欒梅,趙怡馨,李盼,牟寬厚

白癜風(fēng)是一種色素脫失性自身免疫性疾病,全球發(fā)病率約0.5%～2.0%,發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,包括有遺傳學(xué)說、自身免疫學(xué)說、精神與神經(jīng)化學(xué)學(xué)說、微量元素缺乏和自由基損傷學(xué)說等[1]。近來腸道微生物在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用受到關(guān)注。白癜風(fēng)患者合并幽門螺旋菌感染及炎癥性腸病的幾率高于健康人群[2-3]。白癜風(fēng)小鼠模型的研究表明,口服抗生素(氨芐青霉素)改變小鼠腸道菌群組成可顯著加速白癜風(fēng)病理進(jìn)程,提示腸道菌群的改變與疾病活動(dòng)相關(guān)[4]。目前白癜風(fēng)患者腸道菌群如何參與白癜風(fēng)病理進(jìn)程尚不清楚。為進(jìn)一步探究腸道菌群在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用,筆者通過宏基因組學(xué)技術(shù)分析非節(jié)段型進(jìn)展期白癜風(fēng)患者腸道微生物組成及基因功能與潛在的代謝通路,為探索疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診療提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 納入2022年6月—2022年9月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科的進(jìn)展期非節(jié)段型白癜風(fēng)患者25例,納入標(biāo)準(zhǔn)符合2021版《白癜風(fēng)診療共識(shí)》[5],排除標(biāo)準(zhǔn)為既往有自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤、其他臟器疾病(甲狀腺、心臟、消化道等)及其他皮膚病,或在前3個(gè)月內(nèi)曾系統(tǒng)使用抗生素或其他免疫抑制劑,納入男18例,女7例,平均年齡(30.47±9.03)歲,身高體重指數(shù)(body mass index,BMI)為22.81±4.05。對(duì)照組納入25例性別、年齡和BMI相匹配的健康志愿者。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者都簽署了知情同意書。

1.2樣品收集 糞便樣本使用快速提取試劑盒(MGIEasy糞便樣本收集試劑盒,上海,中國),患者排便取新鮮糞便10 g,取樣后立即儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中。

1.3宏基因組測序 使用MagbeadsDNA?快速提取試劑盒(MP生物醫(yī)藥,上海,中國)提取糞便樣本中DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳法測定提取的DNA濃度。用超聲波碎波儀將DNA修剪至平均約420 bp,構(gòu)建成對(duì)端文庫。舍棄低質(zhì)量、與接頭序列重疊的堿基,使用Bowtie2軟件(v2.3.5.1)去除宿主基因。按照說明,在BGI平臺(tái)(MGESEQ-T7,深圳, 中國)上對(duì)人類糞便樣本進(jìn)行宏基因組測序。

1.4分類分析 基于MetaPhlAn3版本3.0.5預(yù)測不同分類等級(jí)的菌群相對(duì)豐度。根據(jù)Shannon指數(shù)估算菌群豐富度和分布(α-多樣性)?；谥脫Q多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA),測定白癜風(fēng)患者和對(duì)照組間的成分差異(β-多樣性)。生物特異性基因分布到KEGG和KEGG Orthologys(KO)。利用通路分類的MetaCyc層次結(jié)構(gòu),將每個(gè)樣本的宏基因組基于注釋重構(gòu)為代謝通路,分析腸道微生物代謝功能變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用R軟件(v4.0.2)進(jìn)行分析,采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析組間差異,線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)組間差異菌,LDA值>2.0,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1白癜風(fēng)患者腸道微生物多樣性 分析α-多樣性代表物種的多少、豐富度和均勻度。Shannon指數(shù)反應(yīng)群落的物種數(shù)量和均勻度,Shannon指數(shù)越大,代表物種多樣性越高。本研究分析顯示,白癜風(fēng)患者Shannon指數(shù)較健康人降低(圖1a),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.09,P<0.05)。進(jìn)一步將白癜風(fēng)患者按病程分組,發(fā)現(xiàn)病程小于5年的白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照組相比,α-多樣性降低(Z=-2.24,P<0.05,圖1b)。β-多樣性代表群落結(jié)構(gòu)的相似性,基于 Bray-Curtis算法的PCoA分析顯示兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PEMANOVA,P=0.4541),見圖1c。

Note:Compared with healthy controls,*P<0.05. α-diversity was decreased in patients with vitiligo; The Shannon index in<5 years goup was lower than healthy controls; PCoA score plot based on Bray-Curtis圖1 白癜風(fēng)患者腸道菌群的多樣性分析Fig.1 Analysis of intestinal microbiota diversities patients with vitiligo

2.2白癜風(fēng)患者的腸道微生物組成 在屬水平上,豐富度最高的前20種菌屬包括居海事城球桿菌屬(Phocaeicola)、擬桿菌屬(Bacteroides)、巨單胞菌屬(Megamonas)、羅斯拜瑞氏菌屬(Roseburia)、梭桿菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、地中海桿菌屬(Mediterraneibacter)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、別樣桿菌屬(Alistipes)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、梭菌屬(Clostridium)、厭氧棒狀菌屬(Anaerostipes)、戴阿利斯特菌屬(Dialister)、多爾氏菌屬(Dorea)、埃希氏菌屬(Escherichia)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、梭狀鏈桿菌屬(Fusicatenibacter)、毛螺菌屬(Lachnospira)(圖2)。白癜風(fēng)患者中擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、多爾氏菌屬(Dorea)和布勞特氏菌屬(Blautia)(Z=-2.09,P<0.05)相對(duì)豐度較健康人群低。

圖2 白癜風(fēng)患者腸道菌群的分類學(xué)組成Fig.2 Taxonomy composition of the intestinal flora in patients with vitiligo

2.3白癜風(fēng)患者和健康對(duì)照的差異微生物 與健康對(duì)照組相比,11種菌屬相對(duì)豐度在白癜風(fēng)組降低(圖3a),包括阿里松氏菌屬(Allisonella)(Z=-2.91,P<0.01)、伊格爾茲氏菌科(Eggerthellaceae)(Z=-2.88,P<0.01)、霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)(Z=-2.58,P<0.05)、粗桿菌屬(Raoultibacter)(Z=-2.40,P<0.05)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)(Z=-2.17,P<0.05)、棲白蟻菌屬(Isoptericola)(Z=-2.08,P<0.05)、特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)(Z=-2.06,P<0.05)、糞樣單胞菌屬(Faecalimonas)(Z=2.04,P<0.05)、幼嬰糞桿菌屬(Coprobacter)(Z=-2.63,P<0.01)、布勞特氏菌屬(Blautia)(Z=-2.09,P<0.05)、Neobittarella(Z=-2.24,P<0.05)。其中霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)和特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)在白癜風(fēng)患者中缺如。念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)(Z=2.01,P<0.05)、巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)(Z=-2.18,P<0.05)、日本醫(yī)學(xué)研究開發(fā)署桿菌屬(Amedibacillus)(Z=2.25,P<0.05)、座便單胞菌屬(Sellimonas)(Z=2.00,P<0.05)相對(duì)豐度在白癜風(fēng)組明顯增加(圖3a)。

Note:Compared with healthy controls,*P<0.05,**P<0.01. Wilcoxon test; LEfSe圖3 白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照腸道菌群差異菌分析Fig.3 Differences of the intestinal flora between vitiligo patients and healthy controls

LEfSe分析差異菌結(jié)果顯示(圖3b),念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)(LDA=2.54,P<0.05)在白癜風(fēng)組富集。阿里松氏菌屬(Allisonella)(LDA=2.70,P<0.05)、特呂佩爾氏菌屬(Trueperella)(LDA=2.51,P<0.05)、幼嬰糞桿菌屬(Coprobacter)(LDA=2.26,P<0.05)、伊格爾茲氏菌科(Eggerthellaceae)(LDA=2.45,P<0.05)、棲白蟻菌屬(Isoptericola)(LDA=2.05,P<0.05)等在對(duì)照組富集。

2.4腸道微生物基因功能和代謝途徑 分析KEGG及KO分析提示白癜風(fēng)患者中顯著富集的功能包括(圖4):NOD樣受體信號(hào)通路(Z=3.56,P<0.01)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Z=2.80,P<0.01)和嘌呤霉素生物合成(Z=2.34,P<0.05)。而在健康對(duì)照組中最豐富的功能是倍半萜和三萜生物合成(Z=-2.78,P<0.05)、吲哚二萜生物堿生物合成(Z=-2.58,P<0.05)、萜類主干生物合成(Z=-2.49,P<0.05)和n-聚糖生物合成(Z=-2.47,P<0.05)。

圖4 白癜風(fēng)患者腸道菌群的基因功能分析Fig.4 Analysis of the intestinal flora gene functions in patients with vitiligo

代謝模塊分析腺苷甲硫氨酸合成和谷氨酸降解在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;較對(duì)照組,白癜風(fēng)組腺苷甲硫氨酸合成(Z=-2.47,P<0.05)和谷氨酸降解(Z=-2.24,P<0.05)通路水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5a～5b)。

3 討論

腸道微生物在物質(zhì)代謝、能量吸收及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[6]。腸道微生物參與了多種皮膚相關(guān)疾病的發(fā)生,例如斑禿[7]、銀屑病[8]、特異性皮炎[9]等。腸道菌群在白癜風(fēng)中的作用近來受到高度關(guān)注,目前已有的研究全部基于16sRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)。本研究采用的宏基因組測序技術(shù)可直接對(duì)DNA分子進(jìn)行序列測定,獲取樣本中所有微生物的基因組信息,從而分析微生物的組成、功能特點(diǎn)和代謝特征。

本研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比,白癜風(fēng)患者腸道菌群的α-多樣性降低,這與Bzioueche等[10]的研究一致,但與Ni等[11]的研究結(jié)果相反。進(jìn)一步亞組分析,發(fā)現(xiàn)病程小于5年的白癜風(fēng)患者腸道菌群α-多樣性顯著降低,提示腸道菌群伴隨白癜風(fēng)發(fā)病多樣性顯著降低;病程的延長可能會(huì)導(dǎo)致腸道菌群在白癜風(fēng)和正常對(duì)照組的腸道菌群趨于一致。本研究發(fā)現(xiàn)β-多樣性在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與Bzioueche等[10]的研究結(jié)果一致;但Ni等[11]的研究發(fā)現(xiàn)主成分1(principal component analysis 1,PCA1)貢獻(xiàn)最大,達(dá)到24.53%,提示白癜風(fēng)患者腸道群落結(jié)構(gòu)有差異。白癜風(fēng)患者中豐度降低的腸道微生物包括產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)的多種菌屬,如擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)和梭菌屬(Clostridium)等[12]。SCFAs在維持腸道黏膜屏障的完整性和通透性中發(fā)揮重要作用。同樣豐度降低的菌屬譬如霍爾德曼穆爾菌屬(Holdemanella)可通過代謝低聚果糖產(chǎn)生長鏈脂肪酸發(fā)揮抗炎作用[13]。阿里松氏菌屬(Allisonella)可代謝產(chǎn)生組胺[14],組胺可抑制腸道微生物異位,促進(jìn)腸黏膜修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)上述菌屬與腸道屏障功能及具有腸道抗炎功能的腸道微生物相對(duì)豐度降低,提示腸道屏障功能破壞可能與白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)。補(bǔ)充維持腸道屏障功能的益生菌可能有益于白癜風(fēng)的輔助治療。

本研究結(jié)果顯示白癜風(fēng)患者中4個(gè)菌屬腸道微生物相對(duì)豐度升高。既往研究提示這些菌屬可能與抑郁等精神疾病相關(guān):座便單胞菌屬(Sellimonas)在重度抑郁癥者腸道中高度富集[15]。巴恩斯氏菌屬(Barnesiella)的相對(duì)豐度在便秘孤獨(dú)癥組中高于非便秘孤獨(dú)癥組[16]。一項(xiàng)大規(guī)模人群的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)與抑郁癥高度相關(guān)[17]。本研究提示腸道菌群可能與白癜風(fēng)患者的精神癥狀如抑郁表型高度相關(guān),其具體機(jī)制有待研究。LEfSe結(jié)果顯示,念珠菌-糖鏈菌(Candidatus-Saccharibacteria)在白癜風(fēng)組富集。念珠菌-糖鏈菌是一種寄生菌,屬于糖細(xì)菌(TM7)分類中的一種, 可通過Ⅳ型菌毛可識(shí)別并附著于其細(xì)菌宿主[18]。TM7被檢測為健康人類口腔、胃、皮膚和腸道微生物群落的共生成員,在炎癥環(huán)境中相對(duì)活躍[19],提示炎癥也可能是白癜風(fēng)的病理因素之一。

不同于16sRNA測序技術(shù),宏基因組學(xué)技術(shù)可以分析腸道細(xì)菌基因功能。KEGG分析顯示白癜風(fēng)患者中NOD樣受體信號(hào)通路豐富。核定位富亮氨酸重復(fù)序列蛋白1 (nuclear localization leucine-rich-repeat protein 1,NLRP1)是NOD樣受體家族的成員。編碼NLRP1的核定位NLRP1基因的多態(tài)性與白癜風(fēng)高度相關(guān)[20]。核定位富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白3(nuclear localization leucine-rich-repeat protein 3,NLRP3)炎癥小體的NOD樣受體家族表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活可促進(jìn)皮膚T細(xì)胞免疫反應(yīng),參與白癜風(fēng)的發(fā)生[21]。由于NOD樣蛋白家族成員數(shù)量眾多,作為先天免疫調(diào)節(jié)因子的NOD樣受體成員可能成為研究白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的潛在靶點(diǎn)。

代謝模塊分析顯示白癜風(fēng)患者腸道菌群甲硫氨酸合成和谷氨酸代謝通路水平降低。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸可通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平從而發(fā)揮抗炎作用。Marzabani等[23]對(duì)白癜風(fēng)患者血清氨基酸代謝研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者血清谷氨酸水平升高,認(rèn)為谷氨酸是疾病進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。谷氨酸通過線粒體膜運(yùn)輸還原劑,通過蘋果酸/天冬氨酸穿梭調(diào)節(jié)糖酵解和細(xì)胞氧化還原狀態(tài)[24]。氧化應(yīng)激是白癜風(fēng)發(fā)病的重要誘因之一,由此筆者推測腸道菌群代謝物可能通過影響全身氧化應(yīng)激狀態(tài)促進(jìn)白癜風(fēng)的病理進(jìn)程。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者腸道微生物多樣性降低,微生物的相對(duì)豐度及菌群基因功能和代謝功能均發(fā)生改變。本研究為白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制研究及潛在治療策略提供重要的理論依據(jù)。