石文惠，劉小蓮，張貴明，葉林萱，周潤華，李亦蕾，余 樂

南方醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院藥物設(shè)計與發(fā)現(xiàn)研究創(chuàng)新群體，2南方醫(yī)院臨床藥學(xué)中心，廣東 廣州510515

皮膚黑色素瘤（CM）是一種復(fù)雜的疾病，其特征是具有高度的異質(zhì)性，這也使它成為最具有侵襲性的癌癥類型之一［1］。盡管皮膚黑色素瘤在所有類型的皮膚癌中只占少數(shù)，但它在全世界造成的皮膚癌相關(guān)死亡人數(shù)最多［2］。皮膚黑色素瘤的患者群體是45%的女性（n=83）和55%的男性（n=102）。整個年齡分布范圍是21～92歲，平均年齡為56歲（中位數(shù)60）［3］。通過對331例原發(fā)性和/或轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤的DNA、RNA和蛋白質(zhì)進行分析，描述了皮膚黑色素瘤的基因組改變情況。同時建立了一個基因組分類框架，將基因組分為四個突變亞型：突變的BRAF、突變的RAS、突變的NF1和Triple-WT（野生型）［4］。BRAF突變導(dǎo)致皮膚黑色素瘤的發(fā)生占比達到35%～50%［5］。此外，攜帶BAP1突變的皮膚黑色素瘤患者總體生存時間顯著減少。因此，開發(fā)或發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)抑制劑從而改善皮膚黑色素瘤患者的生存率依然是研究的重點。

BAP1是一個抑癌基因，它是泛素羧基末端水解酶家族的一個成員［6,7］。BAP1蛋白存在多個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域與特定的蛋白或者細胞因子結(jié)合參與相關(guān)過程，例如染色質(zhì)重塑、DNA損傷、細胞周期等等［8］。許多疾病的發(fā)生與BAP1突變相關(guān)，其中包括葡萄膜黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、腎細胞癌、惡性間皮瘤等［9］。BAP1的突變主要表現(xiàn)為失活突變，即蛋白表達缺失或失去功能。在皮膚黑色素瘤中，BAP1發(fā)生突變之后往往使得患者的預(yù)后更差［10］。

腫瘤凋亡和p53再生化合物（RITA）是新近發(fā)展起來的一種潛在的抑癌小分子藥物，在腫瘤生長抑制、誘導(dǎo)凋亡中表現(xiàn)出高效性［11,12］。研究表明，在機體內(nèi)，RITA與p53靶向結(jié)合，使得p53不能被Mdm2泛素化，促進p53的累積，恢復(fù)腫瘤細胞里p53的凋亡誘導(dǎo)功能［13,14］。先前關(guān)于小分子抑制劑RITA的研究主要包括RITA在結(jié)直腸癌和頭頸癌中一方面通過激活p53，使p53的表達水平升高，從而導(dǎo)致細胞生長受到抑制以及細胞死亡，另一方面RITA還引起細胞發(fā)生凋亡從而起到抗腫瘤作用［15-17］。除此之外還有部分研究表明RITA通過獨立于p53的其他通路起到抗腫瘤作用，例如在間皮瘤研究中發(fā)現(xiàn)它通過JNK通路起抗腫瘤作用［18］。

本研究通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除BAP1基因后得到的皮膚黑色素瘤細胞M14 BAP1 KO#1克隆及其親代M14細胞組成同基因型細胞模型，利用該細胞模型篩選化合物庫中對BAP1敲除細胞具有選擇性抑制活性的小分子化合物。篩選結(jié)果表明RITA在皮膚黑色素瘤細胞中對BAP1基因野生型以及缺失型存在敏感性差異，該表型目前還沒有相關(guān)文章發(fā)現(xiàn)。因此我們針對該表型進行更全面的研究，旨在于為存在BAP1失活突變的皮膚黑色素瘤患者探索個體化治療藥物。

1 材料和方法

1.1 材料

M14、A375、B16-F10 三株皮膚黑色素瘤細胞和HEK-293T 細胞由加州大學(xué)圣地亞哥分校藥理系管坤良教授實驗室饋贈。M14、B16-F10 培養(yǎng)基為RPMI 1640（Gibico），A375、HEK-293T培養(yǎng)基為DMEM（Gibico）。胎牛血清（ExCell Bio）。將single guide RNA（sgRNA）序列克隆到質(zhì)粒px459 v2（Addgene#62988）或lentCRISPR v2（Addgene#52961）中。BAP1敲 除Guide RNA 序列（5' to 3'）分別為gRNA2：ACCCACCCTGAGTCGCATGA，gRNA3：TGAAGT CCTTCATGCGACTC?；衔飵旆謩e有L1200-Epigenetics Compound Library，L1000-Approved Drug Library 和 L4000-Bioactive Compound Library（TargetMol）。BAP1（C91S和K116K）點突變構(gòu)建物是使用Q5熱啟動高保真DNA聚合酶（新英格蘭生物實驗室）和以下引物通過定點突變產(chǎn)生的：C91S-BAP1-正向，5'-ACCACACTCTAGCAACTCATGC-3'；C91SBAP1-反向，5'-ATCAGCTGGTGGCAAAG-3'；K116KBAP1 正向，5'-GTCGAATGACTTCACCAAGGTTTT AG-3'，K116K-BAP1 反向，5'-TCAGGTGTCCAGGT-3'；細胞轉(zhuǎn)染試劑PolyJetTMTransfection Reagent（SignaGen）。嘌呤霉素（Invitrogen）、潮霉素（Sigma）。MTT 噻唑藍（Amresco）。細胞周期檢測試劑盒（DOJINDO）。Annexin V-APC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物）。GAPDH 抗體（sc-25778R，Santa Cruz）、BAP1抗體（sc-28383，Santa Cruz）和鼠源BAP1抗體（ab199396，Abcam），H2AK119ub1 抗體（XP-R 8240s，Cell Signaling Technology），p53 抗體（sc-126，Santa Cruz），二抗羊抗鼠、二抗羊抗兔（弗德生物）。ECL化學(xué)發(fā)光底物（捷倍斯）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建CRISPR/Cas9 載體 通過網(wǎng)站（http://chopchop.cbu.uib.no）設(shè) 計 CRISPR Guide RNA（gRNA）序列，每種基因選擇評分最高的前三條gRNA。通過常規(guī)限制性內(nèi)切酶方法，將gRNAs克隆至CRISPR/Cas9 非病毒載體px459 以及慢病毒載體lentiCRISPR v2上面，測序顯示連接成功后，擴增提取構(gòu)建成功的質(zhì)粒，置-20 ℃冰箱保存。之所以優(yōu)先選擇非病毒載體是因為它能夠篩選到靶基因敲除的單克隆細胞，并且這些細胞的基因組整合上Cas9和gRNA序列的概率比較低，對于嘌呤霉素依然存在敏感性。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率極低的情況下，我們選擇慢病毒系統(tǒng)。本課題中B16-F10 BAP1敲除的細胞是采用轉(zhuǎn)染非病毒載體px459挑單克隆的方法得到的，M14 BAP1敲除是以慢病毒載體lentiCRISPR v2 進行單克隆挑選，而A375 BAP1 敲除的細胞則是通過慢病毒載體lentiCRISPR v2進行感染后直接進行后續(xù)實驗。

1.2.2 篩選BAP1敲除的CM細胞株/細胞群

1.2.2.1 非病毒載體px459 單克隆挑選 將1 μg 的px459-BAP1gRNA重組質(zhì)粒通過polyJet轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)入B16-F10細胞，轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)于含1μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基。對經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的存活的細胞進行Western blot驗證BAP1蛋白下調(diào)后，通過流式細胞儀將細胞分選至96孔板培養(yǎng)（每孔1個細胞），待單個細胞長成細胞群后將其分成兩部分，分別轉(zhuǎn)移到24孔板培養(yǎng)。24 孔板的細胞長至80%左右提蛋白進行Western blot驗證BAP1蛋白及其下游蛋白H2A K119位的泛素化情況。

1.2.2.2 慢病毒載體lentiCRISPR v2 進行BAP1 敲除取對數(shù)生長的HEK-293T細胞，將包裝質(zhì)粒PsPAX和PMD2.G以及pLentiCRISPR v2（vector和BAP1 g2/g3）以1∶1∶2的比例進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后換2 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清以0.45μm的微孔濾膜過濾，收集慢病毒液。將M14，A375細胞分別以1×105/孔接種于6孔板中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，在收集的慢病毒濾液中加入促感染試劑Polybrene（1∶2000），混勻后，去除六孔板中靶細胞上清液，每孔加入2 mL相應(yīng)的慢病毒感染靶細胞，陰性對照孔不做處理。6～8 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。感染24 h后，將6孔板的細胞轉(zhuǎn)移至10 cm大皿，待細胞貼壁后更換含1μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。當對照組細胞被嘌呤霉素全部殺死后，更換為正常全培培養(yǎng)細胞。Western blot 驗證BAP1蛋白下調(diào)后以及其相對應(yīng)的組蛋白H2A第119位泛素化增加，進行后續(xù)實驗（A375細胞是直接用該細胞群進行MTT實驗；M14細胞則是通過流式分選成單個細胞，之后的方法與非病毒載體px459單克隆挑選的后續(xù)步驟一致）。

1.2.3 小分子化合物篩選 篩選的化合物庫分別有L1000、L1200和L4000，L1000化合物庫是上市化合物庫，包含的化合物具有已知的和良好表征的生物活性、安全性和生物利用度；L1200化合物庫是表觀遺傳庫，收集表觀遺傳相關(guān)的活性小分子，適用于表觀遺傳學(xué)研究，可用于高通量、高內(nèi)涵篩選；L4000是經(jīng)典已知活性化合物庫，它是具有生物活性，能引起細胞、組織甚至個體生物學(xué)反應(yīng)的化合物的集合。將處于對數(shù)生長期，且生長狀態(tài)良好的M14和M14 BAP1 KO#1兩組細胞接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，2000/孔。接種細胞24 h開始藥物處理，設(shè)置實驗組（1∶1000稀釋化合物）和對照組（0.1%DMSO）。藥物處理6 d后，MTT檢測并計算兩組細胞的存活率（存活率=化合物作用下的吸光度值/對照組的吸光度值），用Fold change表示化合物對M14細胞的選擇性，計算公式為：Fold change=存活率（M14 BAP1 KO）/存活率（M14），F(xiàn)old Change越大，藥物對M14細胞的選擇性抑制作用越強。將篩選得到的FC≥2的小分子化合物RITA設(shè)置10、3、1、0.3μmol/L的濃度梯度作為實驗組，對照組僅含有0.1%DMSO的培養(yǎng)基，配制后分別加入孔板中。藥物處理6 d后，MTT檢測并計算各組細胞的存活率，通過細胞存活曲線，檢驗藥物的選擇性是否有濃度依賴性。

1.2.4 構(gòu)建過表達載體 我們自Transomic 公司購買pOTB7-BAP1質(zhì)粒，通過PCR擴增BAP1全長，通過常規(guī)性限制性內(nèi)切酶的方法，將擴增產(chǎn)物克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIH，得到pQCXIH-BAP1質(zhì)粒。需要說明的是，通過慢病毒CRISPR/Cas9系統(tǒng)得到的BAP1 KO單克隆會持續(xù)表達Cas9蛋白和gRNA，所以在表達外源性BAP1時很可能也會被CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯，造成外源性表達的失敗。因此，對于M14 BAP1 KO 單克隆，我們通過密碼子的簡并性，在不影響編碼的氨基酸的前提下，引入同義突變，破壞gRNA對應(yīng)的PAM序列，從而達到成功表達外源性BAP1 的目的。對于BAP1 PAM序列點突變，我們是將BAP1第348位堿基由G突變成A，而該位點（第116位）氨基酸未改變，仍為賴氨酸（K），得到BAP1 K116K。將BAP1第91位氨基酸由C突變?yōu)镾，得到突變體BAP1 C91S。通過NEB在線軟件（http://nebasechanger.neb.com/）設(shè)計導(dǎo)入點突變的引物，根據(jù)Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit（NEB）說明書，以pQCXIH-BAP1wt為模板，通過PCR反應(yīng)引入點突變，最后將質(zhì)粒測序以確認引入了正確的點突變。

1.2.5 挽救實驗驗證BAP1 KO 細胞對RITA 的選擇性 取對數(shù)生長期的HEK-293T 細胞，胰酶消化，1200 r/min離心2 min，去除上清，重懸細胞計數(shù)，以5×105/孔的細胞密度接種于6孔板中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后進行轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染：取3支1.5 mL無菌EP管，各加入50 μL不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，按照下表配制質(zhì)粒混合物。另取1支無菌EP管，加入150 μL不含血清和培養(yǎng)基的DMEM培養(yǎng)基，再加入16.2 μL的PolyJet轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后分別取50 μL至3管質(zhì)?；旌衔镏?，混勻，瞬離，室溫靜置15 min，按照100 μL/孔逆時針方向逐滴加入六孔板中的HEK-293T中進行轉(zhuǎn)染，輕輕晃勻后置于37 ℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，吸去上清，每孔加入1.5 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基（10%FBS，1%PS），繼續(xù)培養(yǎng)，再分別收集24 h、48 h、72 h的上清于15 mL離心管中。將病毒上清以0.45 μm微孔濾膜過濾，收集濾液于-80 ℃冰箱備用。在上述收集第48 h病毒上清時，取對數(shù)生長期M14 BAP1 KO細胞，消化離心后，去除離心，重懸細胞計數(shù)，以0.5×105/孔接種于12 孔板中。24 h后，收集完72 h病毒即可感染。取逆轉(zhuǎn)錄病毒與新鮮RPMI 1640全培以1∶1比例混勻，加入促感染試劑Polybrene（1∶2000），充分混勻，取1 mL 加入相應(yīng)的12孔板與靶細胞共孵育，6～8 h后更換新鮮全培。感染24 h后，將12孔板的細胞消化，轉(zhuǎn)移至6孔板，待細胞貼壁后加入含有500 μg/mL hygromycin的全培培養(yǎng)細胞，當對照組細胞被hygromycin全部殺死后，進行Western blot驗證BAP1以及BAP1 C91S的過表達情況。

1.2.6 流式檢測RITA對細胞的周期阻滯 取對數(shù)生長的M14 WT和M14 BAP1 KO的細胞，以1×105/孔細胞密度接種于6孔板中，兩種細胞各鋪9個孔。24 h后，以RPMI 1640全培稀釋RITA母液，配置濃度為1 μmol/L和3 μmol/L的RITA藥物濃度（現(xiàn)配現(xiàn)用），每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。取出6孔板，去上清，將藥物加入對應(yīng)的孔中，置于37 ℃含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。按照周期試劑盒（DOJINDO）操作流程處理后，流式細胞儀（BD FACSCanto Ⅱ）檢測細胞周期阻滯情況。

1.2.7 Annexin Ⅴ-FITC 染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長細胞M14，M14 BAP1 KO#1細胞，以1×105/孔接種于6孔板中，兩種細胞各鋪9個孔。24 h后，以RPMI-1640全培稀釋RITA母液，配制濃度為1 μmol/L和10 μmol/L的RITA藥物溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），每種細胞設(shè)置3個濃度（0、1、10 μmol/L），每個濃度3個復(fù)孔。取出6孔板，去除上清液后，加入配制好的藥液。藥物處理96 h后，按照Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒（Beyotime）操作流程處理，流式細胞儀（BD FACSCanto Ⅱ）檢測細胞凋亡情況。

1.2.8 Western blotting 取一定數(shù)量的細胞懸液至1.5 mL EP管中離心，加入一定量的1×Simple Buffer進行裂解，金屬水浴鍋105 ℃煮10 min，冷卻至室溫后進行Western blot驗證。在電泳的過程中，調(diào)整濃縮膠和分離膠的電壓分別為80 V和120 V；PVDF膜轉(zhuǎn)印時電壓為100 V；封閉時為5%的脫脂奶粉1 h；孵育一抗（4 ℃過夜），然后二抗孵育1 h，每次孵育后均用TBST洗滌3次，10 min/次，最后進行顯影。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 運用GraphPad Prism軟件對MTT實驗數(shù)據(jù)進行分析，細胞周期、細胞凋亡用Flowjo軟件進行處理。用Excel進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗對兩樣本進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本文中MTT實驗、細胞周期實驗、細胞凋亡實驗重復(fù)次數(shù)為3次（n=3），Western blot實驗重復(fù)次數(shù)為2次（n=2）。

2 結(jié)果

2.1 化合物庫篩選結(jié)果

用M14 BAP1 KO#1和親代M14細胞組成BAP1缺失突變和野生型的同基因型細胞，通過MTT法從已知活性化合物庫（L1000/L1200/L4000）（圖1A）中篩選對野生型細胞和BAP1缺失突變細胞具有敏感性差異的化合物，篩選濃度為10 μmol/L，處 理M14 和M14 BAP1 KO#1兩組細胞6 d后比較細胞活力。結(jié)果顯示化合物庫L4000 中存在15 個化合物在M14 和M14 BAP1 KO#1 細胞中具有敏感性差異（Fold change≥2），其中p53激活劑RITA對M14 BAP1缺失細胞的選擇性抑制作用最明顯（圖1B）。

圖1 已知活性化合物庫的組成及篩選結(jié)果Fig. 1 Screening of compounds(A)that selectively inhibit M14 cells compared to M14 BAP1 KO#1 clone(B).

2.2 RITA可選擇性殺傷BAP1缺失突變的皮膚黑色素瘤細胞

通過化合物庫篩選發(fā)現(xiàn)RITA對M14 BAP1 KO#1細胞存在選擇性殺傷作用后，進一步對另外兩株皮膚黑色素瘤細胞B16-F10和A375及其對應(yīng)的BAP1敲除的細胞也同樣加藥處理，發(fā)現(xiàn)都存在BAP1敲除后細胞相對于BAP1野生型的細胞對RITA更敏感的情況（圖2）。

圖2 M14/B16-F10/A375中BAP1敲低效果以及RITA對BAP1野生型和敲除后的敏感性差異Fig. 2 Expression of BAP1 and ubiquitination of its downstream histone H2A in M14,B16-F10 and A375 cells with BAP1 knockout(A)and RITAsensitivity to BAP1 wild-type and knockout cells detected using MTT assay(B).

2.3 在M14 BAP1敲除單克隆細胞上過表達BAP1起到挽救的作用

在M14 BAP1 KO#1/#2 細胞上面過表達野生型BAP1 以及去泛素化酶失活的突變型BAP1（C91S）（圖3A、C），進行MTT實驗發(fā)現(xiàn)，過表達BAP1野生型的細胞其敏感性恢復(fù)到和M14細胞差不多，而過表達BAP1 C91S突變型的細胞敏感性幾乎沒有改變（圖3B、D）。

圖3 過表達BAP1野生型及BAP1 C91S突變型敏感性變化Fig. 3 Rescue effect of BAP1 overexpression on RITA sensitivity in BAP1 knockout M14 cells. A: BAP1 expression in the cells. B: Rescue effect of BAP1 overexpression on RITA sensitivity of the cells.

2.4 RITA引起細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯

RITA發(fā)揮其抗腫瘤作用與其能夠引起細胞發(fā)生周期阻滯密切相關(guān)。對M14及M14 BAP1敲除的細胞加RITA處理48 h后，通過流式檢測發(fā)現(xiàn)，BAP1敲除的細胞G2/M阻滯現(xiàn)象較野生型明顯（P<0.0001，圖4）。

2.5 RITA引起細胞發(fā)生凋亡

RITA發(fā)揮其抗腫瘤作用除了與細胞周期阻滯相關(guān)之外，還與其引起細胞發(fā)生凋亡相關(guān)。在M14及M14 BAP1敲除的細胞上加RITA處理96 h后，流式檢測發(fā)現(xiàn)，BAP1敲除的細胞凋亡現(xiàn)象明顯，而野生型細胞幾乎沒有凋亡的發(fā)生（P<0.0001，圖5）。

圖5 流式檢測RITA引起M14 WT以及M14 BAP1 KO#1凋亡Fig. 5 Flow cytometric analysis of apoptosis of RITA-treated wild-type and BAP1 knockout M14 cells(M14 BAP1 KO#1).***P<0.0001 vs M14 WT group.

2.6 BAP1敲除后p53蛋白水平升高，RITA增加p53的表達

在對BAP1野生型的細胞進行BAP1敲除后發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子p53 的表達增加。對M14 WT/BAP1 KO#1加RITA處理48 h后，p53的蛋白水平進一步升高。BAP1敲除的細胞相對于野生型細胞加藥處理后，其p53表達水平更高（圖6），

圖6 敲除BAP1基因后，p53的蛋白表達情況以及加RITA處理后p53在蛋白水平上的變化情況Fig. 6 Expression of p53 in melanoma cells with BAP1 knockout and RITA treatment.A:Expression of p53 increases after BAP1 knockout in M14,B16-F10 and A375 cells.B:RITA treatment for 48 h increases p53 expression in M14 WT and BAP1 KO#1 cells.C,D:Quantitative analysis of p53 expression in different groups.

3 討論

在大多數(shù)情況下，黑色素瘤發(fā)生是一個線性多階段的腫瘤發(fā)生過程，從痣和/或中間性病變開始，進而發(fā)展為發(fā)育不良性腫瘤，然后發(fā)展為浸潤性腫瘤和轉(zhuǎn)移［19］。皮膚黑色素瘤的屬性是高水平的突變負擔(dān)和結(jié)構(gòu)重排與突變特征的紫外線（紫外線）暴露［20］。盡管多數(shù)患者在診斷時就已患有局部疾病，并且通過手術(shù)切除原發(fā)腫瘤而治愈，但許多患者發(fā)展為轉(zhuǎn)移瘤，這些患者中的大多數(shù)將死于與黑色素瘤相關(guān)的原因［21］。皮膚黑色素瘤中BAP1突變頻率比較高，我們通過構(gòu)建BAP1敲除的細胞與其BAP1野生型的同基因型細胞模型進行化合物庫篩選，最終選擇在BAP1野生型及BAP1敲除細胞中敏感性差異最大的小分子抑制劑RITA。進一步探究RITA引起的敏感性差異是否與基因BAP1相關(guān)，于是我們在BAP1敲除的單克隆細胞上面過表達BAP1野生型及其去泛素化酶失活的突變型BAP1（C91S），發(fā)現(xiàn)過表達BAP1野生型能夠逆轉(zhuǎn)BAP1敲除細胞對RITA的敏感性，而過表達去泛素化酶失活的突變型BAP1（C91S）則沒有逆轉(zhuǎn)效果，這說明該敏感性差異的發(fā)生與BAP1去泛素化酶活性直接相關(guān)。

小分子抑制劑RITA發(fā)揮其抗腫瘤活性主要是通過激活抑癌基因p53以及誘導(dǎo)細胞發(fā)生周期阻滯、凋亡等來起到抑制腫瘤細胞生長［13,22］。p53在細胞應(yīng)激反應(yīng)中誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡，該蛋白的修飾對其穩(wěn)定性以及下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活非常重要［23］。在本研究中我們通過流式檢測M14 WT及其BAP1 KO#1細胞加RITA處理48h后，發(fā)現(xiàn)RITA引起G2/M期阻滯［24］。細胞周期是控制組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要生理過程，發(fā)生周期阻滯會影響并激活一些復(fù)雜的通路引起細胞死亡［25,26］。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)，BAP1敲除的細胞加藥處理后，其G2/M期阻滯情況相對于野生型細胞更加明顯。該結(jié)果在一定程度上說明，RITA對M14 BAP1敲除的細胞更具有殺傷力的原因可能與它引起的周期阻滯有關(guān)。在腫瘤細胞中，與RITA起到抑制腫瘤生長密切相關(guān)的還有細胞凋亡［27］。我們通過流式檢測M14 WT 以及BAP1 KO#1細胞加RITA處理96 h后，發(fā)現(xiàn)BAP1 KO#1細胞有明顯的凋亡發(fā)生，而野生型細胞幾乎沒有。根據(jù)凋亡檢測的結(jié)果可以初步認為M14 BAP1敲除的細胞對RITA更敏感與RITA引起細胞發(fā)生凋亡存在一定關(guān)系。從以上對細胞周期以及凋亡的檢測結(jié)果來看，RITA發(fā)揮其抗腫瘤活性與BAP1是否缺失以及細胞周期、細胞凋亡存在一定關(guān)系。最后，由于RITA是抑癌基因p53的激活劑，我們通過Western blot檢測p53蛋白的表達情況。最終發(fā)現(xiàn)，敲除BAP1后，p53的表達增加，在此基礎(chǔ)上進行加藥處理，發(fā)現(xiàn)BAP1敲除細胞p53增加情況較BAP1野生型細胞更明顯。我們目前認為，RITA對BAP1敲除的腫瘤細胞更具有殺傷力有可能是因為BAP1 敲除之后p53 的表達量增加了，在這個時候?qū)AP1野生型以及BAP1敲除的細胞加p53的激活劑處理，會使原本p53表達量高的細胞p53增加得更多，抑制腫瘤生長的作用更加明顯。但是，這個作用機制是否真的與我們的猜測相符合還需要后續(xù)深入研究進一步證明。綜上所述，本研究是利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建BAP1敲除的單克隆細胞，篩選出對BAP1突變型的皮膚黑色素瘤細胞更敏感的小分子抑制劑RITA。小分子抑制劑RITA對BAP1突變皮膚黑色素瘤細胞更具有殺傷力表型的發(fā)現(xiàn)，為臨床上BAP1突變皮膚黑色素瘤患者提供一個潛在的治療藥物。除了發(fā)現(xiàn)上述表型外，本研究也初步證明了RITA對BAP1敲除腫瘤細胞更敏感的相關(guān)因素，為后續(xù)進行探究的機制提供思路。本文最主要的研究目的在于為攜帶BAP1突變的皮膚黑色素瘤患者提供個體化治療藥物，改善臨床上BAP1突變皮膚黑色素瘤患者的預(yù)后。