張 丹，杜之渝

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1眼科，2超聲分子影像重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400010

角膜是屈光系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)于正常的視覺形成起著重要作用［1］。嚴(yán)重的角膜疾病會(huì)極大的損害視力健康甚至致盲，目前針對(duì)難治性角膜疾病治療較多選用傳統(tǒng)滴眼液對(duì)角膜進(jìn)行抗炎、抗感染、促修復(fù)等處理。傳統(tǒng)滴眼液作為目前治療患者角膜疾病的首選劑型，由于眼部解剖學(xué)、生理學(xué)的限制，使得其在眼部生物利用度較低（<5%），治療效果不佳，給眼部疾病治療帶來了巨大困難［2,3］，且頻繁使用皮質(zhì)類固醇滴眼液進(jìn)行抗炎時(shí)，還可能造成眼壓升高并產(chǎn)生角膜毒性［4,5］，因此尋求一種安全、有效、減少用藥頻率及副作用的眼部新型制劑具有重要意義。

胰島素（INS）是重要的代謝調(diào)節(jié)激素，研究證明胰島素還是潛在的抗氧化劑具有抗炎、抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的重要生物學(xué)作用［6-8］。相關(guān)研究已證明局部應(yīng)用胰島素于角膜可加快損傷角膜上皮的愈合、刺激培養(yǎng)的神經(jīng)元再生及神經(jīng)元的突觸分化和成熟［9,10］。但由于其穩(wěn)定性差、分子量大，不易通過眼部屏障等性質(zhì)，該藥目前在眼科應(yīng)用受限［11］。脂質(zhì)體作為一種新型納米眼部藥物載體它生物相容性好、穿透性強(qiáng)、角膜滲透性好，其特有屬性在運(yùn)載藥物治療眼部疾病時(shí)與傳統(tǒng)眼藥制劑相比具有很大的優(yōu)勢(shì)［12-14］。TPGS安全無毒、具有兩親性結(jié)構(gòu)，由維生素E琥珀酸酯（VES）與聚乙二醇（PEG）1000 通過酯化反應(yīng)制得，它可以作為滲透促進(jìn)劑、乳化劑修飾脂質(zhì)體，增加藥物在組織的滲透性、增強(qiáng)載藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性［15,16］，但在修飾胰島素脂質(zhì)體眼用制劑方面的研究尚無報(bào)道。在本研究中我們選用胰島素作為目標(biāo)藥物，采用TPGS作為表面活性劑，制備出TPGS修飾的胰島素脂質(zhì)體（T-LPs/INS），考察相關(guān)的表征、角膜滲透性能，觀察在局部兔眼組織的濃度變化，進(jìn)行眼部藥代動(dòng)力學(xué)特征分析，評(píng)價(jià)其眼部相對(duì)生物利用度，為胰島素臨床治療角膜疾病的應(yīng)用提供初步理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、熒光倒置顯微鏡（Olympus）、3000SSA 型激光粒徑電位分析儀（Malvern Instruments）、紫外分光光度計(jì)（Shimadzu）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、聲震儀（Sonics）、低溫高速離心機(jī)（Sigma）、人胰島素（Sigma）、大豆軟磷脂（純度>99%，上海麥克林生化科技有限公司）、膽固醇（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）、TPGS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（泉州睿信科技有限公司）、磷酸鹽緩沖液（武漢賽維爾生物公司）、尼羅紅（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、DMED/F12培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、1%青霉素/鏈霉素（Gibco）。

1.2 脂質(zhì)體制備及表征

1.2.1 脂質(zhì)體制備 采用逆向蒸發(fā)法［17,18］制備脂質(zhì)體，按一定比例稱量一份大豆軟磷脂、膽固醇，溶于加入一定量TPGS的7 mL乙醚，待固體完全溶解后加入溶于PBS的處方量的胰島素原料藥，在室溫及一定功率下進(jìn)行超聲30 min，得到水包油（W/O）型乳劑，接著置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行減壓蒸發(fā)2 h，待有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)后即得到胰島素脂質(zhì)體混懸液初液，將其移至離心管并在60 w功率、超5 s/空s，冰浴條件下進(jìn)行聲震5 min得到淡藍(lán)色澄清透明的T-LPs/INS。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與包封率測定 精密稱量胰島素標(biāo)準(zhǔn)品至5 mL容量瓶中稀釋至刻度，搖勻得10 mg/mL的胰島素標(biāo)準(zhǔn)液M0。分別從M0中移取0.125、0.250、0.375、0.500 mL于5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖晃均勻后，測其吸光度A214nm，用胰島素濃度（C）對(duì)其A214nm進(jìn)行回歸得出回歸方程即得到胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用破乳法對(duì)T-LPs/INS包封率、載藥率進(jìn)行計(jì)算，公式如下：包封率=W1/W2 100%（W1為包封中藥物的質(zhì)量，W2 為體系中藥物的投入量）；載藥率=W1/W3 100%（W1為包封中藥物的質(zhì)量，W3為體系中脂質(zhì)體的總量）。

1.2.3 粒徑和zeta大小測定 使用激光粒徑電位分析儀測定脂質(zhì)體的粒徑與zeta電位。測定樣品前對(duì)脂質(zhì)體樣品溶液進(jìn)行稀釋，每個(gè)樣品測定3次。

1.2.4 生物透射電鏡測定 采用生物透射電鏡對(duì)脂質(zhì)體形態(tài)進(jìn)行分析。將脂質(zhì)體樣品置于銅網(wǎng)進(jìn)行負(fù)染處理，待干燥后進(jìn)行上機(jī)觀察拍攝。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）培養(yǎng)在配有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并置于37 ℃且含有5%CO2空氣的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。指數(shù)期生長的細(xì)胞用于體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 體外細(xì)胞毒性 將HCECs鋪于96孔板過夜孵育24 h，加入稀釋的待測藥物，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。孵育24小時(shí)后棄去孔內(nèi)液體，接著每孔加入預(yù)配置好的110 μL培養(yǎng)基（CCK8∶培養(yǎng)基=1∶10），置于孵箱30 min，用酶標(biāo)儀測定在吸光度A450nm，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞活力（%）：[（A450nm實(shí)驗(yàn)-A450nm空白）]/[（A450nm對(duì)照-A450nm空白）]100%。

將HCECs接種于12孔板，分別加入無血清稀釋的脂質(zhì)體空球（T-lip，2000 μg/mL）、胰島素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）共孵育24 h 后，用PBS 沖洗3次，在各孔加入預(yù)先配置好的Ca-AM/PI雙染色試劑并孵育20 min后，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的存活/死亡情況。

1.4 熒光示蹤兔眼表滯留研究

采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)兔分為2組，每組3只兔6眼。對(duì)照組：以預(yù)先配置的熒光素鈉稀釋液50 μL滴眼，連續(xù)3次間隔5 min/次；實(shí)驗(yàn)組：以熒光素鈉標(biāo)記的T-LPs/INS 50 μL滴眼，連續(xù)3次滴眼間隔5 min/次。各組以最后1次滴眼的時(shí)間點(diǎn)開始計(jì)時(shí)，選取適合的時(shí)間節(jié)點(diǎn)在鈷藍(lán)光下拍照記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兔眼表熒光的消除情況。

1.5 兔角膜滲透研究

以隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)兔分組2組，每組3只兔6眼。對(duì)照組：尼羅紅稀釋液50 μL滴眼，連續(xù)3次每次間隔5 min；實(shí)驗(yàn)組：尼羅紅標(biāo)記的T-LPs/INS 50 μL滴眼，連續(xù)3次每次間隔5 min。各組滴眼后在45 min后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，取下眼角膜進(jìn)行染色、切片，倒置熒光顯微鏡下觀察對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片，評(píng)估藥物在角膜組織各層的滲透性。

1.6 局部眼藥代動(dòng)力學(xué)

1.6.1 實(shí)驗(yàn)兔分組 健康并排除眼部疾患的新西蘭兔（重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK2022-0016，動(dòng)物倫理審批號(hào)為2022年科倫審第179號(hào)）48 只，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量2.5～3 kg。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組24 只兔48 眼，其中每組設(shè)置8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 只兔6 只眼。

1.6.2 給藥以及眼部樣品采集處理、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測 用微量加樣器向?qū)φ战M兔眼注入50 μL預(yù)先配置的胰島素滴眼液、實(shí)驗(yàn)組兔眼注入50 μL T-LPs/INS，使其輕輕閉合雙瞼眨眼數(shù)次后，任其自由活動(dòng)。分別于滴眼后的0.1、0.25、0.75、1、2、2.5、4.5、6 h于耳緣靜脈處注射過量5%戊巴比妥鈉處死，生理鹽水充分沖洗眼球，采用微量注射器于角鞏膜緣處進(jìn)針迅速取出房水，采用已消毒好的眼科器械迅速摘除眼球，分離角膜、晶狀體、玻璃體等組織，在濾紙吸干后精密稱量，所有樣品處理后于-80 ℃冰箱冷凍保存。

人胰島素酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒置于室溫復(fù)溫1 h，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行組織藥物濃度檢測。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的A450nm，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)曲線方程計(jì)算各組樣品中胰島素藥品的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析

數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用DAS2軟件擬合分析各組兔眼不同部位中胰島素的達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、最大藥物濃度（Cmax）、及藥物濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t）、平均駐留時(shí)間（MRT0-t）、藥物半衰期（T?）等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。兩組間數(shù)據(jù)差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體納米粒表征

用胰島素濃度對(duì)其A214nm進(jìn)行回歸得出回歸方程（圖1A）即得到胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0154X+0.0932，R2=0.9997，結(jié)果表明胰島素在25～100 μg/mL之間線性關(guān)系良好。脂質(zhì)體納米粒粒徑為107.0±2.951 nm，Zeta電位為（-6.93±0.505）mV。生物透射電鏡（圖1C）可以看到，包覆胰島素的脂質(zhì)體成圓球狀，表面平伏光滑，質(zhì)地均勻，顆粒間無明顯粘連。

圖1 胰島素濃度吸光度曲線及T-LPs/INS的表征檢測結(jié)果Fig. 1 Characterization of the prepared T-LPs/INS particles.A:A calibration curve of insulin for quantitation of its loading efficiency(absorbance at 214 nm).B:Size distribution of T-LPs/INS.C:TEM of T-LPs/INS.D:Zeta potential of T-LPs/INS.

2.2 脂質(zhì)體體外細(xì)胞毒性

CCK8結(jié)果表明（圖2），在一定濃度下，不同濃度的游離的脂質(zhì)體胰島素（T-lip）對(duì)細(xì)胞活力的影響沒有明顯差異（P>0.05）；胰島素在200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，細(xì)存活率與對(duì)照組無明顯差異，當(dāng)胰島素濃度繼續(xù)增大后細(xì)胞活力明顯下降與對(duì)照組對(duì)比有較大差異（P<0.001）；在一定濃度范圍內(nèi)T-LPs/INS對(duì)于細(xì)胞存活率與對(duì)照組無明顯差異，超過這個(gè)范圍后，細(xì)胞活力下降顯著，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）?；?死染色圖像中（圖3），綠色熒光細(xì)胞表示活細(xì)胞，其大量存在也表明胰島素?zé)o論是游離在溶液中還是載于脂質(zhì)體中對(duì)HCECs來說都是安全的。

圖2 HCECs與不同濃度游離的脂質(zhì)體（T-lip）、INS、T-LPs/INS共孵育24 h后的細(xì)胞活力Fig. 2 Viability of HCECs treated with free T-lip,insulin solution and T-LPs/INS at different concentrations for 24 h(***P<0.001).

圖3 脂質(zhì)體（T-lip，2000 μg/mL）、胰島素溶液（200 μg/mL），T-LPs/INS（200 μg/mL）與HCECs共孵育24 h后細(xì)胞的活/死染色圖像Fig. 3 Live/dead staining of HCECs treated for 24 h with T-lip(2000 μg/mL),insulin solution(200 μg/mL),T-LPs/INS(200 μg/mL)(Ca-AM/PI staining,original magnification:×100).

2.3 局部兔眼熒光滯留示蹤

如圖4A為給藥后不同時(shí)間段內(nèi)手持裂隙燈顯微鏡在鈷藍(lán)光下眼部熒光滯留的情況。在給新西蘭兔點(diǎn)眼后，隨著兔子淚液的更新及眨眼，藥物會(huì)被迅速消除，部分滴眼液會(huì)隨著眼角流出，在對(duì)照組中可以觀察到10 min左右檢測到微量熒光，實(shí)驗(yàn)組在給藥后30～40 min 仍然可檢測到熒光?？梢灾庇^的看出T-LPs/INS滴眼液在眼部滯留能力強(qiáng)于INS滴眼液。

圖4 各組在兔眼眼表滯留性的熒光示蹤圖像及分析Fig. 4 Fluorescent tracer images showing ocular surface retention of insulin in rabbit eyes (A,fluorescein sodium staining,×1)and fluorescence area analysis curves(B)in each group.

2.4 兔角膜滲透性示蹤

尼羅紅標(biāo)記的T-LPs/INS與尼羅紅稀釋液分別滴入兔眼結(jié)膜囊不同時(shí)間后進(jìn)行處理做成角膜冰凍切后皆在熒光顯微鏡下觀察到熒光顯色，圖5A為滴眼后45 min，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組角膜熒光積累量的示蹤對(duì)比。開始主要集中在角膜上皮層面，隨著時(shí)間的推移，TLPs/INS開始逐漸向角膜基質(zhì)層滲透并不斷累積，而對(duì)照組則停留在淺層角膜上皮組織。

圖5 各組在兔眼角膜的冰凍切片圖像及分析Fig. 5 Frozen section images of the cornea(A,Nile red and DAPI staining,×200) and fluorescence penetration area (B) in each group(****P<0.0001 vs INS).

2.5 局部兔眼藥代動(dòng)力學(xué)

滴眼后，實(shí)驗(yàn)組兔眼角膜中INS藥物濃度于1 h達(dá)到峰值，之后隨時(shí)間的推移呈逐步下降的趨勢(shì)，對(duì)照組兔眼中角膜INS 藥物濃度則隨著時(shí)間推移呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)（圖6）。點(diǎn)藥后0.1、0.25、0.75、1、2 h兩組兔眼角膜組織INS濃度相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在點(diǎn)眼后2.5、4.5、6 h對(duì)照組兔眼角膜中的INS濃度低至無法檢測。

圖6 滴眼后不同時(shí)間各組兔眼角膜中胰島素濃度變化Fig. 6 Changes in insulin concentration in the cornea in each group at different times after eye dropping (Data are shown as Mean±SD,n=3).

通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析，各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示。實(shí)驗(yàn)組單次點(diǎn)眼后角膜藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax為1 h，Cmax為52.137 mIU/g，實(shí)驗(yàn)組的T?為1.306 h約為對(duì)照組T?的2倍、AUC0-t是138.189 mIU/g*h約為對(duì)照組的13倍、MRT0-t為2.117 h約為對(duì)照組的3倍，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合分析發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組角膜INS濃度變化符合二室模型，對(duì)照組則符合一室模型。

表1 各組兔眼角膜中胰島素藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit cornea in T-LPs/INS and insulin groups

滴眼后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔眼房水中INS藥物濃度均在0.75 h達(dá)到峰值，之后隨著時(shí)間的推移，兔眼房水中的INS藥物濃度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)（圖7）。點(diǎn)藥后0.1 h兩組兔眼房水組織INS濃度相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），點(diǎn)眼后0.25、0.75、1、2 h兩組兔眼房水INS濃度相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在點(diǎn)眼后2.5、4.5、6 h 對(duì)照組兔眼房水中的INS 濃度低至無法檢測。

圖7 滴眼后不同時(shí)間各組兔眼房水中胰島素濃度變化Fig. 7 Changes in insulin concentration in the aqueous humor of rabbits in each group at different times after eye dropping(Mean±SD,n=3).

通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析，各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下表2。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組單次點(diǎn)眼后兔眼房水Cmax分別為12.160 mIU/mL、2.454 mIU/mL，可以看出實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組提高了4倍；實(shí)驗(yàn)組兔眼房水的藥物T?為1.746 h，與對(duì)照組為相比提高了2倍；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔眼房水的AUC0-t分別為27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/mL*h，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組的AUC0-t約提高了9倍；實(shí)驗(yàn)組房水的MRT0-t為2.062 h約是對(duì)照組的2倍。通過藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合分析得出實(shí)驗(yàn)組兔眼房水INS濃度變化符合二室模型，對(duì)照組則符合一室模型。

表2 各組兔眼房水中胰島素藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacokinetic parameters of insulin in rabbit aqueous humor of various groups

3 討論

本研究以逆向蒸發(fā)法制備出TPGS修飾的載胰島素脂質(zhì)體，并考察了T-LPs/INS的表征、體外安全性及在兔眼角膜的滲透性及局部藥代動(dòng)力學(xué)。從表征的結(jié)果來看，其粒徑適中性質(zhì)穩(wěn)定，微觀形態(tài)呈均勻分布的圓形，與Peng等［19,20］結(jié)果一致。安全性對(duì)新型眼部制劑的潛在應(yīng)用至關(guān)重要，脂質(zhì)體作為近年來新興的藥物載體，相關(guān)研究表明脂質(zhì)體包被藥物之后降低藥物對(duì)眼部組織的刺激，可減輕眼部各組織的毒副作用［21-23］，而在本研究中我們也通過多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)初步評(píng)估驗(yàn)證了T-LPs/INS的安全性，活/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示經(jīng)過藥物共孵育后，HCECs仍然大量存活并且活力良好。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)T-LPs/INS的安全濃度可達(dá)到200 μg/mL（約對(duì)應(yīng)于6 IU/mL），而Cruz-Cazarim［24］研究中胰島素治療干眼綜合征模型下角膜損傷的有效濃度為35 μg/mL（對(duì)應(yīng)于1 IU/mL），因此我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)制備的T-LPs/INS是相對(duì)安全的，可適用于局部滴眼實(shí)驗(yàn)。

載藥系統(tǒng)給藥能到達(dá)特定細(xì)胞累積被其有效攝取利用才能起到作用。藥物通過被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)擴(kuò)散等方式滲透角膜，而角膜由5層結(jié)構(gòu)組成：上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層、內(nèi)皮層，呈現(xiàn)特有的脂溶性-水溶性-脂溶性夾心結(jié)構(gòu)，藥物滲透角膜過程中，角膜上皮的緊密連接是影響藥物吸收的重要屏障［25,26］。我們可以直觀的觀察到T-LPs/INS滴眼液滲透進(jìn)入角膜深層的藥物濃度相對(duì)更高，具有良好的促進(jìn)藥物在角膜滲透吸收的作用，這也將保證藥物能夠到達(dá)角膜各層并被角膜細(xì)胞有效攝取發(fā)揮作用。藥物眼表滯留研究中，由于TLPs/INS具有緩釋性能，相較于單純的胰島素滴眼液其在眼表滯留特性更好，這將會(huì)使得T-LPs/INS能較好的克服傳統(tǒng)局部滴眼液由于快速流失、利用率低導(dǎo)致的缺陷并降低頻繁滴眼所帶來的副作用。在眼部藥動(dòng)學(xué)研究中，藥代動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，T-LPs/INS滴眼液與胰島素滴眼液對(duì)兔眼進(jìn)行點(diǎn)眼后測量不同時(shí)間點(diǎn)的角膜、房水中胰島素藥物的濃度，幾乎都是使用T-LPs/INS滴眼的組中相對(duì)更高。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行藥代學(xué)擬合分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔在單次點(diǎn)眼后角膜的T?分別為1.306 h、0.661 h，房水的T?分別為1.746 h、0.537 h，實(shí)驗(yàn)組角膜的T?約為對(duì)照組的2倍、房水的T?約為對(duì)照組的3倍，說明脂質(zhì)體納米載藥系統(tǒng)可以延長藥物半衰期［27］，可通過減少用藥頻率進(jìn)而減少藥物不良反應(yīng)及提高患者順應(yīng)性；兩組兔在單次點(diǎn)眼后角膜的AUC0-t分別為138.189 mIU/g*h、10.637 mIU/g*h，房水的AUC0-t分別為27.491 mIU/mL*h、2.883 mIU/L*h，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組角膜的AUC0-t增加了12倍、房水的AUC0-t增加了9倍，這說明T-LPs/INS促進(jìn)了藥物在眼部吸收與滯留，呈現(xiàn)出明顯的緩釋作用與長效性［28］。在給藥時(shí)由于眼局部結(jié)構(gòu)的多重屏障［29,30］單純的胰島素滴眼液局部點(diǎn)眼后的藥物的角膜滲透性較差，在角膜累積量也甚微，在眼部應(yīng)用生物利用率極低，這也很難達(dá)到有效的治愈角膜疾病的效果，而我們的研究中實(shí)驗(yàn)組角膜與房水的藥物濃度與對(duì)照組相對(duì)比有顯著提高，這也說明TLPs/INS減少了藥物流失、提高了在角膜中藥物濃度的維持時(shí)間，使得藥物在角膜組織的累計(jì)相對(duì)提高。角膜與房水藥物濃度對(duì)比明顯累積量較大，這表明T-LPs/INS延緩藥物進(jìn)入房水，也說明藥物從脂質(zhì)體中緩釋主要通過作用于角膜吸收而發(fā)揮治療效果，這提示TPGS修飾的胰島素脂質(zhì)體滴眼液對(duì)基本角膜損傷甚至角膜深層結(jié)構(gòu)抗炎、抗凋亡等的作用可能達(dá)到相對(duì)理想的效果，這也與Alkholief等［31,32］結(jié)果一致。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)擬合分析得出實(shí)驗(yàn)組兔眼角膜、房水INS濃度變化符合二室模型，對(duì)照組則符合一室模型，單純藥物進(jìn)入組織時(shí)很快分布并達(dá)到平衡，而以修飾的脂質(zhì)體包裹藥物后進(jìn)入組織，我們推測脂質(zhì)體包裹藥物后由于對(duì)藥物的緩釋作用，使得藥物轉(zhuǎn)運(yùn)分布的速率不一致，同時(shí)使藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)也出現(xiàn)明顯改變。

綜上所述T-LPs/INS相對(duì)單純胰島素滴眼液有效性會(huì)更好。同時(shí)由于其生物利用度提高，可以減少給藥頻率，更有利于增加患者依從性，這為進(jìn)一步使用胰島素治療角膜疾病的應(yīng)用及臨床研究提供初步理論基礎(chǔ)，但本實(shí)驗(yàn)研究仍存在局限性，檢測不同時(shí)間點(diǎn)的兔眼虹膜、晶體等眼部組織中藥物濃度時(shí)，由于藥物濃度極低，未能完全檢測出；并未設(shè)計(jì)檢測血液樣品藥物濃度，盡管由于血-眼屏障的存在，通過局部給藥進(jìn)入全身循環(huán)的量甚微，今后應(yīng)注意完善實(shí)驗(yàn)檢測方法及數(shù)據(jù)分析。