楊賢平,樂元,平瑞月,梁家芬,李紅毅

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種慢性復(fù)發(fā)性、炎癥性、瘙癢性皮膚病,常表現(xiàn)為皮膚濕疹樣改變,干燥伴劇烈瘙癢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD是由于先天稟賦不足、脾失健運(yùn)、素體偏熱,加上外感六淫、后天飲食失節(jié)等多種因素所致。正如《素問·至真要大論》載:“諸濕腫滿,皆屬于脾;諸痛癢瘡,皆屬于心”,心火脾虛的病機(jī)貫穿本病始終。本團(tuán)隊(duì)在多年的臨床實(shí)踐和科研中,驗(yàn)證了這一觀點(diǎn),并在此基礎(chǔ)上對(duì)心火脾虛型AD患者及動(dòng)物模型開展了多項(xiàng)研究[1-5]。

目前,AD的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。越來越多的研究[6-7]表明,腸道微生態(tài)失調(diào)在過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。腸道菌群水平及其共代謝產(chǎn)物與AD發(fā)病機(jī)制和嚴(yán)重程度之間存在著密切而復(fù)雜的聯(lián)系[8-10]。前期研究[11]發(fā)現(xiàn),心火脾虛型AD患者腸道菌群alpha多樣性較健康患者偏高,在部分菌群豐度上與健康對(duì)照存在差異。然而至今仍鮮有對(duì)AD患者腸道菌群共代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究[12-13],AD患者腸道菌群共代謝譜仍未能完全了解。因此,筆者將基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的代謝組學(xué)檢測(cè)分析方法,初步探索鑒定心火脾虛證型AD患者腸道菌群差異共代謝產(chǎn)物,為之后探索AD的病理機(jī)制提供依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2020年6月—2020年12月于廣東省中醫(yī)院皮膚科門診就診的心火脾虛型AD受試者20例,同時(shí)招募正常體檢的健康志愿者20例。記錄受試者與志愿者的年齡、性別等人口學(xué)信息。該試驗(yàn)獲得了廣東省中醫(yī)院倫理委員會(huì)(ZE2020-072-01)的倫理批準(zhǔn)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) AD患者參考Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。辨證診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療方案專家共識(shí)》[15]。由兩位具有執(zhí)照的中醫(yī)醫(yī)師對(duì)AD患者進(jìn)行辨證,以確保其統(tǒng)一性和權(quán)威性。

1.3納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的AD患者;②中醫(yī)辨證為心火脾虛證;③同意并簽署知情同意書。

1.4排除標(biāo)準(zhǔn) ①過去6個(gè)月內(nèi)系統(tǒng)應(yīng)用過益生菌、抗生素、免疫抑制劑;②過去1個(gè)月內(nèi)系統(tǒng)應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素;③過去2周內(nèi)外用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療;④過去2周內(nèi)口服中藥治療;⑤無法完成本研究全過程的患者。

1.5糞便標(biāo)本采集 入組的受試者和志愿者均按照要求采集糞便標(biāo)本。糞便標(biāo)本采集后聯(lián)系課題研究員并同城快遞送至廣東省中醫(yī)院,在5 h內(nèi)保存至醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)-80 ℃的環(huán)境中。

1.6代謝物的提取和檢測(cè)

1.6.1樣品制備 從-80 ℃的冰箱中取出糞便樣本于冰上解凍。待糞便樣本解凍到?jīng)]有冰塊后,稱量50 mg(±1 mg)樣本放至2 mL離心管中,并向離心管中加入500 μL 70%甲醇內(nèi)標(biāo)提取液,渦旋3 min混勻后,靜置于-20 ℃冰箱中30 min。在4 ℃的條件下,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后,取250 μL上清液于1.5 mL EP管中,把上清液以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后,取150 μL上清液于對(duì)應(yīng)進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)襯管中,用于上機(jī)分析。

1.6.2色譜采集條件 非靶向檢測(cè)數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(ultra performanceli-quidchromatography, UPLC)和四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(quadrupole-time of flight)。廣泛靶向檢測(cè)數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括UPLC和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry, MS/MS)。所有糞便樣本提取液進(jìn)行等量混合后,進(jìn)行基于液相色譜、四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry, LC-QTOF-MS/MS)的實(shí)驗(yàn)。

1.6.3樣本的質(zhì)控分析 由所有樣本提取物混合制備成質(zhì)控(quality control,QC)樣本,在每10個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入一個(gè)QC樣本,用于樣本在相同的處理方法下的可重復(fù)性監(jiān)測(cè)分析。

1.7數(shù)據(jù)處理和分析

1.7.1多元統(tǒng)計(jì)變量分析 用R語言軟件的內(nèi)置統(tǒng)計(jì)prcomp函數(shù),設(shè)置函數(shù)參數(shù)scale=True,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單位方差標(biāo)度(unit variance scaling,UV)歸一化,進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。同時(shí)采用正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)方法,使模型變得簡(jiǎn)單易懂,可視化效果更明顯。

1.7.2差異代謝產(chǎn)物的篩選 基于OPLS-DA結(jié)果,利用R語言軟件的MetaboAnalystR package可以初步篩選出兩組間的差異代謝物。同時(shí)結(jié)合單變量分析的P-value或者差異倍數(shù)值(fold change)來進(jìn)一步篩選出顯著差異代謝物。若為無生物學(xué)重復(fù)樣本比較,則根據(jù)fold change值進(jìn)行差異篩選。若為有生物學(xué)重復(fù)樣本比較,則采取將fold change和OPLS-DA模型的變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值相結(jié)合的方法來篩選差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn):①代謝物在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中差異為2倍以上或0.5以下(fold change≥2或fold change≤0.5),則認(rèn)為差異顯著。②若樣品分組存在生物學(xué)重復(fù),在①的基礎(chǔ)上,再選取VIP≥1的代謝物,則認(rèn)為差異顯著。將篩選得到的差異代謝產(chǎn)物利用R語言軟件繪制火山圖。

1.7.3通路注釋及富集分析 將差異代謝產(chǎn)物利用基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋,并進(jìn)行差異代謝物的KEGG通路富集分析。利用人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB)對(duì)顯著差異代謝物進(jìn)行注釋,找出其所關(guān)聯(lián)的疾病信息。

2 結(jié)果

2.1一般資料 研究共納入心火脾虛型AD患者20例,其中男6例,女14例,平均年齡(15.65±12.11)歲;健康志愿者20例,其中男6例,女14例,平均年齡為(15.55±12.12)歲。兩組性別、年齡組成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2代謝產(chǎn)物篩選結(jié)果 通過非靶向代謝組學(xué)定性檢測(cè)來擴(kuò)充糞便標(biāo)本代謝產(chǎn)物檢出種類,共檢測(cè)到代謝產(chǎn)物553個(gè)。而對(duì)混樣標(biāo)本進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)的定性定量檢測(cè),共檢測(cè)到代謝產(chǎn)物807個(gè)。4個(gè)質(zhì)控樣本(QC)的總離子流圖如圖1所示,可見代謝物檢測(cè)總離子流的曲線重疊性高,即保留時(shí)間和峰強(qiáng)度均一致,表明質(zhì)譜對(duì)同一樣品不同時(shí)間檢測(cè)時(shí),信號(hào)穩(wěn)定性較好。證明檢測(cè)儀器具有較高穩(wěn)定性,分析數(shù)據(jù)結(jié)果可靠,具有可重復(fù)性。

In positive total ion current environment; Under negative total ion current environment圖1 QC樣品質(zhì)譜檢測(cè)總離子流圖疊加圖Fig.1 The superposition diagram of total ion flow diagram detected by mass spectrometry of QC sample

通過對(duì)糞便樣本檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行PCA(圖2a),然后再基于有監(jiān)督模式識(shí)別的多元統(tǒng)計(jì)分析方法,繪制OPLS-DA得分圖(圖2b),由圖中可見AD心火脾虛組和健康對(duì)照組組間分離趨勢(shì)明顯,代表兩組間代謝產(chǎn)物差異明顯。對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(permutation test)[16],由圖3中可見,本模型擬合度可,具有較好的預(yù)測(cè)能力,說明本OPLS-DA模型是有效,可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)挖掘分析。

PCA; OPLS-DA score diagrams圖2 AD組和健康對(duì)照組糞便共代謝產(chǎn)物PCA和OPLS-DA評(píng)分圖Fig.2 PCA and OPLS-DA score diagrams of fecal co-metabolites in AD group and control group

基于OPLS-DA分析結(jié)果篩選出AD心火脾虛組的顯著差異代謝物,繪制火山圖(圖4)?？偣埠Y選出兩組顯著差異代謝產(chǎn)物77個(gè),其中在AD心火脾虛組糞便標(biāo)本中表達(dá)顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物有39個(gè),表達(dá)上調(diào)最明顯的前5個(gè)差異代謝產(chǎn)物分別為溶血磷脂酰膽堿 22:5(2n isomer2)[lysoPC 22:5(2n isomer2)]、溶血磷脂酰膽堿 22:5(2n isomer1)[lysoPC 22:5(2n isomer1)]、色胺(tryptamine)、吲哚乙醛(indoleacetaldehyde)、2-苯乙胺(phenethy-lamine);表達(dá)顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物38個(gè),表達(dá)下調(diào)最明顯的前5個(gè)差異代謝產(chǎn)物分別為18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid)、醛固酮(aldosterone)、4-羥視黃酸(4-hydroxyretinoic acid)、5-L-谷氨酰-L-丙氨酸[(5-L-glutamyl)-L-amino acid]、甘草酸(glycyrrhizinate)。

Note:Green spots represent significant downregulation of differentially expressed metabolites; red spots represent significant upregulation of differentially expressed metabolites; black spots represent metabolites detected, but there was no significant difference.圖4 兩組糞便樣本之間的差異代謝物火山圖Fig.4 Volcano plot of differential metabolites between the two groups of fecal samples

2.3功能富集和關(guān)聯(lián)疾病分析 通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋和通路富集分析(圖5),可見膽汁分泌(bile secretion)這條通路富集相對(duì)顯著。通過HMDB對(duì)顯著差異代謝物進(jìn)行注釋和疾病信息關(guān)聯(lián),可見關(guān)聯(lián)疾病主要為消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的相關(guān)疾病,其中關(guān)系最為密切的是消化系統(tǒng)疾病,以結(jié)直腸癌、嗜酸性食管炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病為主。

Note:The larger the rich factor value was, the greater the enrichment degree of the pathway was; the closer P-value was to 0, the more significant the enrichment degree of the pathway was; the size of the point represents the number of metabolites enriched in the corresponding pathway.圖5 兩組糞便樣品中差異代謝產(chǎn)物的KEGG通路富集圖Fig.5 KEGG pathway enrichment map of differential co-metabolites in two groups of fecal samples

3 討論

心火脾虛證型AD患者腸道菌群共代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)出與健康志愿者不一樣的代謝輪廓。溶血磷脂酰膽堿是高密度脂蛋白的一種,其可有效抑制嗜酸性粒細(xì)胞的形狀變化和遷移[17]。這與抑制嗜酸性粒細(xì)胞效應(yīng)物反應(yīng)的能力受損有關(guān)。本研究心火脾虛證型AD患者的腸道菌群共代謝產(chǎn)物中,溶血磷脂酰膽堿類產(chǎn)物以上調(diào)為主,可能與AD患者腸道對(duì)該類物質(zhì)吸收減少、排泄增多有關(guān)。18β-甘草次酸和甘草酸通過抑制促炎基因的表達(dá)、抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及影響花生四烯酸轉(zhuǎn)化為促炎性白三烯而顯示出抗炎活性,對(duì)AD有較好的治療作用[18],這兩者在心火脾虛證型AD患者的腸道菌群共代謝產(chǎn)物中呈顯著下調(diào)趨勢(shì),可能與AD患者發(fā)病或皮疹加重有關(guān)。因此,溶血磷脂酰膽堿類與甘草次酸類物質(zhì)可能成為表征心火脾虛證型AD的主要代謝產(chǎn)物,仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在共代謝產(chǎn)物注釋的KEGG通路中,膽汁酸分泌通路注釋的頻數(shù)最高。膽汁酸是一類重要的信號(hào)分子,其對(duì)腸道菌群以及宿主的免疫和代謝具有重要影響[19]。目前已知,膽汁酸代謝與AD等多種特應(yīng)性疾病密切相關(guān)[20]。

通過對(duì)顯著差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn),心火脾虛證型AD與多種消化系統(tǒng)疾病明顯相關(guān)。目前,AD與結(jié)直腸癌相關(guān)性仍存在較大爭(zhēng)議, Chou等[21]通過對(duì)AD患者健康保險(xiǎn)資料隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn),在男性和女性以及所有年齡組中,AD和結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)之間均存在顯著的正相關(guān)。然而部分研究認(rèn)為AD與結(jié)直腸癌的發(fā)病無明顯相關(guān),甚至認(rèn)為AD可以降低結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[22]。AD與嗜酸性食管炎也密切相關(guān),在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上,兩者共享一組共同的疾病特異性轉(zhuǎn)錄,有共同的分子病因?qū)W基礎(chǔ)[24]。在細(xì)胞分子水平上,兩者發(fā)病均與上皮細(xì)胞間的緊密連接(TJs)破壞導(dǎo)致的表皮屏障功能障礙有關(guān)[24-25]。同時(shí),越來越多學(xué)者認(rèn)為AD是一種系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),其與潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等多種炎癥性腸病也關(guān)系密切[26-28]。AD和共病之間的關(guān)系可能是雙向和多因素的[29]。

中醫(yī)認(rèn)為“肺主皮毛”“肺與大腸相表里”,肺的宣降平衡對(duì)皮膚與大腸的生理穩(wěn)定有重要作用?；谥嗅t(yī)“皮膚-肺-大腸”相關(guān)理論,推測(cè)皮膚與大腸之間同樣存在緊密聯(lián)系,這大大拓寬了中醫(yī)的臟腑理論,對(duì)于進(jìn)一步解釋皮膚與大腸之間的生理病理變化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度,皮膚與腸道是人體的兩個(gè)最大的器官,其在生理和病理上互相聯(lián)系,這就是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“皮腸軸”的概念[30],而腸道微生物群是“皮腸軸”的主要調(diào)節(jié)者[31],皮膚疾病與大腸微生態(tài)紊亂密切相關(guān)。腸道微生態(tài)的穩(wěn)定與宿主的健康息息相關(guān)。宿主和腸道微生物群在小分子代謝物和共代謝物的介導(dǎo)下,通過共生或失調(diào)環(huán)境相互影響[32]。目前,特應(yīng)性皮炎發(fā)病機(jī)制尚不明確,糞便代謝組學(xué)技術(shù)為尋找AD潛在生物標(biāo)記物提供了新的視角。廣義上講,腸道菌群及其共代謝產(chǎn)物的平衡,是人體“陰陽平衡”的一部分,心火脾虛證AD患者正是因?yàn)椤瓣庩柺Ш狻?在臨床上表現(xiàn)為皮膚疾患,在代謝組學(xué)上表現(xiàn)出菌群共代謝產(chǎn)物的差異。

本研究通過代謝組學(xué)技術(shù),在海量的代謝產(chǎn)物中尋找挖掘心火脾虛證型AD患者腸道菌群差異共代謝產(chǎn)物,并進(jìn)行通路注釋和疾病關(guān)聯(lián)分析,這將有助于挖掘潛在的中醫(yī)藥治療靶點(diǎn),指導(dǎo)臨床新藥開發(fā),也為心火脾虛證型AD患者的臨床診斷、治療研究和共病研究提供理論基礎(chǔ)。由于本研究的時(shí)間、經(jīng)費(fèi)有限,納入病例較少,僅作一初步探索性研究。今后可加大樣本,分組進(jìn)行研究討論。對(duì)于挖掘分析得到的顯著差異代謝產(chǎn)物,后續(xù)仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。