葛 菲，萬夢琪，程振宇，陳雪雷，陳芊伊，戚之琳

皖南醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2活性生物大分子安徽省重點實驗室，3藥學(xué)院，4臨床學(xué)院，安徽 蕪湖241002

胃癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的第3大原因，95%以上的胃癌是腺癌，患者由于缺少早期診斷指標(biāo)，一旦發(fā)現(xiàn)均為中晚期，且易于轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其治療效果相對較差［1,2］。因此，早期診斷是改善胃癌預(yù)后的關(guān)鍵。雖然有研究表明，血清生物標(biāo)志物，包括血清DNA甲基化、各種RNA、胃蛋白酶原、胃泌素、MG7-Ag和CA724對胃癌的診斷具有一定的價值，但到目前為止，尚缺乏理想的胃癌生物標(biāo)志物［3］。

高遷移族盒蛋白1（HMGB1）是一個高度保守的非組蛋白核蛋白，根據(jù)亞細胞定位不同，具有多種生物學(xué)功能。在胞核內(nèi)，可維持染色體的結(jié)構(gòu)與功能；在胞質(zhì)，可促進自噬；在胞外，可作為信號分子，通過與多種受體作用，調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤和免疫反應(yīng)［4,5］。我們已有的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可調(diào)控胃癌細胞的凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移［6,7］，以HMGB1為靶點可能是胃癌的早期診斷和治療的策略之一。以HMGB1為靶點的抗腫瘤研究，引起了很多科研工作者的關(guān)注［8,9］。

蘆薈苷，一種從植物蘆薈中提取的天然活性物質(zhì)，具有較好的抗腫瘤活性［10,11］。如100 μmol/L蘆薈苷可明顯抑制非小細胞肺癌A549細胞的活力，誘導(dǎo)G2/M期阻滯［12］；蘆薈苷通過調(diào)控MAPKs信號通路的激活，誘導(dǎo)胃癌MKN-28和HGC-27細胞的凋亡［13］；蘆薈苷亦能夠通過PI3K-AKT信號通路抑制NCI-N87細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡［14］。本課題組前期研究亦表明，蘆薈苷能夠調(diào)控胃癌細胞的增殖、遷移［15］，然而，蘆薈苷能否通過調(diào)控HMGB1的表達，影響胃癌的增殖和遷移尚不明確。本實驗從細胞和動物水平探討蘆薈苷靶向HMGB1抑制胃癌細胞增殖、遷移的分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和抗體

蘆薈苷（Aloin，ALO，純 度: 99.8%）（Selleck Chemicals），HMGB1 和GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology），Cyclin B1，Cyclin E1，MMP-2，MMP-9，E-cadherin，p-STAT3（S727）抗體（ABclonal），CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），EdU試劑盒（銳博生物公司），Transwell小室（Millipore），總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），cDNA合成及qPCR檢測試劑盒（莫納生物）。

1.2 細胞培養(yǎng)

MGC-803胃癌細胞購自合肥志偉生物科技有限公司，用含10%胎牛血清（Lonsera，烏拉圭），1%青霉素-鏈霉素（碧云天）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測細胞活力

MGC-803細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板（Corning），密度為2×104/孔。細胞分為對照組和實驗組，對照組加入PBS，實驗組用不同濃度的蘆薈苷組（100、200、300 μg/mL）處理，每組3個復(fù)孔。待細胞完全貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)基，分別加入蘆薈苷和PBS 處理細胞24 h，同時設(shè)置空白組（無細胞的完全培養(yǎng)基）。之后加入CCK-8工作液10 μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)2～4 h。使用全波段酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量各孔的吸光度（A），細胞活力按如下公式計算：細胞存活率（%）=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100。

1.4 EdU實驗檢測細胞增殖能力

MGC-803細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，細胞分組同上。不同濃度蘆薈苷分別處理細胞24 h后，進行EdU實驗檢測。具體步驟按照廠家提供的操作說明書進行，染色情況用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照（100×，Olympus），細胞增殖能力采用EdU陽性染色細胞（紅色）占總細胞（藍色）的百分率表示。

1.5 Transwell實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力

實驗分組同上。藥物處理后的各組細胞用無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重，200 μL/孔接種于小室上層，600 μL含20%血清的完全培養(yǎng)基放置于小室下層，置于CO2培養(yǎng)箱中24 h，取出小室，用棉簽輕輕除去小室上層細胞，之后將小室放置于4%多聚甲醛中室溫固定細胞20 min，PBS洗滌后放入0.1%結(jié)晶紫中室溫染色30 min，PBS洗滌細胞1次后，用熒光倒置顯微鏡拍照。

1.6 RT-qPCR檢測HMGB1 mRNA的表達水平

藥物處理MGC-803細胞6 h后，提取胞內(nèi)總RNA，按照試劑盒說明書先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，之后進行qPCR檢測。熱擴增條件如下：首先95 ℃預(yù)變性3 min，然后進行循環(huán)擴增，95 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)。2-△△CT法進行結(jié)果分析。qPCR中所需的HMGB1和GAPDH上下游引物如表1。

表1 HMGB1和GAPDH引物序列Tab.1 Sequence of HMGB1and GAPDH primers

1.7 Western bolt 檢測蛋白表達

藥物處理后的MGC-803細胞，棄去細胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞后，加入含蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA細胞裂解液（碧云天），冰上孵育40 min充分裂解細胞。收集細胞裂解液，于12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，吸取上清液并進行總蛋白定量檢測（BCA法）。瘤體組織蛋白采用超聲破碎法提取。蛋白樣品中加入Loading buffer后置于金屬浴中煮沸10 min，取等量蛋白進行SDS-PAGE。電泳凝膠為4%的濃縮膠和10%的分離膠。電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上（PALL）。之后進行脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，一抗4℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗（CST）繼續(xù)室溫孵育2 h。加入化學(xué)發(fā)光液和底物孵育后，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行結(jié)果檢測。通過Image J對蛋白表達量進行分析。

1.8 裸鼠成瘤實驗

動物實驗獲得皖南醫(yī)學(xué)院實驗動物福利與倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：LLSC-2021-151），BALB/c-Nu公鼠，3周齡，隨機分為對照組和蘆薈苷組，5只/組。MGC-803細胞（2×106）/只皮下注射，進行裸鼠腋下成瘤實驗。待瘤體形成后，蘆薈苷50 mg/kg/d腹腔注射，對照組注射等量PBS。每日測量瘤體大小，和小鼠體質(zhì)量，瘤體大小表示方法：瘤體體積（cm3）=長×寬×寬/2。

1.9 HE檢測腫瘤轉(zhuǎn)移

裸鼠麻醉后取出瘤體、肝臟和肺臟，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚度的切片，然后進行H&E染色。Caseviewer2.4軟件觀察染色結(jié)果，并拍照。

1.10 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗；多組間比較使用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆薈苷顯著抑制胃癌細胞增殖

CCK-8結(jié)果表明，不同濃度蘆薈苷處理的MGC-803細胞，與對照組相比細胞活力明顯下降（P<0.01，圖1A）；組間比較顯示，蘆薈苷能夠濃度依賴性的抑制胃癌細胞存活（P<0.05，圖1A）。EdU檢測蘆薈苷作用后的MGC-803細胞，EdU陽性染色細胞所占比例明顯亦低于對照組（P<0.01，圖1B）。

圖1 蘆薈苷對胃癌細胞活力和增殖的影響。Fig. 1 Effect of aloin on gastric cancer cell viability and proliferation(Mean±SD,n=3).A:CCK-8 assay for detecting viability of gastric cancer cells with aloin treatment.B,C:Proliferation of aloin-treated gastric cancer cells detected using EdU assay(Original magnification:×100).#P<0.05 between groups;**P<0.01 vs 0 μg/mLgroup.

2.2 蘆薈苷抑制胃癌細胞遷移

Transwell實驗檢測蘆薈苷對胃癌細胞的遷移能力（圖2），蘆薈苷作用組與對照組相比，遷移至小室濾膜外表面的細胞數(shù)量顯著降低（P<0.01），不同濃度蘆薈苷處理組之間，細胞遷移數(shù)量隨蘆薈苷濃度的增加而減少（P<0.01）。

圖2 蘆薈苷對胃癌細胞遷移的影響Fig. 2 Effects of aloin on gastric cancer cell migration assessed using Transwell assay (×100; Mean±SD, n=3).**P<0.01 vs 0 μg/mLgroup.

2.3 蘆薈苷降低Cyclns和MMPs，增強E-cadherin的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，蘆薈苷處理后的胃癌細胞，周期蛋白Cyclin B1和E1及基質(zhì)金屬酶MMP-2和9的表達水平顯著降低（P?0.05 或P?0.01），且下降程度表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。然而，與對照組相比，蘆薈苷處理組細胞中，上皮細胞標(biāo)志蛋白Ecadherin的表達卻顯著增強（P?0.01，圖3）。

圖3 蘆薈苷Cyclins，MMPs和E-cadherin表達的影響Fig. 3 Effects of aloin on expression levels of Cyclins,MMPs and E-cadherin detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μg/mLgroup.

2.4 蘆薈苷下調(diào)HMGB1的表達

不同濃度的蘆薈苷作用MGC-803細胞6 h后，蘆薈苷處理組與對照組相比，HMGB1 mRNA的水平明顯降低（P?0.05 或P?0.01），且蘆薈苷對其抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性（P?0.05，圖4）。Western blot結(jié)果顯示，蘆薈苷處理24 h后，HMGB1蛋白的表達水平明顯低于對照組（P?0.05 或P?0.01），尤其以200和300 μg/mL蘆薈苷的抑制作用最為顯著（P?0.01）。

圖4 蘆薈苷對HMGB1表達的影響Fig. 4 Effect of aloin on the expression levels of HMGB1(Mean±SD,n=3).A:HMGB1 mRNA expression detected by RT-qPCR(#P<0.05 between groups,**P<0.01 vs 0 μg/mL group).B,C:HMGB1 protein expression detected by Western blotting(*P<0.05,**P<0.01 vs control;##P<0.01 between groups).

2.5 蘆薈苷抑制p-STAT3的表達

蘆薈苷刺激MGC-803細胞6 h后，Western blot檢測STAT3磷酸化水平顯示，與對照組相比，蘆薈苷處理組，p-STAT3的水平均明顯下降（P?0.05或P?0.01），且下降程度隨蘆薈苷濃度的增加而增強（P?0.05）。然而，蘆薈苷對總STAT3并無明顯抑制作用（圖5）。

圖5 蘆薈苷對p-STAT3的影響Fig. 5 Effects of aloin on the expression level of p-STAT3 and STAT3 detected by Western blotting(Mean±SD,n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs 0 μg/mL group;#P<0.05,##P<0.01 between groups.

2.6 JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測STAT3與HMGB1啟動子的結(jié)合

預(yù)測結(jié)果顯示，STAT3能夠與HMGB1啟動子區(qū)1313～1323 結(jié)合，預(yù)測結(jié)合序列為CTCCTTGGAAA，相對結(jié)合分數(shù)約為92.57%（圖6）。

圖6 JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測STAT3與HMGB1啟動子的結(jié)合Fig. 6 Binding of STAT3 with the promoter of HMGB1.A: Structure of STAT3 molecule. B: Sequence logo of STAT3. C:Binding information of STAT3 and HMGB1 promoter.

2.7 在體實驗檢測蘆薈苷對胃癌增殖和遷移的抑制作用

2.7.1 蘆薈苷抑制腫瘤的增殖 與對照組相比，蘆薈苷處理組瘤體明顯縮小（P?0.01），腫瘤質(zhì)量亦顯著減輕（P?0.001），但并不影響裸鼠的體質(zhì)量（圖7）。

圖7 蘆薈苷對裸鼠瘤體和體質(zhì)量的影響Fig. 7 Effects of aloin on tumor and body weight in the tumor-bearing mice(Mean±SD,n=5).A:Observation of the tumor-bearing mice. B: Tumor size changes in aloin-treated and control groups. C: Comparison of tumor weight between the two groups.D:Changes in body weight in the two groups.**P<0.01;***P<0.001 vs 0 μg/mLgroup.

2.7.2 蘆薈苷對胃癌肝、肺轉(zhuǎn)移的影響 HE染色結(jié)果顯示，蘆薈苷處理組與對照組小鼠均成功植瘤。肝、肺組織HE 結(jié)果顯示，和對照組相比，蘆薈苷處理組并未呈現(xiàn)明顯毒性作用。而且，無論是對照組還是蘆薈苷處理組，肝、肺組織HE 染色均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞（圖8）。

圖8 蘆薈苷對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的影響Fig. 8 Effect of aloin on metastasis of gastric cancer cells in the tumor-bearing mice(×200).

2.7.3 蘆薈苷降低瘤體組織中Cyclins、MMPs、HMGB1和p-STAT3，增強E-cadherin的表達水平 蘆薈苷處理的小鼠，瘤體組織中CyclinB1，E1，MMP-2，9，p-STAT3和HMGB1的表達水平與對照組相比均明顯降低（P?0.05或P?0.01），而E-cadherin的表達水平則顯著高于對照組（P?0.01，圖9）。該實驗結(jié)果與細胞水平檢測一致。

圖9 蘆薈苷對瘤體組織蛋白表達的影響Fig. 9 Effects of aloin(ALO)on protein levels in the tumor tissue in the tumor-bearing mice(Mean±SD,n=3).*P<0.05;**P<0.001 vs 0 μg/mL group.

3 討論

胃癌患者由于缺乏早期診斷指標(biāo)，一旦發(fā)現(xiàn)多為中晚期，導(dǎo)致大多患者預(yù)后較差［16］。因此，探尋胃癌早期診斷生物靶標(biāo)，將為臨床胃癌患者的治療帶來福音。HMGB1在多種類型的腫瘤中高表達，且與腫瘤的增殖、遷移、凋亡、化療抵抗等密切相關(guān)［17］，以HMGB1為靶點將是臨床腫瘤治療的可行策略［18］。有研究表明，蘆薈苷能夠抑制HMGB1的表達，促進人黑色素瘤細胞的凋亡［19］。我們之前的研究已經(jīng)證明，蘆薈苷通過下調(diào)乳酸誘導(dǎo)的HMGB1的表達和釋放，抑制乳酸誘導(dǎo)的胃癌細胞增殖和遷移［20］。然而，該研究僅僅局限在細胞水平，不僅沒有探究蘆薈苷單獨處理對胃癌細胞增殖和遷移的影響，也沒有揭示蘆薈苷下調(diào)HMGB1表達的可能分子機理。通過本研究，我們在細胞和動物水平證明了蘆薈苷對胃癌細胞增殖和遷移的抑制作用，也初步探明了蘆薈苷抑制HMGB1表達的分子機理。

本研究首先在細胞水平，通過CCK-8，EdU 和Transwell實驗進一步證明了蘆薈苷對胃癌MGC-803增殖和遷移的抑制作用。實驗結(jié)果表明，蘆薈苷能夠濃度依賴性的抑制胃癌細胞的增殖和遷移，該結(jié)果與蘆薈苷對其他胃癌細胞如HGC-27和BGC-823的影響作用一致［15］。在肝癌研究中，也有報道顯示，蘆薈苷可通過不同的分子機制抑制肝癌的增殖和遷移［10,21］。上述研究均有力支持蘆薈苷對腫瘤惡性進展的抑制作用。

細胞周期的異常激活基本上見于所有的腫瘤類型，并被認為是腫瘤形成的驅(qū)動因素，周期蛋白參與調(diào)節(jié)了多種重要的細胞功能，以周期蛋白及其依賴性的蛋白激酶為靶點，是腫瘤治療的有效策略［22］。在許多人類腫瘤中Cyclin E和Cyclin B均異常高表達，并與腫瘤的侵襲和不良預(yù)后有關(guān)［23-25］。為探究蘆薈苷抑制胃癌細胞增殖的分子機制，我們檢測了蘆薈苷對Cyclin B1和E1的影響。WB結(jié)果顯示，蘆薈苷能夠有效降低它們的表達，且300 μg/mL組抑制作用最為顯著。上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細胞獲得間充質(zhì)特征的過程。在腫瘤中，EMT與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療抵抗等密切相關(guān)［26］，而E-cadherin作為上皮細胞的標(biāo)志蛋白，其表達水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)負相關(guān)。已有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤侵襲、新生血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是癌癥治療的理想藥理學(xué)靶點［27,28］。為探究蘆薈苷抑制胃癌細胞遷移的分子機理，我們對胃癌細胞中Ecadherin，MMP-2和9的表達水平進行了檢測。WB結(jié)果顯示，蘆薈苷可濃度依賴性的抑制MMP-2和9的表達，增強E-cadherin的表達。上述結(jié)果意味著，蘆薈苷可通過下調(diào)周期蛋白的表達，抑制胃癌細胞增殖；經(jīng)抑制EMT及MMPs的表達，阻止胃癌細胞遷移。

我們已有的研究表明，HMGB1 能夠調(diào)控胃癌HGC-27細胞中Cyclins和MMPs的表達以及EMT［7］。本實驗的研究結(jié)果，同樣也支持蘆薈苷通過抑制Cyclins，MMPs的表達和EMT，抑制胃癌的增殖和遷移的結(jié)論。鑒于上述研究，蘆薈苷可能通過調(diào)控HMGB1的表達，進而發(fā)揮上述生物學(xué)作用。

為進一步驗證蘆薈苷對MGC-803細胞中HMGB1表達的影響。WB和RT-qPCR實驗均證明，蘆薈苷能夠在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平抑制HMGB1的表達。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是一種細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、血管生成、炎癥和免疫反應(yīng)。STAT3的異常激活與腫瘤的惡性進展相關(guān)，抑制STAT3的活化已經(jīng)成為癌癥治療的重要靶點［29,30］。

為探尋蘆薈苷在轉(zhuǎn)錄水平抑制HMGB1表達的分子機制，我們檢測了轉(zhuǎn)錄因子STAT3的磷酸化。結(jié)果顯示，蘆薈苷可濃度依賴性的抑制STAT3 的磷酸化。STAT3能否與HMGB1的啟動子結(jié)合，進而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄呢？通過JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測了STAT3與HMGB1啟動子的結(jié)合，預(yù)測結(jié)果顯示STAT3可與HMGB1正義鏈的啟動子序列結(jié)合，相對結(jié)合分數(shù)為0.925?？傊ㄟ^細胞水平的研究，我們的實驗結(jié)果顯示，蘆薈苷可通過STAT3信號途徑下調(diào)HMGB1的表達，進而抑制胃癌細胞的增殖和遷移。

蘆薈苷處理組，小鼠瘤體大小和瘤體質(zhì)量均明顯低于對照組。瘤體組織蛋白檢測顯示，蘆薈苷組，Cyclin E1，Cyclin B1，MMP-2，MMP-9，p-STAT3和HMGB1的表達均顯著低于對照組；而E-cadherin的表達則明顯。在體實驗獲得了和細胞水平檢測一致的實驗結(jié)論。小鼠體質(zhì)量檢測和肝肺組織H&E染色結(jié)果均表明，蘆薈苷對小鼠并無明顯的毒性作用。另外，H&E染色亦表明，肝肺組織中并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞。雖然瘤體組織蛋白WB檢測證明蘆薈苷能夠抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，但肝肺組織經(jīng)HE染色并無發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。我們猜測可能的原因是，在體成瘤時間性對較短，腫瘤細胞尚未轉(zhuǎn)移至肝肺組織。

綜上所述，體內(nèi)外研究均表明，蘆薈苷能夠通過STAT3-HMGB1 信號途徑抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究不僅揭示了蘆薈苷抗腫瘤作用新機制，亦為靶向HMGB1的抗腫瘤研究提供了實驗依據(jù)。