激活血小板中的α顆粒,產(chǎn)生富含更高濃度生長因子和CD34+細胞的自體血液濃縮制品[8-9]。為了分離提取靜脈血中的細胞,CGF技術(shù)采用的速度從2 400～2 700 r/min不等。不同的離心速度分離出更大、更致密和更豐富的生長因子纖維蛋白基質(zhì)。經(jīng)離心后會產(chǎn)生三個成分:最上層為不含纖維蛋白原和凝血因子的血漿,即貧血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP);中間層包含CGF、白細胞和非常大且致密的聚合纖維蛋白;底層為紅細胞層。將PPP層和纖維蛋白塊的交界面抽吸即可制成CGF[9]。制備過程中無需加入任何物質(zhì)。CGF作為第三代血小板濃縮產(chǎn)品,對組織的修復(fù)和再生表現(xiàn)出良好的促進作用, 包括皮膚光老化、軟組織缺損修復(fù)、隆鼻、脫發(fā)、自體脂肪移植和瘢痕,到目前為止還沒有明顯的不良反應(yīng)報道[10]。其含有的多種生長因子能夠促進血管形成,提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),以及可能通過作用于Wnt/β-catenin通路,促進毛發(fā)的生長。毫火針屬于經(jīng)典的中醫(yī)外治療法,兼具毫針與火針的優(yōu)勢,其直徑更細,為0.2～0.3 mm之間,借火之力,穿透力更強,疼痛感輕,創(chuàng)口小,操作簡單,近年毫火針治療疾病的臨床應(yīng)用日益增多,如治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、周圍性面神經(jīng)麻痹等[11],研究表明毫火針聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單一治療[4, 12]。

7周齡的C57BL/6雄性小鼠毛囊進入靜止期,受到外界刺激后進入生長期,成為研究毛發(fā)生長最常用的動物模型[13-14],故本實驗以之為研究對象,觀察CGF聯(lián)合毫火針對毛發(fā)生長的影響。結(jié)果顯示,模型組無新生毛發(fā)長出,CGF+毫火針組及米諾地爾組、CGF組和毫火針組小鼠均有毛發(fā)長出,但CGF+毫火針組及米諾地爾組毛發(fā)生長更茂密,更烏黑發(fā)亮,說明CGF+毫火針組聯(lián)合應(yīng)用效果優(yōu)于單一治療。HE染色結(jié)果顯示CGF+毫火針組以終毛為主,毛乳頭體積增大,毛母質(zhì)增多,出現(xiàn)較多黑色素顆粒,其總毛囊數(shù)比毫火針組及CGF組更多,而模型組以毳毛為主,毛囊數(shù)量少。免疫組織化學(xué)結(jié)果示β-catenin主要表達于表皮、外毛根鞘、毛球部和毛母質(zhì),CGF+毫火針組陽性表達高于CGF組、毫火針組、模型組;Wnt10b主要表達于外毛根鞘、內(nèi)毛根鞘、毛母質(zhì),CGF+毫火針組陽性表達高于CGF組、毫火針組、模型組;GSK-3β主要表達于在毛發(fā)基質(zhì)區(qū),CGF+毫火針組陽性表達低于模型組及毫火針組。表明CGF+毫火針組可能通過Wnt/β-catenin通路刺激毛發(fā)生長。Western blot結(jié)果表明CGF+毫火針組的Wnt10b蛋白表達高于模型組;β-catenin蛋白表達在CGF+毫火針組高于毫火針組及模型組;GSK-3β蛋白表達在CGF+毫火針組低于模型組,CGF+毫火針組低于CGF組及毫火針組。說明CGF+毫火針組可能通過Wnt/β-catenin通路促進毛發(fā)生長,其相關(guān)蛋白表達量優(yōu)于CGF組及毫火針組,可能是CGF+毫火針毛囊數(shù)量更多,毛發(fā)質(zhì)量更好的原因。也表明毫火針能增強CGF在治療雄激素性脫發(fā)的作用。

綜上,本研究初步探索了CGF聯(lián)合毫火針對C57BL/6小鼠毛發(fā)生長的影響及作用機制,為最終闡明CGF聯(lián)合毫火針的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。